Este é um método hidropônico não invasivo para medir a arquitetura do sistema radicular usando equipamentos de laboratório de rotina. Este protocolo permite a visualização completa de todo o sistema radicular da planta, espalhando-o manualmente. Uma das principais vantagens da análise de RSA é que ela permite estudar o sistema radicular das plantas sem a necessidade de introduzir contaminação elementar indesejada.
Este método pode registrar a interação ambiental direta, incluindo condições hormonais, de nutrientes e climáticas com a ASR dos sistemas vegetais. Comece a esterilização superficial das sementes de Arabidopsis mergulhando uma pequena colher de aproximadamente 100 sementes em água destilada à temperatura ambiente. Após 30 minutos, centrifugar brevemente as sementes a 500 G por cinco segundos usando uma centrífuga de mesa.
Em seguida, decantar a água e adicionar 700 microlitros de etanol a 70% antes de agitar o tubo por alguns segundos. Centrifugar as sementes novamente. Se necessário, repita o vórtice e a centrifugação, garantindo que o tratamento com etanol a 70% não exceda três minutos.
Após três minutos, enxaguar imediatamente as sementes com água estéril. Em seguida, tratar as sementes com água sanitária comercial diluída contendo uma gota de TWEEN 20 por sete minutos. Misture as sementes com solução de água sanitária invertendo os tubos rapidamente oito a 12 vezes.
Após uma breve centrifugação, decantar o sobrenadante com uma pipeta de um mililitro e enxaguar as sementes pelo menos cinco vezes com água estéril, seguindo o mesmo procedimento de vórtice. Deixe as sementes esterilizadas na superfície em água e incube-as por dois a três dias a quatro graus Celsius para estratificação. Autoclave a caixa magenta padrão meio cheia de água destilada.
Corte a folha de policarbonato autoclavada em retângulos de quatro por oito centímetros com um entalhe médio mais da metade do retângulo para que dois retângulos possam se encaixar para formar uma forma de X. Use esta configuração para segurar a malha de polipropileno de tamanho de poro de 250 micrômetros cortada em quadrados de seis por seis centímetros. No gabinete de fluxo de ar laminar, adicione meio basal MS estéril com vitaminas mais 1,5% de sacarose a cada caixa para alcançar a borda inferior da tela de polipropileno.
Semear hidroponicamente as sementes esterilizadas na superfície e cultivá-las por três dias. Após três dias, transfira as mudas para uma malha de poros de 500 micrômetros e deixe crescer por dois dias. Em seguida, transferir as mudas para o meio controle e para o meio experimental, e deixar as sementes crescerem por sete dias.
Adicione de 10 a 20 mililitros de água filtrada autoclavada à placa de Petri. Retire suavemente as mudas da malha de 500 micrômetros. Com a ajuda de um pincel de arte redondo, espalhe raízes semelhantes a plantas no prato cheio de água e submerja-as em água.
Incline levemente a placa para retirar a água. Digitalize ou fotografe essas placas de Petri adequadamente. Meça a arquitetura do sistema raiz, ou características RSA, usando o software ImageJ disponível gratuitamente e, em seguida, abra o arquivo a ser analisado.
Depois de definir a escala, use a ferramenta de linha reta para criar uma seleção de linha que contorne a barra de escala. Conclua a estrutura de tópicos clicando com o botão direito, clicando duas vezes ou clicando na caixa no início. Para medir o comprimento da barra de escala conhecida em pixels, clique em analisar, seguido de medir na barra de ferramentas.
Anote o comprimento do pixel. Abra a caixa de diálogo Definir escala clicando na guia Definir escala na guia Analisar. Verifique o comprimento do pixel no campo de distância em pixels.
Em seguida, insira o valor da barra de escala no campo de distância conhecida e defina a unidade de comprimento como milímetros. Bloqueie a escala para esta imagem específica clicando em ok. Use a ferramenta de linha segmentada para uma seleção de linha que delineie o comprimento da raiz.
Depois de terminar o contorno, ajuste a seleção de linha clicando e arrastando as pequenas alças em preto e branco ao longo do contorno. Na guia analyze do ImageJ, selecione o comando measure e quantifique o comprimento da raiz. Transfira os dados medidos para uma planilha clicando com o botão direito do mouse na janela de resultados, selecionando Copiar tudo no menu pop-up, alternando para a planilha e colando os dados.
