Este trabalho é apoiado pelo Escritório Estado de Nova York da Ciência, Tecnologia e Pesquisa Acadêmica (NYSTAR) (na forma de um Centro de Tecnologia Avançada de subvenção) e por concessões do Centro de Nanobiotecnologia (NBTC), um Programa Nacional da STC Science Foundation no âmbito do Acordo No. ECS-9876771, e da Associação Americana Tumor Cerebral e do New York Academy of Medicine (JAB).

Procedimento Slides de revestimento com fibronectina Antes da montagem do dispositivo micro, esterilizar as lâminas de vidro com fibronectina. Pelagem os slides em uma biohood para manter a esterilidade. Alinhar um espaçador PDMS estéril ao longo das bordas do slide e marcar o lado que está virado para cima com um marcador permanente. Pipetar 1 ml de solução a 5 mg / ml de fibronectina (Sigma) no interior do espaçador PDMS sobre a totalidade da lâmina de vidro. Deixe os slides sem ser perturbado por uma hora, em seguida, secar completamente usando uma arma de N 2. Os slides podem ser armazenados a 4 o C para os experimentos posteriores. A montagem do dispositivo O protocolo conjunto inteiro dispositivo é feito de uma biohood em condições estéreis, utilizando os seguintes procedimentos: <ol><li> Limpe o mestre de silício com os microcanais estampados nele, limpando-a com álcool 70% e secagem com o 2 N arma. Coloque um espaçador PDMS estéril de 1 mm de altura usando uma pinça em torno do alívio características do mestre. </li><li> Prepare o gel agarose utilizada no dispositivo, pesando 0,3 g de agarose em pó (Fisher Scientific) e 10 ml de CO 2 de mídia independente (Invitrogen) num copo de 50 ml. Agitar a mistura com uma espátula e aquecer no microondas por 20 segundos na potência alta. Se não dissolvido grânulos estão presentes, aquecer a mistura por mais 10 segundos e agite a mistura quente para se livrar dos grânulos últimos remanescentes. Repita o processo com um tempo de aquecimento de 8 segundos, e depois de 5 segundos. </li><li> Rapidamente despeje a solução de agarose para o mestre de silício cercado por o espaçador PDMS e cobrir imediatamente a mistura agarose com uma lâmina de vidro estéril. Aplicar uma pressão constante e suave para o slide para cerca de 2 minutos para garantir que o gel agarose vai à mm de altura mesma constante 1 como o espaçador PDMS. </li><li> Depois que o gel de agarose, retire o padrão agarose gel com o espaçador PDMS do mestre de silício e transferir para uma lâmina de vidro revestidas com fibronectina os microcanais do gel de agarose de frente para o slide. Use uma seringa de calibre 16 para fazer furos nas regiões reservatório da microcanais para entrada e saída de acessos. Adicionar 500 mL de CO 2 independente de mídia para o gel agarose padrão no slide para prevenir o dessecamento da microcanais. </li><li> Lavar o colector de acrílico utilizada no dispositivo com etanol 70% e enxágüe com água DI. Alinhe os orifícios no colector com o furos no gel de agarose com os microcanais. Então, alinhar o bloco com o gel, espaçador PDMS, eo slide fibronectina com a estrutura metálica do dispositivo. Coloque os parafusos em dispositivo e aperte o ponto de resistência usando uma chave de fenda. Isto é feito para garantir que o dispositivo não é mais apertada ao ponto de deformar os microcanais na agarose. Aperte os parafusos no sentido horário para garantir que o gel dentro do dispositivo não se desloque. Testar o dispositivo de vazamentos e entupimentos nos microcanais com uma seringa de 1ml. A seringa é equipado com tubos de Tygon com uma ponteira gel de carga no final da tubulação para injetar CO 2 independente de mídia na microcanais. A microcanais é considerado formado com êxito quando a mídia é observada a única saída da tomada do microcanal quando a mídia é injetado na entrada correspondente. Agora, o dispositivo está pronto para uso. </li></ol> Preparar e propagação das células no dispositivo Quando as células chegar a 70% (densidade celular cerca de 100.000 células / ml) confluência, eles estão preparados para ser semeado no dispositivo. Assunto das células a dois DPBS (Invitrogen) lavagens. Adicionar 200 mL de tripsina-EDTA (Invitrogen) para destacar as células. Transferência das células para um tubo de centrifugação de 15 ml contendo 5 ml de mídia M2 contendo soro para inativar a tripsina. Centrifugadas a mídia de crescimento com as células a 1000 RPM por 5 minutos. Aspirado fora o sobrenadante e ressuspender o sedimento de células 5 ml de DPBS. Centrifugar as células DPBS novamente sob as mesmas condições. Aspirado fora o sobrenadante novamente, e ressuspender o sedimento de células em 500 mL de CO 2 de mídia independente. Semente a suspensão resultante de células para o centro de microcanais do dispositivo através da gravidade-driven fluir. Adicione a