Bu çalışma, New York Eyaleti Office Bilim, Teknoloji ve Akademik Araştırma (NYSTAR) (form, İleri Teknoloji hibe Merkezi), ve Nanobiyoteknoloji Merkezi (NBTC) Ulusal bir STC Programı hibeleri ile desteklenen Anlaşması No ECS-9876771 altında Bilim Vakfı ve Amerikan Beyin Tümörü Derneği ve New York Tıp Akademisi (JAB).

Prosedür Fibronektin ile slaytları Kaplama Mikroakışkan cihaz montajı için, önce cam slaytlar fibronektin ile sterilize edin. Coat bir biohood slaytlar kısırlık korumak için. Steril bir PDMS ayırıcı slayt kenarları boyunca hizalayın ve kalıcı bir belirteç ile karşı karşıya yan işareti. Pipet cam slayt bütünlüğü üzerinde PDMS ayırıcı içinde fibronektin bir 5 mg / ml solüsyon (Sigma) 1 ml. Bir saat boyunca rahatsız slaytlar bırakın, daha sonra tamamen bir N 2 tabancası kullanarak kurutun. Slaytlar, daha sonraki deneyler için 4 o C&#39;de saklanabilir. Cihazın montajı Tüm cihaz montaj protokolü aşağıdaki yordamları kullanarak, steril koşullar altında biohood yapılır: <ol><li> % 70 etanol ile aşağı silme ve N 2 tabanca ile kurutma desenli mikro silikon ana temizleyin. Steril bir PDMS ayırıcı ana kabartma özellikleri çevresinde forseps kullanılarak 1 mm yüksekliğe yerleştirin. </li><li> Agaroz toz 0.3 g (Fisher Scientific) ve 10 ml CO ağırlığındaki cihaz kullanılan agaroz jel hazırlayın 2 50 ml beher bağımsız medya (Invitrogen). YÜKSEK 20 saniyelik bir mikrodalga ısı ve spatula ile karışımı karıştırınız. Çözünmemiş granül varsa, başka bir 10 saniye ve girdap kalan son granül kurtulmak için sıcak karışım karışım ısı. 8 saniyelik bir ısıtma süresi ile bu işlemi tekrarlayın ve sonra 5 saniye. </li><li> Agaroz çözümü hızla PDMS ayırıcı çevrili silikon ana üzerine dökün ve hemen steril bir cam slayt agaroz karışımı kapsayacak. Sağlamak için yaklaşık 2 dakika için slayt bir sabit, hafif basınç uygulayın agaroz jel PDMS ayırıcı olarak aynı sabit 1 mm yükseklik. </li><li> Agaroz jeller sonra, desenli agaroz jel silikon master ve slayt karşı karşıya agaroz jel mikro fibronektin kaplı cam slayt transfer PDMS ayırıcı ile soyulabilir. Rezervuar bölgeye giriş ve çıkış kere mikro delikler 16 gauge enjektör ucu kullanın. 500 ul CO 2 bağımsız medya, mikro kuruma önlemek için slayt desenli agaroz jel ekleyin . </li><li> Cihazda kullanılan akrilik manifoldu% 70 etanol ile yıkayın ve DI su ile durulayın. Agaroz jel içine mikro delikli delikli manifoldu deliklerini. Daha sonra, jel, PDMS ayırıcı ve cihazın metal çerçeve ile fibronektin slayt manifoldu hizalayın. Cihazın içine, vidalarını yerleştirin ve bir tornavida ile direnç noktasına sıkın. Bu cihaz, deforme agaroz mikro ölçüde fazla sıkılmazsa olduğunu sağlamak için yapılır. Cihazın içinde jel kayma olmadığından emin olmak için bir saat sipariş vidalarını sıkın. 1ml bir şırınga yardımıyla mikro sızıntı ve tıkanıklıkları için cihaz test edin. CO 2-bağımsız medya mikro enjekte etmek için şırınga, boru sonunda bir jel yükleme pipet ile Tygon boru ile donatılmıştır . Bir Mikrokanallı medya, medya ilgili girişine enjekte edildiğinde sadece Mikrokanallı çıkış çıkmak için görülmektedir başarıyla oluşmuş sayılır. Şimdi, cihaz kullanıma hazırdır. </li></ol> Cihaz hücrelerin hazırlanması ve Yayımlamak Hücreleri (hücre yoğunluğu yaklaşık 100.000 hücre / ml)% 70 confluency ulaştığında, cihazın içine numaralı seribaşı olarak hazırlanır. Hücrelerin iki DPBS Konu (Invitrogen) yıkar. Hücreleri ayırmak için tripsin-EDTA (Invitrogen) 200 ul ekleyin. Hücreler, tripsin inaktive içeren serum M2 medya 5ml içeren 15 ml santrifüj tüpüne aktarın. 