Nosso protocolo é fácil de usar. Usando esta técnica, qualquer um pode facilmente isolar o componente do sangue. A contaminação pode ser minimizada e os materiais podem ser separados com precisão.
Com a automação e o estabelecimento deste protocolo, os pesquisadores podem facilmente obter substâncias relacionadas ao câncer com alta pureza, o que é útil para vários estudos a jusante. Em particular, espera-se que proporcione vantagens importantes para a investigação do utilizador final. Demonstrando seu procedimento estará Jay Jeong, pesquisador sênior e gerente assistente do Cancer Genomics Research Institute.
Para começar, carregue o cartucho LBx 1 selecionando o tipo de cartucho no painel touchscreen do instrumento. Pressione o botão de seta para alterar o número de amostras. Em seguida, abra a porta do instrumento e insira todos os cartuchos a serem usados na ordem do número no suporte do cartucho.
Para um total de quatro cartuchos, coloque o cartucho fictício no espaço vazio do suporte do cartucho. Use a roda de suporte para montar o cartucho e aperte a porca de bloqueio para prendê-lo. Feche a porta e pressione o botão Executar na tela do touchpad.
O instrumento fecha as válvulas nos cartuchos, o que leva aproximadamente 30 segundos. Siga a mensagem para abrir a porta. Remova a roda de suporte e remova o cartucho fechado por válvula do suporte do cartucho.
Pipetar um máximo de 10 mililitros de uma amostra de sangue total utilizando uma pipeta serológica. Insira a ponta da pipeta profundamente na entrada da amostra do cartucho e injete lentamente a amostra de sangue total. Depois de inserir os cartuchos no instrumento, feche a porta do instrumento e pressione o botão OK.
Os casacos plasmáticos e bufantes são automaticamente separados do sangue total, o que leva aproximadamente 30 minutos. Uma vez que o plasma e o casaco bufante são separados, uma mensagem na tela acompanhada por um som de alarme aparecerá. Pare o alarme abrindo a porta ou pressionando o botão de parada.
Abra a porta. Remova o cartucho e coloque-o sobre a mesa. Recupere três mililitros de plasma da saída de plasma usando uma ponta de pipeta de um mililitro.
Em seguida, recupere três mililitros do buffy coat da saída do buffy coat usando uma ponta de pipeta de um mililitro. Em seguida, carregue o cartucho LBx 2 selecionando o nome do cartucho no painel touchscreen do instrumento. Pressione o botão de seta para alterar o número de amostras e siga o mesmo procedimento mostrado para que o cartucho LBx 1 insira o cartucho no suporte do cartucho.
Depois de inserir o cartucho e fechar a porta, pressione o botão Executar na tela do touchpad. Siga o procedimento mostrado anteriormente para remover o cartucho fechado por válvula do suporte do cartucho e colocá-lo sobre a mesa. Pipetar a solução de gradiente de densidade utilizando uma pipeta serológica.
Insira a ponta da pipeta profundamente na entrada do cartucho e injete lentamente a solução. Em seguida, pipete a amostra de sangue total e injete-a lentamente na entrada da amostra. Depois de inserir e fixar o cartucho, feche a porta e pressione o botão OK.
Uma vez que o plasma e o PBMC são automaticamente separados do sangue total, uma mensagem acompanhada por um som de alarme aparecerá. Abra a porta e retire o cartucho. Recupere três mililitros de plasma da saída de plasma usando uma ponta de pipeta de um mililitro e, em seguida, recupere três mililitros do PBMC da saída PBMC.
Da mesma forma, para o cartucho FAST-auto, depois de remover o cartucho fechado por válvula do suporte do cartucho, injete seis mililitros da solução PBS na entrada PBS do cartucho. Em seguida, pipetar três mililitros de sangue total ou buffy coat obtido de LBx 1, ou PBMC amostra obtida de LBx 2, e injetar lentamente a amostra na entrada da amostra do cartucho. Depois de inserir o cartucho e prendê-lo, feche a porta e pressione o botão OK.
Quando o enriquecimento automático das CTCs estiver concluído, pare o alarme. Remova o cartucho e insira o removedor de placa traseira, ou BPR, nos quatro orifícios na frente do cartucho. Pressione a asa azul escura com os polegares de ambas as mãos e, em seguida, pressione o corpo azul claro até que ele clique.
Remova cuidadosamente o corpo do cartucho levantando-o. Muito suavemente, pegue a membrana do filtro pela borda usando um tzezer e coloque a membrana em um tubo de 1,5 mililitro para preparação de ácido nucleico ou em um vidro deslizante para a coloração. Se necessário, recupere o sangue filtrado para a saída de sangue usando uma ponta de pipeta de um mililitro.
Os cfDNAs extraídos foram avaliados por meio do Bioanalyzer, e fitas de tela de cfDNA foram utilizadas em conjunto com uma escada eletrônica. A linha verde foi utilizada para alinhar a escada e a amostra. As marcas triangulares indicam a banda de DNA.
A maioria dos cfDNA tem um comprimento de 166 pares de bases e alguns existem em múltiplos inteiros de comprimento. Normalmente, a concentração de cfDNA mede até o tamanho de 50 a 700 pares de bases. Embora haja uma diferença na quantidade obtida de cada amostra individual, como 8,47 nanogramas por mililitro e 5,2 nanogramas por mililitro, os resultados da extração de cfDNA foram bons tanto para a concentração quanto para a distribuição de tamanho em todos os casos.
Esses resultados indicam que o método LBx 1 separa com precisão o plasma contendo cfDNA. No FAST-auto, a membrana foi removida e corada com anticorpos fluorescentes para detectar CTCs e glóbulos brancos. A membrana corada, colocada em lâminas de vidro, foi observada em microscópio de fluorescência.
Após a coloração da membrana, as células mostram DAPI ou sinais positivos nucleares em azul, enquanto EpCAM e CK ou CTCs positivos são destacados em verde, e CD45 ou leucócitos positivos são destacados em vermelho. Não é difícil remover a membrana. No entanto, é necessário ter cuidado com a perda e contaminação das CTCs.
Sangue total, PBMC e casaco bufante estão todos disponíveis. Em vez disso, você só precisa definir o volume inteiro. Outros líquidos também podem ser usados, embora testes sejam necessários.
Esta técnica pode ser operada diretamente em hospitais e a substância pode ser obtida rapidamente.
