Zunehmende Beweise deuten darauf hin, dass die Auswirkungen der Östrogen-Signalisierung auf den kolonischen Teil der Physiologie, Immunhistochemie ist eine vielversprechende Technik zur Identifizierung von Östrogen-Rezeptoren im Dickdarm und sie entwickeln sich zu Kolitis. Wir präsentieren ein vollständiges und validiertes Protokoll zur immunhistochemischen Visualisierung von Östrogenrezeptoren im Dickdarm unter Verwendung von Immunfluoreszenz. Gemeinsam mit Dr.Sylwia Michlewska vom Labor für Mikroskopische Bildgebung der Universität Lodz werden wir das Verfahren demonstrieren.
Legen Sie den Doppelpunkt in eine Petrischale. Schneiden Sie den Doppelpunkt in ein bis zwei Zentimeter Fragmente. Legen Sie jedes Fragment auf einen Schwamm in einer entsprechend beschrifteten histologischen Kassette.
Legen Sie eine Kassette mit einem Dickdarmfragment in 4%Paraformaldehyd. Mindestens 24 Stunden bei vier Grad Celsius inkubieren. Bereiten Und programmieren Sie den Gewebeprozessor nur für eine Stunde Inkubation in 50%70%90%95% und 100%ethanol, Xylol 100% Ethanol und Xylol sowie für mindestens drei Stunden Inkubation in flüssigem Paraffin.
Übertragen Sie das Doppelpunktfragment in eine histologische Box. Legen Sie die Box in den vorprogrammierten Tissueprozessor und führen Sie den Prozessor aus. Nach der Inkubation im Gewebeprozessor entfernen Sie den Dickdarm aus der histologischen Box und legen Sie das Doppelpunktfragment in eine Metallform, so dass sich die beiden Enden des Dickdarms in einer aufrechten Position befinden.
Füllen Sie ein Drittel der Form mit flüssigem Paraffin. Legen Sie die Form im Kühlbereich bei minus fünf Grad Celsius für ein paar Sekunden und bewegen Sie die Form dann in den Wärmebereich bei 70 Grad Celsius. Legen Sie dann die Form in den unteren Teil der histologischen Box und bedecken Sie das gesamte Dickdarmfragment mit flüssigem Paraffin.
Legen Sie die Metallform mit dem Dickdarmfragment und Paraffin für ein paar Minuten in den Kühlbereich. Dann entfernen Sie die Metallform aus dem Doppelpunkt und Paraffinblock. Inkubieren Sie den Dickdarm- und Paraffinblock für mindestens 24 Stunden bei vier Grad Celsius.
Entfernen Sie nach der Inkubation überschüssiges Paraffin aus dem Block. Setzen Sie den Dickdarm- und Paraffinblock in ein vollautomatisches Rotationsmikrotom ein. Schneiden Sie das Doppelpunktfragment in fünf Mikrometerabschnitte.
Übertragen Sie einen Dickdarmabschnitt in ein Wasserbad, vorgewärmt auf 40 Grad Celsius. Verwenden Sie die beschriftete Glasrutsche, um den Doppelpunktabschnitt aus dem Wasserbad zu entfernen und die Glasrutsche 24 Stunden lang bei Raumtemperatur zu bebrüten. Entfernen Sie zunächst das Paraffin, indem Sie die Glasrutsche fünf Minuten lang in Xylol brüten.
Wiederholen Sie diesen Schritt dreimal. Dann die Glasrutsche fünf Minuten lang in eine Eins-zu-Eins-Mischung aus Xylol und 100%Ethanol geben. Wiederholen Sie diesen Schritt dreimal.
Verwenden Sie eine Reihe von abnehmenden Ethanolkonzentrationen, um den Dickdarmabschnitt zu rehydrieren. Tauchen Sie die Rutsche für fünf Minuten in das Ethanol ein. Wiederholen Sie dies dreimal bei jeder Konzentration, bevor Sie zur nächsten Konzentration übergehen.
Spülen Sie die Glasrutsche fünf Minuten lang unter fließendem Wasser. Den Antigen-Abrufpuffer auf 95 bis 98 Grad Celsius aufheizen. Dann erhitzen Sie die Glasrutsche in kochender Antigen-Retrieval-Lösung für 10 Minuten.