5 dakika için 1000 RPM hücrelerin büyüme ortamı Santrifüj. Süpernatantı kapalı aspire ve hücre pelet DPBS 5 ml tekrar süspansiyon haline getirin. Aynı koşullar altında tekrar DPBS hücreleri santrifüjleyin. Süpernatant tekrar kapalı aspire ve 500 ul CO 2 bağımsız medya hücre pelletini tekrar süspansiyon haline getirin. Yerçekimine bağlı akış ile cihazın Mikrokanallı merkezi haline Tohum hücrelerinin süspansiyon. Sırasıyla, hücre süspansiyonu 60 ul ve CO 2 bağımsız orta 20 ul Mikrokanallı merkezinin giriş ve çıkış ekleyin. Hücre adezyon bakmak için bir aydınlık alan mikroskobu altında Mikrokanallı merkezi uyun. Hücreler genellikle 10 dakika sonra yapışır. Hücreleri, uygun bir yoğunlukta kanal alt bağlı kalan hücre süspansiyonu giriş ve çıkışında medya pipeted. Merkezi kanal giriş ve çıkış hem de CO Yeri 60 ul 2-bağımsız medya. Yeri PDMS th üzerinde kapsare merkezine giriş ve çıkış medya merkezi kanal buharlaşmasını en aza indirmek için. Görüntüleme cihaz hücreleri Önce cihazın montajı, mikroskop (Olympus X81) üzerinden hava istasyonu, steril peristaltik boru iplik ve peristaltik pompa (Watson-Marlow 205U/CA) ile bağlanmak. PBS 4 RPM hızında boru ile yıkayın. Cihazın montajı sonra, 15 ml santrifüj tüplerine CO 2 bağımsız medya epidermal büyüme faktörü (EGF) (Sigma) çözümleri, uygun konsantrasyonda hazırlar . Vortex EGF çözümleri ve 5 saniye boyunca tüp bağlanabilir. Cihaza karşılık gelen EGF konsantrasyonları ile işaretlenmiş borulama bağlayın. EGF kanal sırt çapında yaygın ve istikrarlı bir kimyasal degrade kurmak için yaklaşık bir saat sürer. Bir görüntüleme yazılımı, Slidebook, deneysel bir dönemde yaklaşık 5 saat boyunca her 10 dakikada bir dizi görüntü almak için kullanılır. Xy otomatik sahne programlanmış Aynı merkez kanal ve üç merkezi kanallarının toplam iki alt-alanlar (400μm x400μm bir alana sahip her) belirli bir zaman noktasında görüntülü böyle. Farklı merkezi kanalları (genellikle 3 bir vadede) hücreler, tüp üzerinde işaretli farklı EGF konsantrasyonları var. Malzemeleri ve Ekipmanları Postnatal fare beyincik 6, 7 dış germinal tabakadan elde edilen hücre hatları: C17.2 hücreleri NSC&#39;lerde . Bu hücre hattı kullanarak, retrovirüs transfeksiyon yöntemi kullanarak diğer iki fare kök hücre hatları geliştirdik. Bu iki stably transfekte hücre hatları (1) wtEGFR - insan vahşi tip EGFR aşırı ifade ettiğini ve (2) ΔEGFR - yapısal olarak aktif EGFR mutant. Algılama kolaylığı için, retrovirüsler ribozomal bağlanma (IRES) ve Yeşil floresan proteini (GFP) için dahili bir site tarafından takip çıkarlarını gen ile bir omurga taşır. Hücre kültürü: fare C17.2 NSC&#39;lerde ve bunların varyantları M2 medyada 6 plaka (% 10 fetal sığır serumu (FBS) (Invitrogen),% 5 at serumu (HS) (Invitrogen DMEM (Invitrogen) yetiştirilen ) ve% 1 penisilin / streptomisin (Invitrogen).) Hücreler% 80 hava ve% 5 CO 2, 37 ° C&#39;de tutuldu . Mikroakışkan cihaz: Bir plastik manifoldu, PDMS ayırıcı, ve paslanmaz cihazı yerinde tutmak için bir çerçeve. Görüntüleme Ters bir floresan mikroskobu (Olympus IX-81) yoğun bir CCD kamera (Orca, Hamamatsu) ile bağlantılı olarak kullanılır. Mikroakışkan cihaz otomatik bir xyz sahne üzerine monte edilmiştir ve sahne 37 o C lik bir sıcaklık koruyan bir çevre odası tarafından içine Genellikle otomatik xyz sahne kullanarak aynı zamanda noktada filme olacak aynı çip üzerinde 3-4 cihazlar vardır. Korumak Akış 8 paralel çizgiler (Watson-Marlow 205U/CA) otomatik bir peristaltik pompa, lavabo ve kaynak kanallarının tüm akışını korumak için kullanılır. <img src="/files/ftp_upload/old/674_2008_9_29_6/674_Figure-01.jpg" alt="Şekil 1" width="573" height="414" /> Şekil Üç MGK suşlarının çeşitli EGF konsantrasyonlarda 1 Motilite (ebeveyn, wtEGFR ve D EGFR) yörüngeleri 5 saat film izleme (wtEGF 100ng/ml, 4hour hariç) alınan ve tüm parçaları kökeni. karşılaştırma amacı için (0,0) repositioned. <img src="/files/ftp_upload/old/674_2008_9_29_7/674_Figure-02.jpg" alt="Şekil 2" width="576" height="546" /> Şekil EGFR ekspresyon seviyesi ve motilite (a) iki görüntü wtEGF NSC&#39;lerde 100ng/ml EGF ile mikroakışkan kanal yüzeyinde 2 Korelasyon. Sol görüntü floresan görüntü ve doğru iletilen bir aydınlık alana görüntü. Ölçekleme çubuğu 100μm ve Kanal genişliği 400 mm. Hücreler ifade GFP parlaklık iki popülasyonun ayrılır. Hücreler mavi daireler sönük, böylece daha az EGFR ekspresyon seviyesi var ve kırmızı daireler hücrelerin brigher, böylece daha yüksek EGFR ekspresyon seviyesi var. (B) düşük ve yüksek EGFR ekspresyon seviyesi ile hücreler Yörüngeler. Bu yörüngeleri dört saat süren bir film alınmıştır .

