Esta abordagem pode ser usada em modelos de sistema celular de estresse do retículo endoplasmático, manipulando a expressão molecular de componentes de pares a jusante. A principal vantagem desta técnica é remover o impacto da sinalização emparelhada pela visualização e medição das vias neurais. Este método pode contribuir para a compreensão da base molecular da transição entre as fases aguda e crônica do estresse do RE em diversos modelos de doenças neurodegenerativas, além da gangliosidose GM2 Para começar, disseque o tecido sob uma lupa 20X com duas pinças de ponta fina número cinco, separando o córtex frontal das meninges.
Transfira o córtex frontal para um tubo cônico de 15 mililitros e incube o tecido com três a quatro mililitros de tripsina EDTA por 15 minutos a 37 graus Celsius para digestão química. Depois disso, lave-o três vezes com solução salina de Hank livre de íons de cálcio e magnésio e 0,1% de glicose. Dissociar mecanicamente o tecido 10 vezes pipetando para cima e para baixo usando uma ponta de 1.000 microlitros em DMEM mais 10% FCS.
Centrifugar o homogeneizado a 100 G durante um minuto, recolher o sobrenadante e completar o volume restante em 1 000 microlitros. Chapear a suspensão celular em placas de cultura celular a uma densidade de 520 células por milímetro quadrado com dois mililitros de DMEM contendo 10% FCS, 1% de estreptomicina de penicilina e 1% de um aditivo de aminoácidos essenciais. Incubar a 37 graus Celsius em um ambiente umidificado com 5% de dióxido de carbono por duas horas.
Para permitir a diferenciação de células neurais, mude o meio para um meio neurobasal livre de soro com o suplemento sem soro. Mantenha as culturas a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono até o tratamento. Para o recozimento, misture dois oligonucleotídeos de fita simples com sequências complementares em quantidades molares iguais.
Aqueça a 95 graus Celsius por dois minutos. Transferir as amostras do bloco de calor e diluir o produto resultante para uma concentração final de 0,5 micromolar. Para clonar o shRNA inserir no vetor lentiviral pLKO.
3G, digerir um micrograma do vetor com as enzimas de restrição EcoR1 e PAC1. Misture suavemente por pipetagem e incube a reação por três a quatro horas a 37 graus Celsius. Para ligadura, misture o vetor digerido e insira-o em uma proporção molar de 3:1.
Incube-o com a ligase T4 e o tampão ligase durante a noite a 16 graus Celsius. Em seguida, misture o componente E.coli com o volume total da reação de ligadura e resfrie-o no gelo por 15 minutos. Coloque-o em um banho de 42 graus Celsius por dois minutos e, em seguida, esfrie no gelo novamente por 15 minutos.
Transfira o volume total submetido ao choque térmico para um tubo de 15 mililitros e complete o volume para 1.000 microlitros com Luria-Bertani, ou meio líquido L-B. Agite as bactérias por 90 minutos de 37 graus Celsius em um agitador orbital a aproximadamente 330 RPM. Centrífuga que atendeu a 5.000 G por cinco minutos a quatro graus Celsius.
Descarte 900 microlitros do sobrenadante e use o sobrenadante restante para ressuspender o pellet. Espalhe a suspensão de bactérias uniformemente sobre uma placa sólida de ampicilina L-B e incube por 37 graus Celsius durante a noite. Escolha uma única colônia para transferir para um tubo de 15 mililitros com 10 mililitros de meio líquido L-B e ampicilina.
Agitar as bactérias a 37 graus Celsius a aproximadamente 330 RPM e centrifugar a cultura para peletizar as bactérias a 5.000 G por cinco minutos a quatro graus Celsius. Depois de descartar o sobrenadante, conserve o pellet bacteriano a menos 20 graus Celsius. 24 horas antes da transfecção, semeie de 1 a 5 milhões de células HEK-293 em placas de cultura de 100 milímetros.
Misture 14 microgramas de pKLO. Vetor 3G com uma inserção específica, 10,5 microgramas de psPAX plasmídeo de embalagem e 3,5 microgramas de plasmídeo de envelope pMD2. G.Diluir 45 microlitros de reagente de transfecção plasmídica em 700 microlitros de meio sérico reduzido e incubar durante cinco minutos à temperatura ambiente.
