O protocolo aqui descrito mede a eferócitose do macrófago pulmonar após a exposição a um critério de ozônio poluente atmosférico. Esses dados indicam que a exposição ao ozônio diminui a eferócitose do macrófago alveolar e, portanto, pode ser um mecanismo para que os níveis elevados de ozônio aumentem a incidência de doenças pulmonares. A principal vantagem dessa técnica é que ela permite uma avaliação in vivo da eferócitose do macrófago alveolar sem qualquer manipulação ex vivo dos macrófagos que possam alterar seu fenótipo ou função.
Esta técnica revelou um novo mecanismo pelo qual o pulmão não pode se reparar após a exposição à poluição do ar. Além disso, essa técnica pode revelar novos caminhos para alvos que alteram a eferocisose no pulmão. Este método pode ser aplicado a qualquer modelo de lesão pulmonar ou inflamação.
No entanto, o usuário precisará otimizar quando for melhor avaliar a eferocitose após lesão pulmonar. Realizar a aspiração orofaríngea pode ser tecnicamente desafiador. Eu aconselharia trabalhar com sua equipe veterinária para ter certeza de que você otimize sua técnica para realizar este procedimento.
Comece por cultivar células Jurkat T em cultura celular basal meio complementado de acordo com as direções do manuscrito a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. As células Jurkat T são uma linha de célula suspensa que pode ser mantida através da passagem para a mídia de cultivo pré-aquecida a cada três dias. Prepare as células apoptóticas, aumentando-as para 90% de confluência, o que leva de três a quatro dias após a passagem.
Cultivar células em cinco frascos T75 para obter um número suficiente de células para este protocolo. Uma vez que as células estejam prontas, aspire o conteúdo do frasco em cerca de 24 mililitros e transfira-os para um tubo cônico de 50 mililitros. Conte as células usando manchas trypan blue e um hemócito.
Pelotar as células por centrifugação a 271 vezes g por cinco minutos e descartar o supernasce. Então, resuspende as células na mídia para obter três milhões de células por mililitro. Alíquotar as células em 100 por 20 milímetros pratos de cultura tecidual transferindo cinco mililitros de células por prato.
Prepare aproximadamente nove pratos de cultura. Coloque um prato de lado como um controle não exposto e exponha os pratos restantes ao UV. Defina o crosslinker UV para o nível de energia correto pressionando o botão de energia e digitando 600 com a almofada numégrafa. Irradie todos os pratos com as células, exceto o controle, certificando-se de remover a tampa superior do prato de cultura tecidual durante a exposição uv.
Em seguida, incubar todos os pratos em uma incubadora de cultura celular a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por quatro horas. Após a incubação, misture todas as células irradiadas em um tubo cônico de 50 mililitros e pelota-as por centrifugação a 271 vezes g por cinco minutos. Descarte o supernatante e resuspenque as células em 24 mililitros de PBS estéreis.
Centrifugar o tubo novamente e remover o supernaspeso. Prepare as células para dosagem de camundongos, reutilizando-as na PBS na concentração apropriada. Uma vez que o mouse esteja devidamente anestesiado, coloque-o em uma posição supina semi-reclinável.
Use corda cirúrgica amarrada entre pinos em uma placa de acrílico inclinada para suspender o rato pelos incisivos maxilares. Use um par de fórceps sem cristais para agarrar levemente e puxar a língua do rato e incutir as células apoptóticas na cavidade oral com uma pipeta P200. A dosagem é bem sucedida quando os ratos fazem um barulho de estalo de um a dois segundos depois de receber a dose.
Com um dedo enluvado, cubra delicadamente o nariz do mouse até que inale enquanto a língua estiver retraída. Mantenha o nariz coberto até que nenhum líquido seja visível na cavidade oral e o rato tenha tomado duas ou mais inalações. Remova o rato da placa de inoculação e devolva-o à gaiola para permitir que ele se recupere da anestesia, certificando-se de colocar o rato nas costas para evitar que os detritos bloqueiem as nares.
Depois de todos os camundongos terem acordado da anestesia, espere 90 minutos para permitir que macrófagos alveolares engulam o fluxo de células apoptóticas. Para coletar fluido de lavage, prepare o rato eutanizado de acordo com as instruções do manuscrito. Empurre lentamente o PBS para os pulmões permitindo que eles inflem, em seguida, puxe o mesmo volume de volta certificando-se de que o PBS não está saindo das narinas.
Colete o lavage agrupado de cada rato em um tubo de 15 mililitros. Centrifugar a lavagem broncoalveolar ou BAL a 610 vezes g por seis minutos a quatro graus Celsius, coletar o supernatante em um tubo de 1,5 mililitro, e congelá-lo a menos 80 graus Celsius. A pelota representa as células do espaço broncoalveolar.
Adicione um mililitro de tampão de lise de glóbulos vermelhos ACK à pelota para remover os glóbulos vermelhos residuais. Vórtice e lise por um minuto no gelo, em seguida, adicione quatro mililitros de PBS para parar a reação de lise. Centrifugar as células a 610 vezes g por seis minutos a quatro graus Celsius e aspirar o supernaente com um aspirador de vácuo.
Em seguida, resuspende as células em um mililitro de PBS com 10% de FBS e conte as células em um hemótmetro sem Trypan Blue. Centrifugar 120 microliters de cada amostra em slides a 12 vezes g por três minutos usando aceleração média e um cytocentrifuge. Deixe os slides secarem durante a noite.
No dia seguinte, manche os slides com hematoxilina e eosina, a fim de calcular tanto a contagem de células eferocíticas quanto diferenciais. Em seguida, veja slides sob uma configuração Brightfield em um microscópio biológico usando um objetivo 20X ou 40X. Calcule o índice eferocítico com base na razão de macrófagos alveolares que phagocytosed células Jurkat T apoptóticas para macrófagos alveolares sem absorção celular apoptótica certificando-se de contar pelo menos 200 células de cada slide.
Este protocolo foi usado para investigar o efeito da exposição ao ozônio na inflamação pulmonar. Os camundongos expostos ao ozônio apresentaram um aumento de macrófagos e neutrófilos no espaço aéreo em comparação com o grupo de controle de ar filtrado e tiveram um aumento na proteína BAL, um marcador de disfunção epitelial alveolar. Antes da dosagem dos camundongos, a apoptose nas células Jurkat T foi confirmada com citometria de fluxo.
O nível de exposição UV de 60 mili joule e o tempo de incubação de quatro horas resultaram em resultados repetitivos de aproximadamente 75% das células apoptóticas. Macrófagos eferóticos foram identificados como macrófagos que haviam engolido uma célula Jurkat T em comparação com macrófagos alveolares regulares. Houve uma diminuição significativa no índice eferocítico do grupo exposto ao ozônio em comparação com os controles de ar filtrados, o que indica que a inflamação pulmonar induzida pelo ozônio está associada à diminuição do despejo de células apoptóticas.
Atenção aos detalhes e a anotação de quaisquer diferenças observadas é fundamental durante este procedimento. Também é recomendado cegar as amostras para análise e ter duas pessoas diferentes que contam os macrófagos. Após o isolamento, as células BAL podem ser usadas para análise de mRNA, manchadas para marcadores adicionais por imunofluorescência e/ou executadas em um citômetro de fluxo para distinguir alterações fenotípicas.