<ol>
	<li>Blow, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidics:+in+search+of+a+killer+application.">Microfluidics: in search of a killer application.</a> Nature Methods. 4, 665-670 (2007).</li><li>Shing-Yi Cheng, S. H., Wassweman, M. a. x., Archer, S. h. i. v. a. u. n., Shuler, M. i. c. h. a. e. l. . L., Wu, M. i. n. g. m. i. n. g. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+hydrogel-based+microfluidic+device+for+the+studies+of+directed+cell+migration.">A hydrogel-based microfluidic device for the studies of directed cell migration.</a> Lab-on-a-chip. 7, 763-769 (2007).</li><li>Pedersen, M. W., Tkach, V., Pedersen, N., Berezin, V., Poulsen, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+a+naturally+occurring+constitutively+active+variant+of+the+epidermal+growth+factor+receptor+in+mouse+fibroblasts+increases+motility.">Expression of a naturally occurring constitutively active variant of the epidermal growth factor receptor in mouse fibroblasts increases motility.</a> Int J Cancer. 108, 643-653 (2004).</li><li>Ayuso-Sacido, A., Graham, C., Greenfield, J. P., Boockvar, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+duality+of+EGFR+signaling+and+neural+stem+cell+phenotype:+Cell+enhancer+or+cell+transformer.">The duality of EGFR signaling and neural stem cell phenotype: Cell enhancer or cell transformer.</a> Current Stem Cell Research and Therapy. 1, 231-238 (2006).</li><li>Eisenbach, M., Constantinou, C., Aloni, H., Shinitzky, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repellents+for+Escherichia+coli+operate+neither+by+changing+membrane+fluidity+nor+by+being+sensed+by+periplasmic+receptors+during+chemotaxis.">Repellents for Escherichia coli operate neither by changing membrane fluidity nor by being sensed by periplasmic receptors during chemotaxis.</a> J Bacteriol. 172, 5218-5224 (1990).</li><li>Snyder, E. Y., Deitcher, D. L., Walsh, C., Arnold-Aldea, S., Hartwieg, E. A., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multipotent+neural+cell+lines+can+engraft+and+participate+in+development+of+mouse+cerebellum.">Multipotent neural cell lines can engraft and participate in development of mouse cerebellum.</a> Cell. 68, 33-51 (1992).</li><li>Snyder, E. Y., Yoon, C., Flax, J. D., Macklis, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multipotent+neural+precursors+can+differentiate+toward+replacement+of+neurons+undergoing+targeted+apoptotic+degeneration+in+adult+mouse+neocortex.">Multipotent neural precursors can differentiate toward replacement of neurons undergoing targeted apoptotic degeneration in adult mouse neocortex.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 94, 11663-11668 (1997).</li></ol>

