Il nostro protocollo è facile da usare. Usando questa tecnica, chiunque può facilmente isolare il componente dal sangue. La contaminazione può essere ridotta al minimo e i materiali possono essere separati con precisione.
Con l'automazione e l'istituzione di questo protocollo, i ricercatori possono facilmente ottenere sostanze correlate al cancro con elevata purezza, il che è utile per vari studi a valle. In particolare, si prevede che apporterà importanti vantaggi per la ricerca sugli utenti finali. A dimostrare la loro procedura sarà Jay Jeong, ricercatore senior e assistente manager presso il Cancer Genomics Research Institute.
Per iniziare, caricare la cartuccia LBx 1 selezionando il tipo di cartuccia sul pannello touchscreen dello strumento. Premere il pulsante freccia per modificare il numero di campioni. Quindi, aprire lo sportello dello strumento e inserire tutte le cartucce da utilizzare in ordine di numero sul portacartucce.
Per un totale di quattro cartucce, posizionare la cartuccia fittizia nello spazio vuoto del portacartucce. Utilizzare la rotella di supporto per montare la cartuccia e serrare il dado di bloccaggio per fissarlo. Chiudere lo sportello e premere il pulsante di esecuzione sullo schermo del touchpad.
Lo strumento chiude le valvole sulle cartucce che richiede circa 30 secondi. Segui il messaggio per aprire la porta. Rimuovere la ruota di supporto e rimuovere la cartuccia chiusa a valvola dal supporto della cartuccia.
Pipettare un massimo di 10 millilitri di un campione di sangue intero utilizzando una pipetta sierologica. Inserire la punta della pipetta in profondità nell'ingresso del campione della cartuccia e iniettare lentamente l'intero campione di sangue. Dopo aver inserito le cartucce nello strumento, chiudere lo sportello dello strumento e premere il pulsante OK.
I mantelli di plasma e buffy vengono automaticamente separati dal sangue intero, il che richiede circa 30 minuti. Una volta separati il plasma e il buffy coat, apparirà un messaggio sullo schermo accompagnato da un suono di allarme. Arrestare l'allarme aprendo la porta o premendo il pulsante di arresto.
Apri la porta. Rimuovere la cartuccia e posizionarla sul tavolo. Recuperare tre millilitri di plasma dall'uscita del plasma utilizzando una punta per pipetta da un millilitro.
Quindi, recuperare tre millilitri del buffy coat dall'uscita del buffy coat usando una punta di pipetta da un millilitro. Quindi, caricare la cartuccia LBx 2 selezionando il nome della cartuccia sul pannello touchscreen dello strumento. Premere il pulsante freccia per modificare il numero di campioni e seguire la stessa procedura indicata per la cartuccia LBx 1 per inserire la cartuccia nel supporto della cartuccia.
Dopo aver inserito la cartuccia e chiuso lo sportellone, premere il pulsante di esecuzione sullo schermo del touchpad. Seguire la procedura illustrata in precedenza per rimuovere la cartuccia chiusa a valvola dal supporto della cartuccia e posizionarla sul tavolo. Pipettare la soluzione del gradiente di densità utilizzando una pipetta sierologica.
Inserire la punta della pipetta in profondità nell'ingresso della cartuccia e iniettare lentamente la soluzione. Quindi, pipettare l'intero campione di sangue e iniettarlo lentamente nell'ingresso del campione. Dopo aver inserito e fissato la cartuccia, chiudere lo sportello e premere il pulsante OK.
Una volta che il plasma e il PBMC sono automaticamente separati dal sangue intero, apparirà un messaggio accompagnato da un suono di allarme. Aprire lo sportello e rimuovere la cartuccia. Recuperare tre millilitri di plasma dall'uscita del plasma utilizzando una punta di pipetta da un millilitro, quindi recuperare tre millilitri di PBMC dall'uscita PBMC.
Allo stesso modo, per la cartuccia FAST-auto, dopo aver rimosso la cartuccia chiusa a valvola dal supporto della cartuccia, iniettare sei millilitri della soluzione PBS nell'ingresso PBS della cartuccia. Quindi, pipettare tre millilitri di sangue intero o buffy coat ottenuto da LBx 1, o campione PBMC ottenuto da LBx 2, e iniettare lentamente il campione nell'ingresso del campione della cartuccia. Dopo aver inserito la cartuccia e averla fissata, chiudere lo sportello e premere il pulsante OK.
Una volta completato l'arricchimento automatico dei CTC, interrompere l'allarme. Rimuovere la cartuccia e inserire il dispositivo di rimozione della piastra posteriore, o BPR, nei quattro fori sulla parte anteriore della cartuccia. Premere l'ala blu scuro con i pollici di entrambe le mani e quindi premere il corpo azzurro fino a quando non scatta.
Rimuovere con cautela il corpo della cartuccia sollevandolo. Molto delicatamente, raccogliere la membrana del filtro dal bordo usando una pinzetta e posizionare la membrana in un tubo da 1,5 millilitri per la preparazione dell'acido nucleico o su un vetro diapositiva per la colorazione. Se necessario, recuperare il sangue filtrato all'uscita del sangue utilizzando una punta di pipetta da un millilitro.
I cfDNA estratti sono stati valutati utilizzando Bioanalyzer e i nastri dello schermo cfDNA sono stati utilizzati insieme a una scala elettronica. La linea verde è stata utilizzata per allineare la scala e il campione. I segni del triangolo indicano la banda del DNA.
La maggior parte del cfDNA ha una lunghezza di 166 coppie di basi e alcune esistono in multipli interi di lunghezza. Di solito, la concentrazione di cfDNA misura fino alle dimensioni di 50-700 coppie di basi. Sebbene ci sia una differenza nella quantità ottenuta da ogni singolo campione, come 8,47 nanogrammi per millilitro e 5,2 nanogrammi per millilitro, i risultati dell'estrazione del cfDNA sono stati buoni sia per la concentrazione che per la distribuzione delle dimensioni in tutti i casi.
Questi risultati indicano che il metodo LBx 1 separa accuratamente il plasma contenente cfDNA. In FAST-auto, la membrana è stata rimossa e colorata con anticorpi fluorescenti per rilevare CTC e globuli bianchi. La membrana colorata, posta su vetrini, è stata osservata al microscopio a fluorescenza.
Dopo la colorazione della membrana, le cellule mostrano segnali DAPI o positivi nucleari in blu, mentre EpCAM e CK o CTC positivi sono evidenziati in verde e CD45 o WBC positivi sono evidenziati in rosso. Non è difficile rimuovere la membrana. Tuttavia, è necessario fare attenzione alla perdita e alla contaminazione dei CTC.
Sangue intero, PBMC e buffy coat sono tutti disponibili. Invece, devi solo impostare l'intero volume. Possono essere utilizzati anche altri liquidi, anche se saranno necessari test.
Questa tecnica può essere utilizzata direttamente negli ospedali e la sostanza può essere ottenuta rapidamente.