entrada e saída do centro de microcanais com 60 mL da suspensão de células e 20 l de CO 2 a médio-independente, respectivamente. Observar o centro de microcanais sob um microscópio de campo claro de olhar para adesão celular. As células aderem geralmente após 10 minutos. Depois que as células aderem ao fundo do canal com uma densidade adequada, pipeted a suspensão de células restantes na entrada e os meios de comunicação na tomada. ML lugar 60 de CO 2 em ambos os meios de comunicação independentes de entrada e saída do canal central. Lugar PDMS cobre mais de the de entrada e saída de centro para minimizar a evaporação de mídia do canal central. Imagem das células no dispositivo Antes da montagem do dispositivo, rosca do tubo estéril peristáltica através da estação meteorológica do microscópio (Olympus X81) e se conectar com a bomba peristáltica (Watson-Marlow 205U/CA). Lave PBS através do tubo a uma taxa de 4 RPM. Após a montagem do dispositivo, prepare concentrações adequadas de fator de crescimento epidérmico (EGF) (Sigma) soluções no CO 2-de mídia independente em tubos de centrífuga de 15 ml. Vortex as soluções EGF por 5 segundos e se conectar com o tubo. Conecte o tubulações marcados com concentrações EGF correspondente ao dispositivo. Demora cerca de uma hora para o EGF para difundir todo o cume e estabelecer um canal de gradiente químico estável. Um software de imagem, Slidebook, é usada para tomar um conjunto de imagens a cada 10 minutos para cerca de 5 horas em uma corrida experimental. O estágio xy automatizado é programado de tal forma que duas sub-áreas (cada uma com uma área de 400 micras de x400μm) do canal de mesmo centro, e um total de três canais centro são gravadas em um ponto determinado momento. Células em diferentes canais de centro (tipicamente 3 em uma corrida) tem concentrações diferentes EGF, conforme marcado na tubulação. Materiais e Equipamentos Linhagens de células: as células são C17.2 NSCs derivadas da camada externa germinal do cerebelo do rato pós-natal 6, 7. Usando esta linha de células, nós desenvolvemos outras duas linhas-tronco de camundongos células usando o método de transfecção retrovírus. Estas duas linhas de células transfectadas estavelmente são (1) wtEGFR - que mais expressa o EGFR-tipo humano selvagem, e (2) ΔEGFR - que é um mutante EGFR constitutivamente ativo. Para facilitar a detecção, os retrovírus levar um backbone com o gene de interesse seguido por um site interno para a ligação ribossomal (IRES) e da proteína verde fluorescente (GFP). Cultura de células: O rato C17.2 NSCs e suas variantes foram cultivadas em uma placa de seis poços em M2 media (DMEM (Invitrogen) com 10% de soro fetal bovino (FBS) (Invitrogen), 5% soro de cavalo (HS) (Invitrogen ), e 1% de penicilina / estreptomicina (Invitrogen).) As células foram mantidas a 37 º C no ar de 80% e 5% CO 2. Dispositivo micro: Um colector de plástico, um espaçador PDMS, e um quadro de inox para prender o dispositivo no lugar. Imagem Um microscópio invertido fluorescente (Olympus IX-81) é usado, em conexão com um CCD intensificada câmera (Orca, Hamamatsu). O dispositivo micro é montado em um palco xyz automatizados, eo palco está cercada por uma câmara de ambiente que mantém uma temperatura de 37 º C. Normalmente existem dispositivos de 04/03 no mesmo chip que será filmado no ponto mesmo tempo, utilizando o palco xyz automatizado. Manter o fluxo A bomba peristáltica com 8 linhas paralelas (Watson-Marlow 205U/CA) auto é usado para manter os fluxos em todos os canais de pia e fonte. <img src="/files/ftp_upload/old/674_2008_9_29_6/674_Figure-01.jpg" alt="Figura 1" width="573" height="414" /> Fig. Motilidade uma de três cepas NSC (parental, wtEGFR e D EGFR) em concentrações EGF vários Todas as trajetórias são tomadas a partir de rastreamento de um filme de 5 horas (exceto para wtEGF 100ng/ml, quatro horas), ea origem de todas as faixas foram reposicionado em (0,0) para fins de comparação. <img src="/files/ftp_upload/old/674_2008_9_29_7/674_Figure-02.jpg" alt="Figura 2" width="576" height="546" /> Fig. 2 Correlação de EGFR nível de expressão e de motilidade (a) duas imagens de NSCs wtEGF na superfície de um canal microfluídicos com 100ng/ml EGF. A imagem da esquerda é uma imagem fluorescente, eo direito é uma imagem transmitida campo brilhante. A barra de escala é 100μm, e os Largura do canal é 400 m. As células são separadas em duas populações pelo brilho da GFP expressa. Células nos círculos azuis são dimmer, portanto, têm menos nível de expressão do EGFR, e as células em círculos vermelhos são brigher, portanto, têm maior nível de expressão de EGFR. (B) Trajetórias de células com nível baixo e alto EGFR expressão. Essas trajetórias são tiradas de um filme de quatro horas de duração.

