Evidências crescentes sugerem o impacto da sinalização de estrogênio na parte colonia da fisiologia, a imunohistoquímica é uma técnica promissora para identificar receptores de estrogênio no cólon e eles evoluem para colite. Apresentamos um protocolo completo e validado para visualização imunohistoquímica de receptores de estrogênio no cólon, utilizando imunofluorescência. Juntamente com a Dra.
Coloque o cólon em uma placa de petri. Corte o cólon em fragmentos de um a dois centímetros. Coloque cada fragmento em uma esponja em um histológico apropriadamente rotulado.
Coloque um contendo um fragmento de cólon em 4% de paraformaldeído. Incubar por pelo menos 24 horas a quatro graus celsius. Prepare e programe o processador de tecidos para uma hora de incubação em 50%70%90%95% e 100% etanol, xileno 100% etanol e apenas xileno, bem como por pelo menos três horas de incubação em parafina líquida.
Transfira o fragmento do cólon para uma caixa histológica. Coloque a caixa no processador de tecido pré-programado e execute o processador. Após a incubação no processador de tecido, remova o cólon da caixa histológica e coloque o fragmento do cólon em um molde de metal, de tal forma que as duas extremidades do cólon estejam em uma posição vertical.
Encha um terço do molde com parafina líquida. Coloque o molde na área de resfriamento a menos cinco graus celsius por alguns segundos e, em seguida, mova o molde para a área de aquecimento a 70 graus celsius. Em seguida, coloque o molde na parte inferior da caixa histológica e cubra todo o fragmento de cólon com parafina líquida.
Coloque o molde metálico contendo o fragmento do cólon e a parafina na área de resfriamento por alguns minutos. Em seguida, remova o molde de metal do bloco de cólon e parafina. Incubar o bloco de cólon e parafina por pelo menos 24 horas a quatro graus celsius.
Após a incubação, remova o excesso de parafina do bloco. Insira o bloco de cólon e parafina em um microtoma rotativo totalmente automatizado. Corte o fragmento do cólon em cinco seções de micrômetros.
Transfira uma seção de cólon para um banho de água, pré-aquecido a 40 graus celsius. Use o slide de vidro rotulado para remover a seção do cólon do banho de água e incubar o escorregador de vidro à temperatura ambiente por 24 horas. Primeiro, remova a parafina incubando o deslizamento de vidro no xileno por cinco minutos.
Repita este passo três vezes. Em seguida, coloque o deslizamento de vidro em uma mistura de xileno e 100% etanol por cinco minutos. Repita este passo três vezes.
Use uma série de concentrações de etanol diminuindo para reidratar a seção do cólon. Mergulhe o deslizamento no etanol por cinco minutos. Repita três vezes em cada concentração antes de prosseguir para a próxima concentração.
Enxágüe o deslizamento de vidro em água corrente por cinco minutos. Reaqueça o tampão de recuperação de antígeno a 95 a 98 graus celsius. Em seguida, aqueça o deslizamento de vidro na solução de recuperação de antígeno fervente por 10 minutos.
Para evitar desperdícios de reagentes, use uma caneta hidrofóbica para desenhar um círculo ao redor da seção de cólon. Em seguida, incubar o slide por 10 minutos em uma solução de 3% de peroxidase de hidrogênio e água. Lave o slide na solução de lavagem por cinco minutos.
Em seguida, incubar o slide na solução de bloqueio por uma hora à temperatura ambiente. Remova a solução de bloqueio e adicione 20 a 50 microliters de anticorpo primário contra E-R alfa, E-R beta ou G-P-E-R diluídos. Incubar o anticorpo primário durante a noite a quatro graus celsius na escuridão.
Remova a solução de anticorpos. Lave o slide três vezes na solução de lavagem por cinco minutos cada vez. Em seguida, adicione anticorpo secundário diluído.
Incubar o slide com anticorpo secundário conjugado com corante por uma hora à temperatura ambiente na escuridão. Remova a solução de anticorpos secundários do slide. Lave o slide três vezes na solução de lavagem por cinco minutos cada vez.
Adicione fluorocromo diluído para visualização de membrana e incubar por 10 minutos à temperatura ambiente na escuridão. Remova a solução e lave o slide três vezes na solução de lavagem por cinco minutos cada vez. Adicione algumas gotas de DAPI líquido à base de glicerol, um fluorocromo para visualização de núcleos celulares, diretamente na seção de cólon.
Cubra-o cuidadosamente com um slide de cobertura. Incubar a seção de cólon por pelo menos 24 horas a quatro graus celsius. Analise a seção de cólon sob um microscópio confocal com objetivos de 20x ou 63x e imersão em óleo.
A especificidade dos anticorpos utilizados no estudo foi validada utilizando células MCF-7. Os anticorpos do receptor de estrogênio permitiram a detecção dos receptores nucleares de estrogênio E-R alfa e E-R beta, bem como o receptor de estrogênio ligado à membrana G-P-E-R. Também foi realizado um controle negativo no qual as células MCF-7 foram manchadas apenas com anticorpo secundário conjugado com fluorocromo e líquido à base de glicerol com DAPI.
Um forte sinal citoplasmado de E-R alfa foi encontrado nas seções de cólon obtidas a partir de ratos de controle e de camundongos com doença de Crohn induzida pelo TNBS. No entanto, apenas os cólons obtidos a partir de camundongos de controle tinham E-R alfa localizado no citoplasma de células de cálice. A microscopia confocal também revelou a localização citoplasmática do beta E-R nas seções de cólon tanto do controle quanto dos camundongos tratados com TNBS.
Da mesma forma, a localização citoplasmática do G-P-E-R foi documentada nas seções de cólon obtidas a partir de camundongos de controle e camundongos tratados com TNBS. O posicionamento correto do cólon no molde é essencial para gerar a seção transversal correta. Fluorocromo deve ser selecionado por seu próprio espectro de excitação e emissão.
Este método também pode ser aplicado a outras proteínas que possam estar envolvidas no desenvolvimento de colites. A detecção de imunohistoquímica por imunofluorescência pode ser estendida para manchar outras proteínas no status de direção proteína-proteína.