Şekil 1 üç MGK suşları, ebeveyn hücreler, wtEGFR ve ΔEGFR (kontrol) yörüngeleri gösterir. Yörüngeleri Her set 5 saat uzunluğunda bir film elde edildi. EGF konsantrasyonu ~ 10 ng ebeveyn hücreler için, hücre motilitesi doruğa ulaştı; wtEGFR hücrelerin, hücre motilite zirve 100ng/ml veya üzeri kaymıştır; beklendiği gibi ΔEGFR hücrelerin, hücre motilite EGF konsantrasyon bağımsız oldu. 100ng/ml wtEGF hücreleri en hareketli hücreler, yaklaşık 1,5 kat, 10 ng ile ebeveyn hücrelerden daha hızlı taşındı. (1) EGFR ekspresyonu üzerinde hücre motilitesini artırır olduğunu gösterir; (2) EGF ligand-reseptör biding olayların sayısı, hücre hareketi üzerinde doğrudan bir etkisi vardır. ΔEGFR hücre hattı, yapısal olarak aktif EGFR mutant. Bu mutant insan glioblastoma ~% 60 görünür. Bu kurucu aktif bir ligand bağımsız kinaz olur kesilmiş bir ekstrasellüler etki alanı vardır. Otofosforilasyon yoğunluğu yabani tip EGFR (wtEGFR) 4 aktive ligand ile karşılaştırıldığında küçük (yaklaşık% 10). Bu temelini gözlem ΔEGF hücreleri ebeveyn ve wtEGFR (AGF yokluğunda) biraz daha yüksek motilite var, ama motilitesi çeşitli EGF konsantrasyonlarda sabit tutulur. WtEGFR hücreleri GFP (yeşil floresan protein) ve EGFR aynı kopya yapılan bu yana, wtEGFR hücrelerin floresan yoğunluğu EGFR ekspresyon düzeyleri ortaya koymaktadır. Bu bizi doğrudan hücre hareketi ile EGFR protein ekspresyon seviyesi (yeşil floresan yoğunluğu) korelasyon sağlar. Şekil Ve mavi daire içinde hücreler yemek böylece alt EGFR ekspresyon seviyesi, 2 iki hücre popülasyonunun yörüngeleri, kırmızı daire içinde hücreler bu nedenle daha yüksek EGFR ekspresyon seviyesi, daha parlak gösterir. Sonuç yine yüksek EGFR ekspresyon seviyesi, bu hücreler daha hareketli olduğunu göstermektedir. Geleneksel olarak, NSC&#39;lerde, motilite bir zarından göç hücrelerinin yüzde 5 değerlendirilir Boyden çemberinin testi kullanılarak tespit edilmiştir. Bu nüfus tabanlı bir tahlil, hücre davranış bireysel olarak değerlendirilmesi mümkün değildir. Burada gösterilen mikroakışkan cihaz, bir tek hücre düzeyinde hücre hareketini incelemek için bir fırsat sunar ve iyi kontrollü bir kimyasal ortamda. Canlı hücreler NSC&#39;lerde motilite fenotip ile EGFR protein ekspresyon seviyesi doğrudan ilişkili, ilk kez, bir sağlar. Cihazın küçük boyutlu, insan kök hücreleri gibi hücrelerin kaynakları sınırlı deneyler, için özellikle yararlıdır.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) (1X)</td>
<td>Reagent</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>11971-025</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>CO2-independent media</td>
<td>Reagent</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>18045-088</td>
<td>A non-HEPES proprietary medium suitable for supporting cell growth for a variety of epithelial, fibroblast, and lymphoid cell lines in atmospheric conditions, contains no L-glutamine</td>
</tr>
<tr>
<td>Trypsin-EDTA</td>
<td>Reagent</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>25200-072</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PBS</td>
<td>Reagent</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>14190-144</td>
<td>Phosphate-buffered saline, without calcium or magnesium</td>
</tr>
<tr>
<td>Pen/Strep</td>
<td>Reagent</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>15140-122</td>
<td>Contains 10,000 units of penicillin (base) and 10,000 g of streptomycin (base)/ml utilizing penicillin G (sodium salt) and streptomycin sulfate in 0.85% saline</td>
</tr>
<tr>
<td>FBS</td>
<td>Reagent</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>10437-028</td>
<td>Fetal Bovine Serum, Qualified</td>
</tr>
<tr>
<td>Horse Serum</td>
<td>Reagent</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>16050-130</td>
<td>Horse Serum, EIA tested (negative) serum</td>
</tr>
<tr>
<td>Fibronectin</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>F0895</td>
<td>Fibronectin from human plasma, also called cold insoluble globulin</td>
</tr>
<tr>
<td>EGF</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>E4127</td>
<td>Epidermal Growth Factor from murine submaxillary gland, lyophilized</td>
</tr>
<tr>
<td>Agarose</td>
<td>Reagent</td>
<td>FisherScientific</td>
<td>BP1356-500</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

assessing neural stem cell motility using an agarose gel-based microfluidic device