<ol>
	<li>Blow, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidics:+in+search+of+a+killer+application.">Microfluidics: in search of a killer application.</a> Nature Methods. 4, 665-670 (2007).</li><li>Shing-Yi Cheng, S. H., Wassweman, M. a. x., Archer, S. h. i. v. a. u. n., Shuler, M. i. c. h. a. e. l. . L., Wu, M. i. n. g. m. i. n. g. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+hydrogel-based+microfluidic+device+for+the+studies+of+directed+cell+migration.">A hydrogel-based microfluidic device for the studies of directed cell migration.</a> Lab-on-a-chip. 7, 763-769 (2007).</li><li>Pedersen, M. W., Tkach, V., Pedersen, N., Berezin, V., Poulsen, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+a+naturally+occurring+constitutively+active+variant+of+the+epidermal+growth+factor+receptor+in+mouse+fibroblasts+increases+motility.">Expression of a naturally occurring constitutively active variant of the epidermal growth factor receptor in mouse fibroblasts increases motility.</a> Int J Cancer. 108, 643-653 (2004).</li><li>Ayuso-Sacido, A., Graham, C., Greenfield, J. P., Boockvar, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+duality+of+EGFR+signaling+and+neural+stem+cell+phenotype:+Cell+enhancer+or+cell+transformer.">The duality of EGFR signaling and neural stem cell phenotype: Cell enhancer or cell transformer.</a> Current Stem Cell Research and Therapy. 1, 231-238 (2006).</li><li>Eisenbach, M., Constantinou, C., Aloni, H., Shinitzky, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repellents+for+Escherichia+coli+operate+neither+by+changing+membrane+fluidity+nor+by+being+sensed+by+periplasmic+receptors+during+chemotaxis.">Repellents for Escherichia coli operate neither by changing membrane fluidity nor by being sensed by periplasmic receptors during chemotaxis.</a> J Bacteriol. 172, 5218-5224 (1990).</li><li>Snyder, E. Y., Deitcher, D. L., Walsh, C., Arnold-Aldea, S., Hartwieg, E. A., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multipotent+neural+cell+lines+can+engraft+and+participate+in+development+of+mouse+cerebellum.">Multipotent neural cell lines can engraft and participate in development of mouse cerebellum.</a> Cell. 68, 33-51 (1992).</li><li>Snyder, E. Y., Yoon, C., Flax, J. D., Macklis, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multipotent+neural+precursors+can+differentiate+toward+replacement+of+neurons+undergoing+targeted+apoptotic+degeneration+in+adult+mouse+neocortex.">Multipotent neural precursors can differentiate toward replacement of neurons undergoing targeted apoptotic degeneration in adult mouse neocortex.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 94, 11663-11668 (1997).</li></ol>

