הפרוטוקול שלנו ידידותי למשתמש. באמצעות טכניקה זו, כל אחד יכול בקלות לבודד רכיב מן הדם. ניתן למזער את הזיהום ולהפריד חומרים בצורה מדויקת.
עם אוטומציה והקמת פרוטוקול זה, חוקרים יכולים להשיג בקלות חומרים הקשורים לסרטן עם טוהר גבוה, אשר מועיל עבור מחקרים שונים במורד הזרם. בפרט, הוא צפוי לספק יתרונות חשובים למחקר משתמשי הקצה. מי שידגים את ההליך שלהם יהיה ג'יי ג'ונג, חוקר בכיר ועוזר מנהל במכון לחקר הגנומיקה של הסרטן.
כדי להתחיל, טען את מחסנית LBx 1 על-ידי בחירת סוג המחסנית בלוח מסך המגע של המכשיר. לחץ על לחצן החץ כדי לשנות את מספר הדוגמאות. לאחר מכן, פתח את דלת המכשיר והכנס את כל המחסניות לשימוש לפי סדר המספר על מחזיק המחסנית.
לקבלת ארבע מחסניות בסך הכל, הנח את מחסנית הדמה בשטח הריק של מחזיק המחסנית. השתמש בגלגל התמיכה כדי להרכיב את המחסנית ולהדק את אום הנעילה כדי לאבטח אותה. סגור את הדלת ולחץ על לחצן ההפעלה במסך לוח המגע.
המכשיר סוגר את השסתומים במחסניות דבר שאורך כ-30 שניות. עקוב אחר ההודעה כדי לפתוח את הדלת. הסר את גלגל התמיכה והסר את המחסנית הסגורה באמצעות שסתום ממחזיק המחסנית.
פיפטה מקסימום של 10 מיליליטר של דגימת דם שלמה באמצעות פיפטה סרולוגית. הכנס את קצה הפיפטה עמוק לתוך פתח הדגימה של המחסנית, והזריק באיטיות את כל דגימת הדם. לאחר הכנסת המחסניות למכשיר, סגור את דלת המכשיר ולחץ על כפתור אישור.
פרווה פלזמה ובאפי מופרדים באופן אוטומטי מדם שלם, אשר לוקח בערך 30 דקות. לאחר הפרדת הפלזמה ומעיל הבאפי, תופיע הודעה על המסך מלווה בצליל אזעקה. עצור את האזעקה על-ידי פתיחת הדלת או לחיצה על לחצן העצירה.
פתח את הדלת. הסר את המחסנית והנח אותה על השולחן. לשחזר שלושה מיליליטר של פלזמה מן מוצא פלזמה באמצעות קצה פיפטה של מיליליטר אחד.
לאחר מכן, החזירו שלושה מיליליטרים של ציפוי באפי משקע מעיל באפי באמצעות קצה פיפטה של מיליליטר אחד. לאחר מכן, טען את מחסנית LBx 2 על ידי בחירת שם המחסנית בלוח מסך המגע של המכשיר. לחץ על לחצן החץ כדי לשנות את מספר הדוגמאות ובצע את אותו הליך המוצג עבור מחסנית LBx 1 כדי להכניס את המחסנית למחזיק המחסנית.
לאחר הכנסת המחסנית וסגירת הדלת, לחץ על לחצן ההפעלה במסך לוח המגע. בצע את ההליך שהוצג קודם לכן כדי להסיר את המחסנית הסגורה באמצעות שסתום ממחזיק המחסנית ולהניח אותה על השולחן. פיפטה את תמיסת גרדיאנט הצפיפות באמצעות פיפטה סרולוגית.
הכנס את קצה הפיפטה עמוק לתוך הכניסה של המחסנית ולהזריק לאט את התמיסה. לאחר מכן, פיפטה את כל דגימת הדם ולהזריק אותה באיטיות לתוך פתח הדגימה. לאחר הכנסה ואבטחה של המחסנית, סגור את הדלת ולחץ על כפתור אישור.