Mikroakışkan teknolojisi makromoleküler deneyleri için yeni bir olgunluk seviyesine ulaşırken, hücre tabanlı deneyleri, hala bir bebek evre 1 . Bu bir hücre uyumlu ve istikrarlı bir mikroçevresinin geleneksel imalat teknikleri ve malzemeleri kullanarak oluşturabilirsiniz zorluk büyük ölçüde. Mikroakışkan cihaz için temel malzemesi olarak, bir roman mikroimalat malzeme, agaroz jel giriş ile bu sorunu çözmek. Agaroz jel, hücre tabanlı deneyleri için ideal bir malzemedir bu nedenle son derece uysal ve gaz geçirgen ve hücrenin hayatta kalabilmesi için gerekli besin ve. Agaroz jel tabanlı cihazlar bakteriyel ve nötrofil hücre göçü 2 okuyan başarılı olduğunu daha önce göstermiştir. Bu raporda, üç paralel mikroakışkan kanalları hakkında 1mm kalınlığında bir agaroz jel membran desenli. Medya / tampon Sabit akımları peristaltik bir pompa kullanarak her iki yan kanallar tutulur. Hücreler için gözlem merkezi kanal tutulur. Yan kanallar besin ve kimyasal madde yandan merkezi kanal, merkezi kanal kimyasal ortamı sürekli difüzyon olduğundan, yan kanallar boyunca akışını kolayca üzerinden kontrol edilir. Bu cihazı kullanırken, biz nöral kök hücre hareketi ile optik çeşitli kimyasal şartlar altında kolay takip edilebilir göstermek ve deney sonuçları, epidermal büyüme faktörü reseptörleri (EGFR) aşırı ifade, sinir kök hücrelerin motilite artırdığını göstermektedir. Nöral kök hücrelerin Motilite, böylece tümörojenik faktörü 3 hücreleri saldırganlık değerlendirmek için önemli bir biyomarker. MGK motilite altında yatan mekanizma Deşifre her iki nöral gelişim bozuklukları ve beyin kanseri kök hücre invazyonu içine içine fikir verecektir.

Watch this Scientific Journal Video about Assessing Neural Stem Cell Motility Using an Agarose Gel-based Microfluidic Device at JoVE.com

Assessing Neural Stem Cell Motility Using an Agarose Gel-based Microfluidic Device

Biz yeni bir agaroz jel tabanlı mikroakışkan cihaz kullanarak nöral kök hücreler (NSC&#39;lerde) motilite epidermal büyüme faktörü reseptörleri (EGFR) aşırı ifade artırdığını göstermektedir. Bu teknoloji, insan sinir kök hücreleri gibi hücre kaynakları kıt olan diğer memeli hücre sistemleri, kolayca adapte olabilir ve zaman etrafında dönüş kritik öneme sahiptir.

Nöral Kök Hücre Motilite değerlendirilmesi Agaroz Jel tabanlı mikroakışkan Cihaz Kullanımı

While microfluidic technology is reaching a new level of maturity for macromolecular assays, cell-based assays are still at an infant stage1. This is ...

assessing-neural-stem-cell-motility-using-an-agarose-gel-based

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

11.6K Görüntüleme.  Cornell University. Biz yeni bir agaroz jel tabanlı mikroakışkan cihaz kullanarak nöral kök hücreler (NSC'lerde) motilite epidermal büyüme faktörü reseptörleri (EGFR) aşırı ifade artırdığını göstermektedir. Bu teknoloji, insan sinir kök hücreleri gibi hücre kaynakları kıt olan diğer memeli hücre sistemleri, kolayca adapte olabilir ve zaman etrafında dönüş kritik öneme sahiptir.

Video: Assessing Neural Stem Cell Motility Using an Agarose Gel-based Microfluidic Device

Culture of Mouse Neural Stem Cell Precursors

Primary neural stem cell cultures are useful for studying the mechanisms underlying central nervous system development. Stem cell research will increase our understanding of the nervous system and may allow us to develop treatments for currently incurable brain diseases and injuries. In addition, stem cells should be used for stem cell research aimed at the detailed study of mechanisms of neural differentiation and transdifferentiation and the genetic and environmental signals that direct the specialization of the cells into particular cell types.  This video demonstrates a technique used to disaggregate cells from the embryonic day 12.5 mouse dorsal forebrain. The dissection procedure includes harvesting E12.5 mouse embryos from the uterus, removing the "skin" with fine dissecting forceps and finally isolating pieces of cerebral cortex. Following the dissection, the tissue is digested and mechanically dissociated. The resuspended dissociated cells are then cultured in "stem cell" media that favors growth of neural stem cells.

This video describes the method used for isolation of neuroprecursors from the developing cortex of embryonic mice. The procedure for removing embryos from the uterus, dissecting the cortical tissue, and digesting the isolated cerebral cortex is shown.