Fig. 1 mostra as trajetórias de três cepas NSC, as células dos pais, o wtEGFR eo ΔEGFR (controle). Cada conjunto de trajetórias foram obtidos a partir de um filme de cinco horas de comprimento. Para as células dos pais, motilidade celular pico quando a concentração de EGF foi ~ 10ng/ml; para células wtEGFR, pico motilidade celular mudou para 100ng/ml ou acima; para células ΔEGFR, a motilidade celular foi independente da concentração de EGF como esperado. As células wtEGF com 100ng/ml foram as células mais móveis, eles se mudaram cerca de 1,5 vezes mais rápido que as células dos pais com 10ng/ml. Isso indica que (1) sobre a expressão de EGFR amplia a motilidade células, (2) o número de eventos EGF ligante-receptor biding tem um impacto direto sobre a motilidade celular. ΔEGFR linha celular é um mutante EGFR constitutivamente ativo. Este mutante aparece em ~ 60% de glioblastoma humano. Ele tem um domínio extracelular truncada que se torna um constitutiva quinase ligante-independente ativo. A intensidade da autofosforilação é pequeno (aproximadamente 10%) em comparação com ligante activado tipo selvagem EGFR (wtEGFR) 4. O que reforça a observação de que células ΔEGF têm motilidade ligeiramente superior à dos pais e wtEGFR (na ausência de EGF), mas a motilidade é mantida uma constante em concentrações diferentes EGF. Uma vez que as células wtEGFR realizado mesmas cópias de GFP (proteína fluorescente verde) e EGFR, a intensidade de fluorescência das células wtEGFR revelar os níveis de expressão do EGFR. Isso nos permite correlacionar diretamente a expressão da proteína EGFR nível (intensidade fluorescente verde) com a motilidade celular. Fig. 2 mostra as trajetórias de dois população de células, as células do círculo vermelho são mais brilhantes, portanto, tem maior nível de expressão do EGFR, e as células em círculo azul estão o jantar, portanto, tem menor nível de expressão de EGFR. Os resultados mais uma vez demonstram que quanto maior o nível de expressão do EGFR, mais móveis estas células são. Tradicionalmente, a motilidade do NSCs foi determinado utilizando um ensaio de câmara de Boyden, onde a porcentagem de células migram através de uma membrana é avaliado 5. Este é um ensaio de base populacional, onde o comportamento das células não pode ser avaliado individualmente. O dispositivo micro mostrado aqui representa uma oportunidade para estudar o movimento das células em um nível única célula, e em um ambiente químico bem controlada. Ela permite que um, pela primeira vez, para correlacionar diretamente o nível de expressão da proteína EGFR com o fenótipo NSCs motilidade em células vivas. O pequeno tamanho do dispositivo é especialmente útil para experimentos onde as fontes de células são limitados, tais como as células-tronco humanas.

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		<div>
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		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) (1X)</td>
<td>Reagent</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>11971-025</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>CO2-independent media</td>
<td>Reagent</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>18045-088</td>
<td>A non-HEPES proprietary medium suitable for supporting cell growth for a variety of epithelial, fibroblast, and lymphoid cell lines in atmospheric conditions, contains no L-glutamine</td>
</tr>
<tr>
<td>Trypsin-EDTA</td>
<td>Reagent</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>25200-072</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PBS</td>
<td>Reagent</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>14190-144</td>
<td>Phosphate-buffered saline, without calcium or magnesium</td>
</tr>
<tr>
<td>Pen/Strep</td>
<td>Reagent</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>15140-122</td>
<td>Contains 10,000 units of penicillin (base) and 10,000 g of streptomycin (base)/ml utilizing penicillin G (sodium salt) and streptomycin sulfate in 0.85% saline</td>
</tr>
<tr>
<td>FBS</td>
<td>Reagent</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>10437-028</td>
<td>Fetal Bovine Serum, Qualified</td>
</tr>
<tr>
<td>Horse Serum</td>
<td>Reagent</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>16050-130</td>
<td>Horse Serum, EIA tested (negative) serum</td>
</tr>
<tr>
<td>Fibronectin</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>F0895</td>
<td>Fibronectin from human plasma, also called cold insoluble globulin</td>
</tr>
<tr>
<td>EGF</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>E4127</td>
<td>Epidermal Growth Factor from murine submaxillary gland, lyophilized</td>
</tr>
<tr>
<td>Agarose</td>
<td>Reagent</td>
<td>FisherScientific</td>
<td>BP1356-500</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

assessing neural stem cell motility using an agarose gel-based microfluidic device