Em seguida, combine a mistura de DNA com o reagente de transfecção de plasmídeo diluído, misture suavemente e incube por 20 minutos à temperatura ambiente. Altere o meio da placa de cultura das células HEK-293 com um meio fresco após a transfecção e adicione todo o volume da solução de DNA gota a gota. Agite o prato suavemente e incube as células a 37 graus Celsius, 5% de dióxido de carbono por 48 a 72 horas para permitir que os shRNAs atinjam sua transdução ideal.
Recolha o meio com lentivírus e guarde a quatro graus Celsius. Filtre o sobrenadante viral com uma membrana de nylon de 0,45 micrômetro e alíquota de um milímetro do fluxo. Centrífuga a 17.000 G por quatro horas.
Descarte o sobrenadante e conserve o pellet. Deixe o pellet invisível secar e, uma vez seco, armazene a menos 80 graus Celsius. Infectar as culturas de neurônios corticais primários com oligonucleotídeos específicos de shRNA, visando as UTRs de três primos da calcineurina A-alfa ou CHOP e incubá-las a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono por um dia.
Em seguida, adicionar a solução-estoque de GM2 ao meio do prato de cultura a uma concentração final de dois micromolares e incubar a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono por 16, 24 e 48 horas. Fixar as células com 4%paraformaldeído e sacarose 120 milimolares em PBS durante 20 minutos a 37 graus Celsius e depois lavá-las com PBS. Adicionar solução de permeabilização por cinco minutos e lavar com PBS.
Use BSA a 5% diluído em PBS por 45 minutos para permitir o bloqueio. Em seguida, incubar com o anticorpo anti-MAP2 a quatro graus Celsius durante a noite. Depois de lavar as células duas vezes com PBS no final do tempo de incubação, incubar com um anticorpo secundário por uma hora.
Monte os copos depois de lavar as células com PBS. Após a obtenção das imagens com um microscópio invertido de epifluorescência, carregue a imagem para obter ImageJ e subtraia o fundo clicando em Processo seguido de Subtrair Fundo. Clique em Imagem, Ajustar, Limite para ajustar os valores mínimos, permitindo que o caminho e alguns traçados sejam distinguíveis.
Exclua somas usando a seleção à mão livre. Selecione Rastreamentos e clique em Editar, Seleção, Criar Seleção. Obtenha o ROI clicando nas teclas de controle e T da seleção e conserve-o.
Abra a imagem original. Clique no painel Gerenciador de ROI e selecione o ROI inicial. Em seguida, clique na imagem original.
Uma vez que o ROI rastreia na imagem, pressione controle e as teclas M para processar a análise estatística. Uma tentativa foi feita aqui para verificar se o silenciamento de componentes a jusante do 2pERK afeta a fase de transição da resposta proteica desdobrada no modelo de células de estresse ER. O gene A-alfa da calcineurina e o gene CHOP foram silenciados por duas sequências específicas de shRNA em uma cultura primária de células de neurônios por um dia.
A expressão é analisada por Western blotting. Observa-se uma clara inibição do aumento do nível de calcineurina A-alfa mediado por estresse do RE e do nível de CHOP nas células knockdown. A possível ligação do estresse do RE induzido pelo acúmulo de GM2 com a degeneração neuronal foi examinada através da realização de imunocoloração MAP2 de culturas neuronais primárias.
A atrofia dos neuritos aumenta significativamente após a indução do estresse do RE pela incubação de GM2 em 16 a 48 horas. O silenciamento da expressão de calcineurina A-alfa aumenta significativamente a atrofia dos neuritos, particularmente às 16 horas de acumulação de GM2 em relação aos grupos GM2 não tratados. Assim, o knockdown da calcineurina A-alfa acelerou o processo de degeneração nos neurônios, corroborando o efeito pró-sobrevivência da calcineurina durante a fase inicial da resposta proteica desdobrada.
Por outro lado, o knockdown do CHOP resultou em atrofia de neurite significativamente diminuída em relação aos controles precisamente em 16 a 24 horas. o protocolo celular com a cultura de células primárias adequada e a obtenção de 90 ou mais porcentagens de células infectadas com o respectivo lentivírus. Como a perda do axônio terminal neural é o primeiro passo que estabelecemos em nosso processo, também é possível avaliar isso realizando um ensaio.
Esta técnica permite que o nosso grupo e outros avaliem algumas moléculas como potenciais ferramentas terapêuticas.
