Modulation moléculaire par des shRNAs spécifiques délivrés par lentivirus dans des neurones stressés par le réticulum endoplasmique

Cette approche peut être utilisée dans les modèles de système cellulaire de stress du réticulum endoplasmique en manipulant l’expression moléculaire des composants de paires en aval. Le principal avantage de cette technique est de supprimer l’impact de la signalisation appariée par la visualisation et la mesure des voies neuronales. Cette méthode peut contribuer à comprendre la base moléculaire de la transition entre les phases aiguës et chroniques du stress des urgences dans divers modèles de maladies neurodégénératives en plus de la gangliosidose GM2. Pour commencer, disséquez le tissu sous une loupe 20X avec deux pinces à pointe fine numéro cinq, séparant le cortex frontal des méninges.

Transférer le cortex frontal dans un tube conique de 15 millilitres et incuber le tissu avec trois à quatre millilitres de trypsine EDTA pendant 15 minutes à 37 degrés Celsius pour la digestion chimique. Après cela, lavez-le trois fois avec la solution saline équilibrée de Hank sans ions calcium magnésium et 0,1% de glucose. Dissocier mécaniquement le tissu 10 fois en pipetant de haut en bas à l’aide d’une pointe de 1 000 microlitres en DMEM plus 10% FCS.

Centrifuger l’homogénat à 100 G pendant une minute, recueillir le surnageant et compléter le volume restant en 1 000 microlitres. Plaquer la suspension cellulaire sur des boîtes de culture cellulaire à une densité de 520 cellules par millimètre carré avec deux millilitres de DMEM contenant 10% FCS, 1% de pénicilline streptomycine et 1% d’un additif d’acide aminé essentiel. Incuber à 37 degrés Celsius dans un environnement humidifié avec 5% de dioxyde de carbone pendant deux heures.

Pour permettre la différenciation des cellules neurales, changez le milieu pour un milieu neurobasal sans sérum avec le supplément sans sérum. Conserver les cultures à 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone jusqu’au traitement. Pour le recuit, mélanger deux oligonucléotides simple brin avec des séquences complémentaires en quantités molaires égales.

Chauffer à 95 degrés Celsius pendant deux minutes. Transférer les échantillons du bloc thermique et diluer le produit obtenu à une concentration finale de 0,5 micromolaire. Pour cloner l’insert shRNA dans le vecteur lentiviral pLKO.

3G, digérer un microgramme du vecteur avec les enzymes de restriction EcoR1 et PAC1. Mélanger doucement en pipetant et incuber la réaction pendant trois à quatre heures à 37 degrés Celsius. Pour la ligature, mélanger le vecteur digéré et l’insérer dans un rapport molaire de 3:1.

Incuber avec la ligase T4 et le tampon ligase pendant la nuit à 16 degrés Celsius. Ensuite, mélangez le composant E. coli avec le volume total de la réaction de ligature et refroidissez-le sur de la glace pendant 15 minutes. Placez-le dans un bain de 42 degrés Celsius pendant deux minutes, puis refroidissez-le à nouveau sur de la glace pendant 15 minutes.

Transférer le volume total soumis au choc thermique dans un tube de 15 millilitres et compléter le volume à 1 000 microlitres avec Luria-Bertani, ou milieu liquide L-B. Secouez les bactéries pendant 90 minutes à 37 degrés Celsius dans un agitateur orbital à environ 330 tr / min. Centrifugeuse qui a rencontré 5 000 G pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius.

Jetez 900 microlitres du surnageant et utilisez le surnageant restant pour remettre la pastille en suspension. Répartir la suspension de bactéries uniformément sur une plaque solide d’ampicilline L-B et incuber à 37 degrés Celsius pendant la nuit. Choisissez une seule colonie à transférer dans un tube de 15 millilitres avec 10 millilitres de milieu liquide L-B et d’ampicilline.

Agiter les bactéries à 37 degrés Celsius à environ 330 RPM et centrifuger la culture pour granuler les bactéries à 5 000 G pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius. Après avoir jeté le surnageant, conservez la pastille bactérienne à moins 20 degrés Celsius. 24 heures avant la transfection, ensemencer 1 à 5 millions de cellules HEK-293 dans des boîtes de culture de 100 millimètres.

Mélanger 14 microgrammes de pKLO. Vecteur 3G avec insert spécifique, 10,5 microgrammes de plasmide d’emballage psPAX et 3,5 microgrammes de plasmide d’enveloppe pMD2. G.Diluer 45 microlitres de réactif de transfection plasmidique dans 700 microlitres de milieu sérique réduit et incuber pendant cinq minutes à température ambiante.