Embora a tecnologia microfluídica está chegando a um novo nível de maturidade para ensaios macromolecular, baseada em células ensaios estão ainda numa fase infantil 1. Isto é principalmente devido à dificuldade com que se pode criar um microambiente celular compatível e estável utilizando técnicas de microfabricação e materiais convencionais. Nós resolvemos este problema através da introdução de um material de microfabricação romance, agarose gel, como o material de base para o dispositivo microfluídicos. Agarose gel é altamente maleável e permeável a gás e nutrientes necessários para a sobrevivência da célula e, assim, um material ideal para celulares baseado em ensaios. Nós temos mostrado previamente que os dispositivos de agarose gel a base tem sido bem sucedida no estudo da migração de células de bactérias e neutrófilos 2. Neste relatório, três paralelas canais microfluídicos são padronizados em uma membrana de gel de agarose de cerca de 1 milímetro de espessura. Fluxos constantes com a mídia / buffer são mantidos nos dois canais laterais utilizando uma bomba peristáltica. As células são mantidas no canal central para a observação. Uma vez que os nutrientes e produtos químicos nos canais laterais estão constantemente difusão a partir do lado do centro do canal, o ambiente químico do canal central é facilmente controlado através do fluxo ao longo dos canais laterais. Usando este dispositivo, demonstramos que o movimento de células-tronco neurais pode ser monitorada visualmente com facilidade sob condições químicas diferentes, e os resultados experimentais mostram que a expressão de receptores de mais de fator de crescimento epidérmico (EGFR) aumenta a motilidade das células-tronco neurais. Motilidade das células-tronco neurais é um importante biomarcador para avaliar a agressividade das células, portanto, fator de tumorigénico 3. Decifrar o mecanismo subjacente a motilidade NSC trará insights sobre ambos os transtornos do desenvolvimento neural e no cérebro de invasão de células-tronco cancerosas.

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Assessing Neural Stem Cell Motility Using an Agarose Gel-based Microfluidic Device

Nós demonstramos que a expressão de receptores de mais de fator de crescimento epidérmico (EGFR) aumenta a motilidade das células-tronco neurais (NSCs) usando um romance agarose gel com base em dispositivo microfluídicos. Esta tecnologia pode ser facilmente adaptável a outros sistemas de células de mamíferos, onde fontes de células são escassos, como células-tronco neurais, ea volta em torno do tempo é crítica.

Avaliar motilidade celular Neural Stem Usando um dispositivo Agarose Gel baseado microfluídicos

While microfluidic technology is reaching a new level of maturity for macromolecular assays, cell-based assays are still at an infant stage1. This is ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

11.6K visualizações.  Cornell University. Nós demonstramos que a expressão de receptores de mais de fator de crescimento epidérmico (EGFR) aumenta a motilidade das células-tronco neurais (NSCs) usando um romance agarose gel com base em dispositivo microfluídicos. Esta tecnologia pode ser facilmente adaptável a outros sistemas de células de mamíferos, onde fontes de células são escassos, como células-tronco neurais, ea volta em torno do tempo é crítica.

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Culture of Mouse Neural Stem Cell Precursors

Primary neural stem cell cultures are useful for studying the mechanisms underlying central nervous system development. Stem cell research will increase our understanding of the nervous system and may allow us to develop treatments for currently incurable brain diseases and injuries. In addition, stem cells should be used for stem cell research aimed at the detailed study of mechanisms of neural differentiation and transdifferentiation and the genetic and environmental signals that direct the specialization of the cells into particular cell types.  This video demonstrates a technique used to disaggregate cells from the embryonic day 12.5 mouse dorsal forebrain. The dissection procedure includes harvesting E12.5 mouse embryos from the uterus, removing the "skin" with fine dissecting forceps and finally isolating pieces of cerebral cortex. Following the dissection, the tissue is digested and mechanically dissociated. The resuspended dissociated cells are then cultured in "stem cell" media that favors growth of neural stem cells.

This video describes the method used for isolation of neuroprecursors from the developing cortex of embryonic mice. The procedure for removing embryos from the uterus, dissecting the cortical tissue, and digesting the isolated cerebral cortex is shown.

Cultura de rato precursores das células-tronco neurais

Primary neural stem cell cultures are useful for studying the mechanisms underlying central nervous system development. Stem cell research will increase ...

