L’évidence croissante suggère l’impact de la signalisation d’oestrogène sur la partie colonique de la physiologie, l’immunohistochimie est une technique prometteuse pour identifier des récepteurs d’oestrogène dans le côlon et ils évoluent dans la colite. Nous présentons un protocole complet et validé pour la visualisation immunohistochimique des récepteurs d’oestrogène dans le côlon, utilisant l’immunofluorescence. En collaboration avec le Dr Sylwia Michlewska du Laboratoire d’imagerie microscopique de l’Université de Lodz, nous démontrerons la procédure.
Placer le côlon dans une boîte de Pétri. Couper le côlon en fragments d’un à deux centimètres. Placez chaque fragment sur une éponge dans une cassette histologique dûment étiquetée.
Placer une cassette contenant un fragment de côlon dans 4% de paraformaldéhyde. Incuber pendant au moins 24 heures à quatre degrés Celsius. Préparer et programmer le traitement tissulaire pour une heure d’incubation dans 50%70%90%95%et 100% éthanol, xylène 100% éthanol, et xylène seulement, ainsi que pour au moins trois heures d’incubation dans la paraffine liquide.
Transférer le fragment du côlon dans une boîte histologique. Placez la boîte dans le processeur de tissu préprogrammé et exécutez le processeur. Après incubation dans le processeur de tissu enlever le côlon de la boîte histologique et placer le fragment du côlon dans un moule métallique, de sorte que les deux extrémités du côlon sont en position verticale.
Remplir un tiers du moule de paraffine liquide. Placez le moule dans la zone de refroidissement à moins cinq degrés Celsius pendant quelques secondes, puis déplacez le moule vers la zone de réchauffement à 70 degrés Celsius. Ensuite, placez le moule dans la partie inférieure de la boîte histologique et couvrez le fragment entier du côlon avec de la paraffine liquide.
Placez le moule métallique contenant le fragment du côlon et la paraffine dans la zone de refroidissement pendant quelques minutes. Retirez ensuite le moule métallique du côlon et du bloc de paraffine. Incuber le bloc du côlon et de la paraffine pendant au moins 24 heures à quatre degrés Celsius.
Après l’incubation, retirer l’excès de paraffine du bloc. Insérez le bloc du côlon et de la paraffine dans une microtome rotative entièrement automatisée. Couper le fragment du côlon en cinq sections de micromètres.
Transférer une section du côlon dans un bain d’eau, préchauffé à 40 degrés Celsius. Utilisez la lame de verre étiquetée pour retirer la section du côlon du bain d’eau et incuber la glissade de verre à température ambiante pendant 24 heures. Tout d’abord, retirer la paraffine en incubant la lame de verre en xylène pendant cinq minutes.
Répétez cette étape trois fois. Ensuite, placez la glissade en verre dans un mélange de xylène et 100% d’éthanol pendant cinq minutes. Répétez cette étape trois fois.
Utilisez une série de concentrations décroissantes d’éthanol pour réhydrater la section du côlon. Plonger la glissade dans l’éthanol pendant cinq minutes. Répéter trois fois à chaque concentration avant de passer à la concentration suivante.
Rincer la glissade de verre sous l’eau courante pendant cinq minutes. Réchauffer le tampon de récupération de l’antigène à 95 à 98 degrés Celsius. Chauffer ensuite la glissade de verre dans la solution de récupération d’antigène bouillante pendant 10 minutes.
Pour éviter le gaspillage de rééconts, utilisez un stylo hydrophobe pour dessiner un cercle autour de la section du côlon. Ensuite, incubez la lame pendant 10 minutes dans une solution de 3% de peroxyde d’hydrogène et d’eau. Lavez la lame dans la solution de lavage pendant cinq minutes.
Puis incuber la glissière dans la solution de blocage pendant une heure à température ambiante. Retirez la solution de blocage et ajoutez 20 à 50 microlitres d’anticorps primaires contre l’alpha E-R, la bêta E-R ou le G-P-E-R dilué. Incuber l’anticorps primaire pendant la nuit à quatre degrés Celsius dans l’obscurité.
Retirez la solution anticorps. Lavez la lame trois fois dans la solution de lavage pendant cinq minutes à chaque fois. Ensuite, ajoutez des anticorps secondaires dilués.
Incuber la lame avec un anticorps secondaire conjugué à du colorant pendant une heure à température ambiante dans l’obscurité. Retirez la solution d’anticorps secondaire de la lame. Lavez la lame trois fois dans la solution de lavage pendant cinq minutes à chaque fois.
Ajouter le fluorochrome dilué pour la visualisation membranaire et incuber pendant 10 minutes à température ambiante dans l’obscurité. Retirez la solution et lavez la lame trois fois dans la solution de lavage pendant cinq minutes à chaque fois. Ajoutez quelques gouttes de DAPI liquide à base de glycérol, un fluorochrome pour la visualisation des noyaux cellulaires, directement sur la section du côlon.
Couvrez-le soigneusement avec une diapositive de couverture. Incuber la section du côlon pendant au moins 24 heures à quatre degrés Celsius. Analyser la section du côlon au microscope confocal avec des objectifs 20x ou 63x et immersion d’huile.
La spécificité des anticorps utilisés dans l’étude a été validée à l’aide de cellules MCF-7. Les anticorps de récepteur d’oestrogène ont permis la détection des récepteurs nucléaires d’oestrogène E-R alpha et bêta d’E-R aussi bien que le récepteur membrane-lié d’oestrogène G-P-E-R. Un contrôle négatif a également été exécuté dans lequel les cellules de MCF-7 ont été souillées seulement avec l’anticorps secondaire conjugué avec le fluorochrome et un liquide glycérol-basé avec DAPI.
Un signal cytoplasmique fort de l’alpha d’E-R a été trouvé dans les sections de deux points obtenues des souris témoins et des souris avec TNBS-induits Crohn' la maladie de s. Cependant, seuls les colons obtenus à partir de souris témoins avaient E-R alpha localisé dans le cytoplasme des cellules gobelet. La microscopie confoccale a également indiqué la localisation cytoplasmique de la bêta d’E-R dans les sections de deux points des souris témoins et des souris TNBS-traitées.
De même, la localisation cytoplasmique de G-P-E-R a été documentée dans les sections du côlon obtenues à partir de souris témoins et de souris traitées au TNBS. Le positionnement correct du côlon dans le moule est essentiel pour générer la section transversale correcte. Fluorochrome doit être sélectionné par son propre spectre d’excitation et d’émission.
Cette méthode peut également être appliquée à d’autres protéines qui peuvent être impliquées dans le développement de la colite. La détection de l’immunohistochimie par immunofluorescence peut être étendue pour tacher d’autres protéines dans l’état de direction protéine-protéine.