Fare Nöral Kök Hücre Öncüleri Kültür

Primary neural stem cell cultures are useful for studying the mechanisms underlying central nervous system development. Stem cell research will increase ...

Biyoloji

Fabrication of a Microfluidic Device for the Compartmentalization of Neuron Soma and Axons

In this video, we demonstrate the technique of soft lithography with polydimethyl siloxane (PDMS) which we use to fabricate a microfluidic device for culturing neurons. Previously, a silicon wafer was patterned with the design for the neuron microfluidic device using SU-8 and photolithography to create a master mold, or what we simply refer to as a "master". Next, we pour the silicon polymer PDMS on top of the master which is then cured by heating the PDMS to 80&deg;C for 1 hour. The PDMS forms a negative mold of the device. The PDMS is then carefully cut and lifted away from the master. Holes are punched where the reservoirs will be and the excess PDMS trimmed away from the device. Nitrogen is used to blow away any excess debris from the device. At this point the devices are now ready for use and can either bonded to corning No. 1 cover glass with a plasma sterilizer/cleaner or can be reversibly bound to the cover glass by simply placing the device on top of the cover glass. The reversible bonding of the device to glass is covered in a separate video and requires first that the device be sterilized either with 70% ethanol or by autoclaving. Plasma treating sterilizes the devices so no further treatment is necessary. It is, however, important, when plasma-treating the devices, to add liquid to the devices within 10 minutes of the plasma treatment while the surfaces are still hydrophilic. Waiting longer than 10 minutes to add liquid to the device makes it difficult for the liquid to enter the device. The neuron devices are typically plasma-bound to cover glass and 0.5 mg/ml poly-L-lysine (PLL) in pH 8.5 borate buffer is immediately added to the device. After a minimum of 3 hours incubating with PLL, the devices are washed with dH2O water a minimum of 3 times with at least 15 minutes between each wash. Next, the water is removed and fresh media is added to the device. At this point the device is ready for use. It is important to remember at this point to never remove all the media from the device. Always leave media in the main channel.

In this video we demonstrate the technique of soft lithography with polydimethyl siloxane (PDMS) which we use to farbricate a microfluidic device for culturing neurons.

Nöron Soma ve Aksonlar compartmentalization mikroakışkan Aygıt Fabrikasyon

In this video, we demonstrate the technique of soft lithography with polydimethyl siloxane (PDMS) which we use to fabricate a microfluidic device for ...

Counting Human Neural Stem Cells

Knowledge of the exact number of viable cells in a given volume of a cell suspension is required for many routine tissue culture manipulations, such as plating cells for immunocytochemistry or for cell transfections. This protocol describes a straightforward and fast method for differentiating between live and dead cells and quantifying the cell concentration and total cell number using a hemacytometer. This procedure first requires detaching cells from a growth surface and resuspending them in media. Next, the cells are diluted in a solution of Trypan blue (ideally to a concentration that will give 20-50 cells per quadrant) and placed in the hemacytometer. Finally, averaging the counts of viable cells in several randomly selected quadrants, dividing the average by the volume of one 1 mm2 quadrant (0.1 &mu;l) and multiplying by the dilution factor gives the number of cells per l. Multiplying this cell concentration by the total volume in &mu;l gives the total cell number. This protocol describes counting human neural stem/precursor cells (hNSPCs), but can also be used for many other cell types.

Knowledge of the exact number of viable cells is required for many tissue culture manipulations. This protocol describes how to differentiate between live and dead cells and quantify cells using a hemacytometer. Although it describes counting human neural stem/precursor cells (hNSPCs), it can be used for other cell types.

İnsan Nöral Kök Hücreler Sayma

Knowledge of the exact number of viable cells in a given volume of a cell suspension is required for many routine tissue culture manipulations, such as ...

A Gradient-generating Microfluidic Device for Cell Biology

 The fabrication and operation of a gradient-generating microfluidic device for studying cellular behavior is described.  A microfluidic platform is an enabling experimental tool, because it can precisely manipulate fluid flows, enable high-throughput experiments, and generate stable soluble concentration gradients.  Compared to conventional gradient generators, poly(dimethylsiloxane) (PDMS)-based  microfluidic devices can generate stable concentration gradients of growth factors with well-defined profiles.  Here, we developed simple gradient-generating microfluidic devices with three separate inlets.  Three microchannels combined into one microchannel to generate concentration gradients.  The stability and shape of growth factor gradients were confirmed by fluorescein isothyiocyanate (FITC)-dextran with a molecular weight similar to epidermal growth factor (EGF).  Using this microfluidic device, we demonstrated that fibroblasts exposed to concentration gradients of EGF migrated toward higher concentrations.  The directional orientation of cell migration and motility of migrating cells were quantitatively assessed by cell tracking analysis.  Thus, this gradient-generating microfluidic device might be useful for studying and analyzing the behavior of migrating cells.