Biologia

Fabrication of a Microfluidic Device for the Compartmentalization of Neuron Soma and Axons

In this video, we demonstrate the technique of soft lithography with polydimethyl siloxane (PDMS) which we use to fabricate a microfluidic device for culturing neurons. Previously, a silicon wafer was patterned with the design for the neuron microfluidic device using SU-8 and photolithography to create a master mold, or what we simply refer to as a "master". Next, we pour the silicon polymer PDMS on top of the master which is then cured by heating the PDMS to 80&deg;C for 1 hour. The PDMS forms a negative mold of the device. The PDMS is then carefully cut and lifted away from the master. Holes are punched where the reservoirs will be and the excess PDMS trimmed away from the device. Nitrogen is used to blow away any excess debris from the device. At this point the devices are now ready for use and can either bonded to corning No. 1 cover glass with a plasma sterilizer/cleaner or can be reversibly bound to the cover glass by simply placing the device on top of the cover glass. The reversible bonding of the device to glass is covered in a separate video and requires first that the device be sterilized either with 70% ethanol or by autoclaving. Plasma treating sterilizes the devices so no further treatment is necessary. It is, however, important, when plasma-treating the devices, to add liquid to the devices within 10 minutes of the plasma treatment while the surfaces are still hydrophilic. Waiting longer than 10 minutes to add liquid to the device makes it difficult for the liquid to enter the device. The neuron devices are typically plasma-bound to cover glass and 0.5 mg/ml poly-L-lysine (PLL) in pH 8.5 borate buffer is immediately added to the device. After a minimum of 3 hours incubating with PLL, the devices are washed with dH2O water a minimum of 3 times with at least 15 minutes between each wash. Next, the water is removed and fresh media is added to the device. At this point the device is ready for use. It is important to remember at this point to never remove all the media from the device. Always leave media in the main channel.

In this video we demonstrate the technique of soft lithography with polydimethyl siloxane (PDMS) which we use to farbricate a microfluidic device for culturing neurons.

Fabricação de um dispositivo micro para a compartimentação de Neuron Soma e axônios

In this video, we demonstrate the technique of soft lithography with polydimethyl siloxane (PDMS) which we use to fabricate a microfluidic device for ...

Counting Human Neural Stem Cells

Knowledge of the exact number of viable cells in a given volume of a cell suspension is required for many routine tissue culture manipulations, such as plating cells for immunocytochemistry or for cell transfections. This protocol describes a straightforward and fast method for differentiating between live and dead cells and quantifying the cell concentration and total cell number using a hemacytometer. This procedure first requires detaching cells from a growth surface and resuspending them in media. Next, the cells are diluted in a solution of Trypan blue (ideally to a concentration that will give 20-50 cells per quadrant) and placed in the hemacytometer. Finally, averaging the counts of viable cells in several randomly selected quadrants, dividing the average by the volume of one 1 mm2 quadrant (0.1 &mu;l) and multiplying by the dilution factor gives the number of cells per l. Multiplying this cell concentration by the total volume in &mu;l gives the total cell number. This protocol describes counting human neural stem/precursor cells (hNSPCs), but can also be used for many other cell types.

Knowledge of the exact number of viable cells is required for many tissue culture manipulations. This protocol describes how to differentiate between live and dead cells and quantify cells using a hemacytometer. Although it describes counting human neural stem/precursor cells (hNSPCs), it can be used for other cell types.

Contando células-tronco neurais

Knowledge of the exact number of viable cells in a given volume of a cell suspension is required for many routine tissue culture manipulations, such as ...

A Gradient-generating Microfluidic Device for Cell Biology

 The fabrication and operation of a gradient-generating microfluidic device for studying cellular behavior is described.  A microfluidic platform is an enabling experimental tool, because it can precisely manipulate fluid flows, enable high-throughput experiments, and generate stable soluble concentration gradients.  Compared to conventional gradient generators, poly(dimethylsiloxane) (PDMS)-based  microfluidic devices can generate stable concentration gradients of growth factors with well-defined profiles.  Here, we developed simple gradient-generating microfluidic devices with three separate inlets.  Three microchannels combined into one microchannel to generate concentration gradients.  The stability and shape of growth factor gradients were confirmed by fluorescein isothyiocyanate (FITC)-dextran with a molecular weight similar to epidermal growth factor (EGF).  Using this microfluidic device, we demonstrated that fibroblasts exposed to concentration gradients of EGF migrated toward higher concentrations.  The directional orientation of cell migration and motility of migrating cells were quantitatively assessed by cell tracking analysis.  Thus, this gradient-generating microfluidic device might be useful for studying and analyzing the behavior of migrating cells.

We describe a protocol for the microfabrication of the gradient-generating microfluidic device that can generate spatial and temporal gradients in well-defined microenvironment. In this approach, the gradient-generating microfluidic device can be used to study directed cell migration, embryogenesis, wound healing, and cancer metastasis.