Ensuite, combinez le mélange d’ADN avec le réactif de transfection plasmidique dilué, mélangez doucement et incuber pendant 20 minutes à température ambiante. Changez le milieu de la boîte de culture des cellules HEK-293 avec un milieu frais après la transfection et ajoutez tout le volume de la solution d’ADN goutte à goutte. Balancez doucement le plat et incuber les cellules à 37 degrés Celsius, 5% de dioxyde de carbone pendant 48 à 72 heures pour permettre aux shRNA d’atteindre leur transduction optimale.

Recueillir le milieu avec le lentivirus et conserver à quatre degrés Celsius. Filtrer le surnageant viral avec une membrane en nylon de 0,45 micromètre et aliquoter un millimètre de l’écoulement. Centrifuger à 17 000 g pendant quatre heures.

Jeter le surnageant et conserver la pastille. Laissez sécher la pastille invisible et, une fois séchée, stockez-la à moins 80 degrés Celsius. Infectez les cultures de neurones corticaux primaires avec des oligonucléotides shRNA spécifiques, ciblant les trois UTR premiers de la calcineurine A-alpha ou CHOP et les incuber à 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone pendant une journée.

Après cela, ajoutez la solution mère de GM2 au milieu de la boîte de culture à une concentration finale de deux micromolaires et incuber à 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone pendant 16, 24 et 48 heures. Fixez les cellules avec 4% de paraformaldéhyde et de saccharose 120 millimolaires dans du PBS pendant 20 minutes à 37 degrés Celsius, puis lavez-les avec du PBS. Ajouter la solution de perméabilisation pendant cinq minutes et laver avec du PBS.

Utilisez 5% de BSA dilué dans du PBS pendant 45 minutes pour permettre le blocage. Ensuite, incuber avec l’anticorps anti-MAP2 à quatre degrés Celsius pendant la nuit. Après avoir lavé les cellules deux fois avec du PBS à la fin du temps d’incubation, incuber avec un anticorps secondaire pendant une heure.

Montez les lunettes après avoir lavé les cellules avec PBS. Après avoir obtenu les images avec un microscope inversé à épifluorescence, chargez l’image pour obtenir ImageJ et soustrayez l’arrière-plan en cliquant sur Processus suivi de Soustraire l’arrière-plan. Cliquez sur Image, Ajuster, Seuil pour ajuster les valeurs minimales, ce qui permet de distinguer le chemin et certains tracés.

Supprimez les somas à l’aide de la sélection à main levée. Sélectionnez Traces et cliquez sur Modifier, Sélection, Créer une sélection. Obtenez le ROI en cliquant sur les touches Contrôle et T de la sélection et conservez-le.

Ouvrez l’image d’origine. Cliquez sur le panneau ROI Manager et sélectionnez le ROI de début. Cliquez ensuite sur l’image originale.

Une fois le retour sur investissement tracé sur l’image, appuyez sur les touches Contrôle et M pour traiter l’analyse statistique. Une tentative a été faite ici pour vérifier si le silençage des composants en aval de 2pERK affecte la phase de transition de la réponse protéique dépliée dans le modèle de cellule de stress ER. Le gène A-alpha de la calcineurine et le gène CHOP ont été réduits au silence par deux séquences spécifiques d’ARNh dans une culture cellulaire de neurones primaires pendant une journée.

L’expression est analysée par Western blotting. Une inhibition claire est observée de la calcineurine A-alpha médiée par le stress ER et une augmentation du niveau de CHOP dans les cellules knockdown. Le lien possible entre le stress ER induit par l’accumulation de GM2 et la dégénérescence neuronale a été examiné en effectuant une immunocoloration MAP2 de cultures neuronales primaires.

L’atrophie des neurites augmente significativement après avoir induit un stress aux urgences par incubation de GM2 entre 16 et 48 heures. Le silençage de l’expression de la calcineurine A-alpha améliore significativement l’atrophie des neurites, en particulier à 16 heures d’accumulation de GM2 par rapport aux groupes GM2 non traités. Ainsi, la calcineurine A-alpha knockdown a accéléré le processus de dégénérescence dans les neurones, corroborant l’effet pro-survie de la calcineurine au cours de la phase précoce de la réponse protéique déployée.

Inversement, CHOP knockdown a entraîné une diminution significative de l’atrophie des neurites par rapport aux témoins précisément à 16 à 24 heures. le protocole cellulaire avec la culture cellulaire primaire appropriée et l’obtention de 90 ou plus pourcentage de cellules infectées avec le lentivirus respectif. Comme la perte de l’axone terminal neuronal est la première étape que nous présentons dans notre processus, il est également possible d’évaluer cela en effectuant un test.

Cette technique permet à notre groupe et à d’autres d’évaluer certaines molécules comme outils thérapeutiques potentiels.