We describe a protocol for the microfabrication of the gradient-generating microfluidic device that can generate spatial and temporal gradients in well-defined microenvironment. In this approach, the gradient-generating microfluidic device can be used to study directed cell migration, embryogenesis, wound healing, and cancer metastasis.

Hücre Biyolojisi Degrade üreten mikroakışkan Aygıt

 The fabrication and operation of a gradient-generating microfluidic device for studying cellular behavior is described.  A microfluidic platform is an ...

Preparing E18 Cortical Rat Neurons for Compartmentalization in a Microfluidic Device

In this video, we demonstrate the preparation of E18 cortical rat neurons. E18 cortical rat neurons are obtained from E18 fetal rat cortex previously dissected and prepared. The E18 cortex is, upon dissection, immediately dissociated into individual neurons. It is possible to store E18 cortex in Hibernate E buffer containing B27 at 4&deg;C for up to a week before the dissociation is performed. However, there will be a drop in cell viability. Typically we obtain our E18 Cortex fresh. It is transported to the lab in ice cold Calcium free Magnesium free dissection buffer (CMFM). Upon arrival, trypsin is added to the cortex to a final concentration of 0.125%. The cortex is then incubated at 37&deg;C for 8 minutes. DMEM containing 10% FBS is added to the cortex to stop the reaction. The cortex is then centrifuged at 2500 rpm for 2 minutes. The supernatant is removed and 2 ml of Neural Basal Media (NBM) containing 2% B27 (vol/vol) and 0.25% Glutamax (vol/vol) is added to the cortex which is then re-suspended by pipetting up and down. Next, the cortex is triturated with previously fire polished glass pipettes, each with a successive smaller opening. After triturating, the cortex is once again centrifuged at 2500 rpm for 2 minutes. The supernatant is then removed and the cortex pellet re-suspended with 2 ml of NBM containing B27 and Glutamax. The cell suspension is then passed through a 40 um nylon cell strainer. Next the cells are counted. The neurons are now ready for loading into the neuron microfluidic device.

In this video we demonstrate the preparation of E18 Cortical Rat Neurons.

Mikroakışkan Aygıt compartmentalization E18 Kortikal Rat Nöronlar hazırlanması

In this video, we demonstrate the preparation of E18 cortical rat neurons. E18 cortical rat neurons are obtained from E18 fetal rat cortex previously ...

Cell Capture Using a Microfluidic Device

Hücre Yakalama mikroakışkan Cihaz Kullanımı

Non-plasma Bonding of PDMS for Inexpensive Fabrication of Microfluidic Devices

In this video, we demonstrate how to use the neuron microfluidic device without plasma bonding.  In some cases it may be desirable to reversibly bond devices to the Corning No. 1 cover glass.  This could be due, perhaps, to a plasma cleaner not being available.  In other instances, it may be desirable to remove the device from the glass after the culturing of neurons for certain types of microscopy or for immunostaining, though it is not necessary to remove the device for immunostaining since the neurons can be stained in the device.  Some researchers, however, still prefer to remove the device.  In this case, reversible bonding of the device to the cover glass makes that possible.  There are some disadvantages to non-plasma bonding of the devices in that not as tight of a seal is formed.  In some cases axons may grow under the grooves rather than through them.  Also, because the glass and PDMS are hydrophobic, liquids do not readily enter the device making it necessary at times to force media and other reagents into the device.  Liquids will enter the device via capillary action, but it takes significantly longer as compared to devices that have been plasma bonded.  The plasma cleaner creates temporary hydrophilic charges on the glass and device that facilitate the flow of liquids through the device after bonding within seconds.  For non-plasma bound devices, liquid flow through the devices takes several minutes.  It is also important to note that the devices to be used with non-plasma bonding need to be sterilized first, whereas plasma treated devices do not need to be sterilized prior to use because the plasma cleaner will sterilize them.

In this video we demonstrate how to use the neuron microfluidic device without plasma bonding.

Ucuz mikroakışkan Cihazlar İmalat PDMS Non-plazma Yapışma

In this video, we demonstrate how to use the neuron microfluidic device without plasma bonding.  In some cases it may be desirable to reversibly bond ...