Um dispositivo de geração de Gradient microfluídicos de Biologia Celular

 The fabrication and operation of a gradient-generating microfluidic device for studying cellular behavior is described.  A microfluidic platform is an ...

Preparing E18 Cortical Rat Neurons for Compartmentalization in a Microfluidic Device

In this video, we demonstrate the preparation of E18 cortical rat neurons. E18 cortical rat neurons are obtained from E18 fetal rat cortex previously dissected and prepared. The E18 cortex is, upon dissection, immediately dissociated into individual neurons. It is possible to store E18 cortex in Hibernate E buffer containing B27 at 4&deg;C for up to a week before the dissociation is performed. However, there will be a drop in cell viability. Typically we obtain our E18 Cortex fresh. It is transported to the lab in ice cold Calcium free Magnesium free dissection buffer (CMFM). Upon arrival, trypsin is added to the cortex to a final concentration of 0.125%. The cortex is then incubated at 37&deg;C for 8 minutes. DMEM containing 10% FBS is added to the cortex to stop the reaction. The cortex is then centrifuged at 2500 rpm for 2 minutes. The supernatant is removed and 2 ml of Neural Basal Media (NBM) containing 2% B27 (vol/vol) and 0.25% Glutamax (vol/vol) is added to the cortex which is then re-suspended by pipetting up and down. Next, the cortex is triturated with previously fire polished glass pipettes, each with a successive smaller opening. After triturating, the cortex is once again centrifuged at 2500 rpm for 2 minutes. The supernatant is then removed and the cortex pellet re-suspended with 2 ml of NBM containing B27 and Glutamax. The cell suspension is then passed through a 40 um nylon cell strainer. Next the cells are counted. The neurons are now ready for loading into the neuron microfluidic device.

In this video we demonstrate the preparation of E18 Cortical Rat Neurons.

Preparando E18 neurônios de rato para Cortical Compartimentação em um dispositivo micro

In this video, we demonstrate the preparation of E18 cortical rat neurons. E18 cortical rat neurons are obtained from E18 fetal rat cortex previously ...

Cell Capture Using a Microfluidic Device

Captura de célula usando um dispositivo micro

Non-plasma Bonding of PDMS for Inexpensive Fabrication of Microfluidic Devices

In this video, we demonstrate how to use the neuron microfluidic device without plasma bonding.  In some cases it may be desirable to reversibly bond devices to the Corning No. 1 cover glass.  This could be due, perhaps, to a plasma cleaner not being available.  In other instances, it may be desirable to remove the device from the glass after the culturing of neurons for certain types of microscopy or for immunostaining, though it is not necessary to remove the device for immunostaining since the neurons can be stained in the device.  Some researchers, however, still prefer to remove the device.  In this case, reversible bonding of the device to the cover glass makes that possible.  There are some disadvantages to non-plasma bonding of the devices in that not as tight of a seal is formed.  In some cases axons may grow under the grooves rather than through them.  Also, because the glass and PDMS are hydrophobic, liquids do not readily enter the device making it necessary at times to force media and other reagents into the device.  Liquids will enter the device via capillary action, but it takes significantly longer as compared to devices that have been plasma bonded.  The plasma cleaner creates temporary hydrophilic charges on the glass and device that facilitate the flow of liquids through the device after bonding within seconds.  For non-plasma bound devices, liquid flow through the devices takes several minutes.  It is also important to note that the devices to be used with non-plasma bonding need to be sterilized first, whereas plasma treated devices do not need to be sterilized prior to use because the plasma cleaner will sterilize them.

In this video we demonstrate how to use the neuron microfluidic device without plasma bonding.

Não-plasma Colagem de PDMS para Fabricação barato e de dispositivos microfluídicos

In this video, we demonstrate how to use the neuron microfluidic device without plasma bonding.  In some cases it may be desirable to reversibly bond ...

Mouse Epidermal Neural Crest Stem Cell (EPI-NCSC) Cultures

EPI-NCSC are remnants of the embryonic neural crest in an adult location, the bulge of hair follicles. They are multipotent stem cells that have the physiological property to generate a wide array of differentiated cell types, including neurons, nerve supporting cells, smooth muscle cells, bone/cartilage cells and melanocytes. EPI-NCSC are easily accessible in the hairy skin and can be isolated as a highly pure population of stem cells. This video provides a detailed protocol for preparing mouse EPI-NCSC cultures from whisker follicles. The whisker pad of an adult mouse is removed, and whisker follicles dissected. The follicles are then cut longitudinally and subsequently transversely above and below the bulge region. The bulge is removed from the collagen capsule and placed in a culture plate. EPI-NCSC start to emigrate from the bulge explants 3 to 4 days later.