Para a medição e cálculo das características da ASR, meça o comprimento da raiz primária entre a junção do hipocótilo até a extremidade da ponta da raiz. Em seguida, meça as raízes laterais de primeira ordem, ou comprimento LR de um grau, e raízes laterais de segunda ordem, ou comprimento LR de dois graus. Feito isso, copie e cole todas as medidas na planilha.
Meça e registre a zona de ramificação da raiz primária, ou BZPR, que abrange o primeiro ponto emergente da raiz lateral até o último ponto emergente da raiz lateral. Da mesma forma, registre o número de raízes laterais originadas dentro do limite do BZPR. Em seguida, meça o comprimento médio das raízes laterais de primeira e de ordem superior.
Derivar o comprimento médio das raízes laterais primárias dividindo o comprimento total das raízes laterais primárias pelo número total de raízes laterais primárias. Em seguida, para medir o comprimento médio das raízes laterais de segunda ordem, calcule o comprimento médio das raízes laterais secundárias dividindo o comprimento total das raízes laterais secundárias pelo número total de raízes laterais secundárias. Medir a densidade da raiz lateral primária dividindo o número de raízes laterais primárias pelo comprimento do BZPR.
Em seguida, meça a zona de ramificação de raízes laterais individuais e calcule a densidade de raízes laterais secundárias dividindo o número de raízes laterais secundárias pelo comprimento das zonas de ramificação de comprimentos de raízes laterais de segunda ordem. Uma vez feito, meça o comprimento total da raiz, ou TRL. Este é o agregado de raízes primárias e comprimentos de raízes laterais primárias e secundárias.
O sistema hidropônico utilizado neste experimento funcionou bem, refletindo o fenótipo contrastante aparente sob condições deficientes e suficientes de fosfato inorgânico. Várias características da ASR foram analisadas sob regimes contrastantes de fosfato inorgânico em condições hidropônicas. O tratamento deficiente em fosfato inorgânico invocou um fenótipo radicular exibindo uma ASR mais curta, mais rasa e menos ramificada, em comparação com a condição suficiente de fosfato inorgânico.
O comprimento da raiz primária foi significativamente atenuado na condição de deficiência de fosfato inorgânico. O ganho significativo e rápido no comprimento primário da raiz na presença de fosfato inorgânico de 1,25 milimolar ou meio controle indicou a eficiência do sistema hidropônico e refletiu adequadamente as alterações fisiomorfológicas. A zona de ramificação foi significativamente reduzida sob a condição deficiente de fosfato inorgânico.
O comprimento médio da raiz lateral primária foi significativamente reduzido na condição deficiente em pi. O comprimento médio da raiz lateral secundária foi igualmente reduzido devido à condição deficiente de fosfato, no entanto, foi menor em quantidade do que o comprimento médio da raiz lateral primária. O número de raízes laterais primárias e secundárias diminuiu fortemente sob a condição deficiente em fosfato, em comparação com o controle, condição de fosfato inorgânico de 1,25 milimolar.
A densidade radicular lateral primária não foi alterada na condição de fosfato deficiente, em relação ao controle, 1,25 milimolar de fosfato inorgânico. A densidade radicular lateral secundária não apresentou alteração significativa, indicando a importância da densidade radicular lateral para o conhecimento da plasticidade da ASR. Removi suavemente as mudas da malha usando pinças.
Espalhei raízes em uma placa cheia de água usando um pincel redondo, todas as raízes primárias, e espalhei reto, espalhei raízes laterais simetricamente, espalhei raízes laterais de segunda ordem ligadas a raízes laterais de primeira ordem. Um método semelhante pode ser usado para calcular a área de fuligem das pontas das plantas de Arabidopsis. As folhas de Arabidopsis podem ser espalhadas na outra placa, seguidas de captura e análise de imagens usando o software ImageJ disponível gratuitamente para determinar a área de fuligem.
Este protocolo pode ser utilizado para esclarecer quaisquer dúvidas sobre a influência do ambiente na plasticidade do sistema radicular.