Mouse Epidermal Neural Crest Stem Cell (EPI-NCSC) Cultures

EPI-NCSC are remnants of the embryonic neural crest in an adult location, the bulge of hair follicles. They are multipotent stem cells that have the physiological property to generate a wide array of differentiated cell types, including neurons, nerve supporting cells, smooth muscle cells, bone/cartilage cells and melanocytes. EPI-NCSC are easily accessible in the hairy skin and can be isolated as a highly pure population of stem cells. This video provides a detailed protocol for preparing mouse EPI-NCSC cultures from whisker follicles. The whisker pad of an adult mouse is removed, and whisker follicles dissected. The follicles are then cut longitudinally and subsequently transversely above and below the bulge region. The bulge is removed from the collagen capsule and placed in a culture plate. EPI-NCSC start to emigrate from the bulge explants 3 to 4 days later.

Mouse Epidermal Neural Crest Stem Cell EPI-NCSC Cultures

Here we show our method to isolate mouse epidermal neural crest stem cells (EPI-NCSC). Technique involves micro-dissecting whisker follicles, isolating the bulge and placeing it into tissue culture. EPI-NCSC start to emigrate from bulge explants onto the substratum within 3 - 4 days.

Fare Epidermal Sinir Crest Kök Hücre (EPI-NCSC) Kültürler

EPI-NCSC are remnants of the embryonic neural crest in an adult location, the bulge of hair follicles. They are multipotent stem cells that have the ...

Preparation of Pooled Human Platelet Lysate (pHPL) as an Efficient Supplement for Animal Serum-Free Human Stem Cell Cultures

Platelet derived growth factors have been shown to stimulate cell proliferation efficiently in vivo1,2 and in vitro. This effect has been reported for mesenchymal stromal cells (MSCs), fibroblasts and endothelial colony-forming cells with platelets activated by thrombin3-5 or lysed by freeze/thaw cycles6-14 before the platelet releasate is added to the cell culture medium. The trophic effect of platelet derived growth factors has already been tested in several trials for tissue engineering and regenerative therapy.1,15-17 Varying efficiency is considered to be at least in part due to individually divergent concentrations of growth factors18,19 and a current lack of standardized protocols for platelet preparation.15,16 This protocol presents a practicable procedure to generate a pool of human platelet lysate (pHPL) derived from routinely produced platelet rich plasma (PRP) of forty to fifty single blood donations. By several freeze/thaw cycles the platelet membranes are damaged and growth factors are efficiently released into the plasma. Finally, the platelet fragments are removed by centrifugation to avoid extensive aggregate formation and deplete potential antigens. The implementation of pHPL into standard culture protocols represents a promising tool for further development of cell therapeutics propagated in an animal protein-free system.

Preparation of Pooled Human Platelet Lysate pHPL as an Efficient Supplement for Animal Serum-Free Human Stem Cell Cultures

Human platelet lysate is a rich source of growth factors and a potent supplement in cell culture. This protocol presents the process of preparing a large pool of human platelet lysate by starting from platelet rich plasma, performing several freeze-thaw cycles and depleting the platelet fragments.

Hayvan Serum Ücretsiz İnsan Kök Hücre Kültürleri Verimli Ek olarak Pooled İnsan Trombosit Lizat (pHPL) hazırlanması

Platelet derived growth factors have been shown to stimulate cell proliferation efficiently in vivo1,2 and in vitro. This effect has been reported for ...

Live Imaging of Cell Motility and Actin Cytoskeleton of Individual Neurons and Neural Crest Cells in Zebrafish Embryos

The zebrafish is an ideal model for imaging cell behaviors during development in vivo. Zebrafish embryos are externally fertilized and thus easily accessible at all stages of development. Moreover, their optical clarity allows high resolution imaging of cell and molecular dynamics in the natural environment of the intact embryo. We are using a live imaging approach to analyze cell behaviors during neural crest cell migration and the outgrowth and guidance of neuronal axons.
Live imaging is particularly useful for understanding mechanisms that regulate cell motility processes. To visualize details of cell motility, such as protrusive activity and molecular dynamics, it is advantageous to label individual cells. In zebrafish, plasmid DNA injection yields a transient mosaic expression pattern and offers distinct benefits over other cell labeling methods. For example, transgenic lines often label entire cell populations and thus may obscure visualization of the fine protrusions (or changes in molecular distribution) in a single cell. In addition, injection of DNA at the one-cell stage is less invasive and more precise than dye injections at later stages.
Here we describe a method for labeling individual developing neurons or neural crest cells and imaging their behavior in vivo. We inject plasmid DNA into 1-cell stage embryos, which results in mosaic transgene expression. The vectors contain cell-specific promoters that drive expression of a gene of interest in a subset of sensory neurons or neural crest cells. We provide examples of cells labeled with membrane targeted GFP or with a biosensor probe that allows visualization of F-actin in living cells1.
Erica Andersen, Namrata Asuri, and Matthew Clay contributed equally to this work.

This protocol describes imaging of individual neurons or neural crest cells in living zebrafish embryos. This method is used to examine cellular behaviors and actin localization using fluorescence confocal time-lapse microscopy.