Mouse Epidermal Neural Crest Stem Cell EPI-NCSC Cultures

Here we show our method to isolate mouse epidermal neural crest stem cells (EPI-NCSC). Technique involves micro-dissecting whisker follicles, isolating the bulge and placeing it into tissue culture. EPI-NCSC start to emigrate from bulge explants onto the substratum within 3 - 4 days.

Rato Epidérmico Neural Stem Cell Crest (EPI-NCSC) Culturas

EPI-NCSC are remnants of the embryonic neural crest in an adult location, the bulge of hair follicles. They are multipotent stem cells that have the ...

Preparation of Pooled Human Platelet Lysate (pHPL) as an Efficient Supplement for Animal Serum-Free Human Stem Cell Cultures

Platelet derived growth factors have been shown to stimulate cell proliferation efficiently in vivo1,2 and in vitro. This effect has been reported for mesenchymal stromal cells (MSCs), fibroblasts and endothelial colony-forming cells with platelets activated by thrombin3-5 or lysed by freeze/thaw cycles6-14 before the platelet releasate is added to the cell culture medium. The trophic effect of platelet derived growth factors has already been tested in several trials for tissue engineering and regenerative therapy.1,15-17 Varying efficiency is considered to be at least in part due to individually divergent concentrations of growth factors18,19 and a current lack of standardized protocols for platelet preparation.15,16 This protocol presents a practicable procedure to generate a pool of human platelet lysate (pHPL) derived from routinely produced platelet rich plasma (PRP) of forty to fifty single blood donations. By several freeze/thaw cycles the platelet membranes are damaged and growth factors are efficiently released into the plasma. Finally, the platelet fragments are removed by centrifugation to avoid extensive aggregate formation and deplete potential antigens. The implementation of pHPL into standard culture protocols represents a promising tool for further development of cell therapeutics propagated in an animal protein-free system.

Preparation of Pooled Human Platelet Lysate pHPL as an Efficient Supplement for Animal Serum-Free Human Stem Cell Cultures

Human platelet lysate is a rich source of growth factors and a potent supplement in cell culture. This protocol presents the process of preparing a large pool of human platelet lysate by starting from platelet rich plasma, performing several freeze-thaw cycles and depleting the platelet fragments.

Preparação de pool de plaquetas Lysate Humanos (pHPL) como um suplemento eficiente para animais de soro livre de culturas de células estaminais humanas

Platelet derived growth factors have been shown to stimulate cell proliferation efficiently in vivo1,2 and in vitro. This effect has been reported for ...

Live Imaging of Cell Motility and Actin Cytoskeleton of Individual Neurons and Neural Crest Cells in Zebrafish Embryos

The zebrafish is an ideal model for imaging cell behaviors during development in vivo. Zebrafish embryos are externally fertilized and thus easily accessible at all stages of development. Moreover, their optical clarity allows high resolution imaging of cell and molecular dynamics in the natural environment of the intact embryo. We are using a live imaging approach to analyze cell behaviors during neural crest cell migration and the outgrowth and guidance of neuronal axons.
Live imaging is particularly useful for understanding mechanisms that regulate cell motility processes. To visualize details of cell motility, such as protrusive activity and molecular dynamics, it is advantageous to label individual cells. In zebrafish, plasmid DNA injection yields a transient mosaic expression pattern and offers distinct benefits over other cell labeling methods. For example, transgenic lines often label entire cell populations and thus may obscure visualization of the fine protrusions (or changes in molecular distribution) in a single cell. In addition, injection of DNA at the one-cell stage is less invasive and more precise than dye injections at later stages.
Here we describe a method for labeling individual developing neurons or neural crest cells and imaging their behavior in vivo. We inject plasmid DNA into 1-cell stage embryos, which results in mosaic transgene expression. The vectors contain cell-specific promoters that drive expression of a gene of interest in a subset of sensory neurons or neural crest cells. We provide examples of cells labeled with membrane targeted GFP or with a biosensor probe that allows visualization of F-actin in living cells1.
Erica Andersen, Namrata Asuri, and Matthew Clay contributed equally to this work.

This protocol describes imaging of individual neurons or neural crest cells in living zebrafish embryos. This method is used to examine cellular behaviors and actin localization using fluorescence confocal time-lapse microscopy.