Um die Verschwendung von Reagenzien zu vermeiden, verwenden Sie einen hydrophoben Stift, um einen Kreis um den Dickdarmabschnitt zu ziehen. Dann inkubieren Sie die Rutsche für 10 Minuten in einer 3%-Lösung von Wasserstoffperoxidase und Wasser. Waschen Sie die Rutsche in Waschlösung für fünf Minuten.
Dann inkubieren Sie die Rutsche in Blockierlösung für eine Stunde bei Raumtemperatur. Entfernen Sie die Blockierlösung und fügen Sie 20 bis 50 Mikroliter Primärantikörper gegen E-R alpha, E-R beta oder G-P-E-R verdünnt hinzu. Inkubieren Sie den primären Antikörper über Nacht bei vier Grad Celsius in der Dunkelheit.
Entfernen Sie die Antikörperlösung. Waschen Sie die Rutsche dreimal in Waschlösung für jeweils fünf Minuten. Als Nächstes fügen Sie verdünnten sekundären Antikörper hinzu.
Inkubieren Sie die Rutsche mit sekundärem Antikörper, der bei Raumtemperatur bei Dunkelheit eine Stunde lang mit Farbstoff konjugiert ist. Entfernen Sie die sekundäre Antikörperlösung aus der Folie. Waschen Sie die Rutsche dreimal in Waschlösung für jeweils fünf Minuten.
Fügen Sie verdünntes Fluorchrom zur Membranvisualisierung hinzu und brüten Sie 10 Minuten bei Raumtemperatur bei Dunkelheit. Entfernen Sie die Lösung und waschen Sie die Rutsche dreimal in Waschlösung für jeweils fünf Minuten. Fügen Sie ein paar Tropfen Glyzerin-basierte flüssige DAPI, ein Fluorchrom für die Visualisierung von Zellkernen, direkt auf dem Doppelpunktabschnitt hinzu.
Bedecken Sie es sorgfältig mit einem Deckelschlitten. Inkubieren Sie den Dickdarmabschnitt für mindestens 24 Stunden bei vier Grad Celsius. Analysieren Sie den Dickdarmbereich unter einem konfokalen Mikroskop mit 20x oder 63x Objektiven und Öleintauchen.
Die Spezifität der in der Studie verwendeten Antikörper wurde mit MCF-7-Zellen validiert. Die Östrogen-Rezeptor-Antikörper ermöglichten den Nachweis von kernnuklearen Östrogen-Rezeptoren E-R alpha und E-R Beta sowie der membrangebundene Östrogen-Rezeptor G-P-E-R. Eine negative Kontrolle wurde auch durchgeführt, bei der MCF-7-Zellen nur mit sekundären Antikörpern, die mit Fluorchrom konjugiert waren, und einer Flüssigflüssigkeit auf Glycerinbasis mit DAPI gefärbt wurden.
Ein starkes zytoplasmatisches Signal von E-R alpha wurde in den Dickdarmabschnitten gefunden, die von Kontrollmäusen und von Mäusen mit TNBS-induzierter Morbus Crohn gewonnen wurden. Allerdings hatten nur die Doppelpunkte, die von Kontrollmäusen erhalten wurden, E-R alpha lokalisiert im Kelchenzellzytoplasma. Die konfokale Mikroskopie zeigte auch die zytoplasmatische Lokalisation von E-R Beta in den Dickdarmabschnitten sowohl der Kontrolle als auch der MittBS behandelten Mäuse.
In ähnlicher Weise wurde die zytoplasmatische Lokalisation von G-P-E-R in den Dickdarmabschnitten dokumentiert, die von Kontrollmäusen und den mit TNBS behandelten Mäusen gewonnen wurden. Die korrekte Positionierung des Doppelpunkts in der Form ist wichtig, um den richtigen Querschnitt zu erzeugen. Fluorchrom sollte durch sein eigenes Anregungs- und Emissionsspektrum ausgewählt werden.
Diese Methode kann auch auf andere Proteine angewendet werden, die an der Entwicklung von Kolitis beteiligt sein können. Der Immunhistochemie-Nachweis durch Immunfluoreszenz kann erweitert werden, um andere Proteine im Protein-Protein-Richtungsstatus zu färben.