לאחר שהפלזמה וה- PBMC מופרדים באופן אוטומטי מדם שלם, תופיע הודעה המלווה בצליל אזעקה. פתח את הדלת והסר את המחסנית. לשחזר שלושה מיליליטר של פלזמה מן מוצא פלזמה באמצעות קצה פיפטה של מיליליטר אחד, ולאחר מכן, לשחזר שלושה מיליליטר של PBMC מן מוצא PBMC.
באופן דומה, עבור מחסנית FAST-auto, לאחר הסרת המחסנית הסגורה בשסתום ממחזיק המחסנית, הזרקת שישה מיליליטר של פתרון PBS לכניסת PBS של המחסנית. לאחר מכן, פיפטה שלושה מיליליטר של דם שלם או מעיל באפי שהתקבלו LBx 1, או דגימת PBMC המתקבלת LBx 2, ולאט לאט להזריק את הדגימה לתוך פתח הדגימה של המחסנית. לאחר הכנסת המחסנית ואבטחתה, סגור את הדלת ולחץ על כפתור אישור.
לאחר השלמת ההעשרה האוטומטית של CTCs, הפסק את האזעקה. הסר את המחסנית והכנס את מסיר הלוח האחורי, או BPR, לארבעת החורים בחזית המחסנית. לחץ על הכנף הכחולה כהה עם האגודלים של שתי הידיים ולאחר מכן, לחץ על הגוף הכחול בהיר עד שהוא לוחץ.
הסר בזהירות את גוף המחסנית על ידי הרמתו. בעדינות רבה, להרים את קרום המסנן על ידי הקצה באמצעות פינצטה, ומניחים את הממברנה לתוך צינור 1.5 מיליליטר להכנת חומצת גרעין, או על זכוכית שקופית עבור מכתים. במידת הצורך, לשחזר את הדם מסונן לשקע הדם באמצעות קצה פיפטה של מיליליטר אחד.
ה-cfDNAs שחולצו הוערכו באמצעות Bioanalyzer, וקלטות מסך cfDNA שימשו יחד עם סולם אלקטרוני. הקו הירוק שימש ליישור הסולם והמדגם. סימני המשולש מציינים את רצועת הדנ"א.
לרוב cfDNA יש אורך של 166 זוגות בסיסים וחלקם קיימים בכפולות שלמות של אורך. בדרך כלל, הריכוז של cfDNA מודד עד גודל של 50 עד 700 זוגות בסיסים. למרות שיש הבדל בכמות המתקבלת מכל דגימה בודדת, כגון 8.47 ננוגרם למיליליטר, ו-5.2 ננוגרם למיליליטר, התוצאות של מיצוי cfDNA היו טובות הן לריכוז והן לחלוקת הגודל בכל המקרים.
תוצאות אלה מצביעות על כך ששיטת LBx 1 מפרידה במדויק בין פלזמה המכילה cfDNA. ב-FAST-auto, הממברנה הוסרה והוכתמה בנוגדנים פלואורסצנטיים כדי לזהות CTCs ותאי דם לבנים. הממברנה המוכתמת, שהונחה על שקופיות זכוכית, נצפתה תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי.
לאחר צביעת הממברנה, תאים מראים DAPI או אותות חיוביים גרעיניים בכחול, בעוד EpCAM ו- CK או CTCs חיוביים מודגשים בירוק, ו- CD45 או WBC חיובי מודגשים באדום. זה לא קשה להסיר את הממברנה. עם זאת, יש צורך להיזהר על אובדן וזיהום של CTCs.
דם שלם, PBMC ומעיל באפי זמינים כולם. במקום זאת, אתה רק צריך להגדיר את עוצמת הקול כולה. ניתן להשתמש גם בנוזלים אחרים, אם כי יידרשו בדיקות.
טכניקה זו יכולה להיות מופעלת ישירות בבתי חולים ואת החומר ניתן להשיג במהירות.
