Name: assessing anti-fungal activity of isolated alveolar macrophages by confocal microscopy
Uploaded: 2014-07-09T21:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 4 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assessing Anti-fungal Activity of Isolated Alveolar Macrophages by Confocal Microscopy at JoVE.com

Este trabalho foi financiado pelo Instituto Nacional de Alergia e Doenças Infecciosas Grant R01AI079253 (a BHS) e pelo Instituto Nacional do Câncer Cancer Center Suporte Grant CA016056 para Roswell Park Cancer Institute.

Todos os procedimentos realizados em animais neste estudo foram aprovados pelo Comitê Animal Care e Use em Roswell Park Cancer Institute e cumpriu todo o estado, federal, e os Institutos Nacionais de Saúde regulamentos. 1. In vivo macrófago Labeling Nota: PHK26 é um corante lipofílico que serão absorvidos pelas células fagocíticas, tanto na circulação e nos tecidos quando administrados por via intravenosa (iv). PKH26 foi utilizado para a etiquetagem in vivo para minimizar a quantidade de manipulação pós-colheita do macrófago. PKH-26, tem a vantagem de estavelmente acumulação nos macrófagos alveolares ao longo de períodos prolongados. Esperar 10 dias após a administração permite a limpeza de todas as células marcadas de circulação, deixando apenas alveolar macrófagos estável rotulados com PKH26 8, 9. PKH26 é um fluorocromo vermelho que tem de excitação (551 nm) e emissão (567 nm) características compatíveiscom os sistemas de detecção de rodamina ou ficoeritrina. Qualquer procedimento rotulagem pode introduzir artefato, incluindo perda de viabilidade. No entanto, uma vez que usamos a mesma abordagem para a rotulagem de macrófagos em diferentes genótipos de mouse (por exemplo, WT vs NADPH oxidase com deficiência), os efeitos desses artefatos seria uniforme. <ol><li> Diluir solução estoque de PKH26 (1 x 10 -3 M em etanol) 1:05 em diluente C fornecido pelo fabricante. </li><li> Carga de 100 ul de PKH26 diluída para uma seringa de 1/2 ml de insulina (29 L x 1/2 &quot;) para cada rato. </li><li> Administrar aos ratos por injeção iv (ou veia da cauda ou retro orbital) pelo menos 10 dias antes da colheita. </li></ol> 2. Colheita de macrófagos alveolares de Lavagem Broncoalveolar (BAL) O número de ratos para usar para uma experiência pode variar. Um rendimento típico de um ratinho não estimulado é na gama de 3-5 x 10 5 macrófagos alveolares, no entanto, este número pode variar muito based em fatores como o tamanho do mouse, a experiência da pessoa que realiza a lavagem, eo número de injeções de fluido de lavagem eo volume retirado dos pulmões. Neste protocolo de lavagem pulmonar foi realizada com uma cavidade torácica fechada, que, juntamente com a repetidas lavagens de 1 ml ajuda a aumentar o rendimento das células. <ol><li> Eutanásia rato por administração de uma dose letal de anestésico avertina (12,5 mg) por via intraperitoneal (ip) usando condições assépticas para manter a solução estéril. </li><li> Spray de rato cuidadosamente com etanol a 70%. </li><li> Remover a pele a partir da extremidade craniana animal expondo o tórax (Figura 1A). <ol><li> Faça um pequeno corte na pele logo abaixo do diafragma. </li><li> Inserir o dedo dentro do corte e puxe a pele para longe da extremidade craniana do animal (Figura 1A). </li><li> Empurre-se ligeiramente sobre a cabeça, estendendo-se o lado ventral do pescoço (Figura 1A). </li></ol></li><li> Corte um pequeno buraco através da caixa torácicano lado direito do tórax para esvaziar os pulmões e também permitir a visualização dos pulmões durante as etapas seguintes. </li><li> Localize a traquéia e dissecar cuidadosamente o tecido circundante. <ol><li> Retire as glândulas salivares, músculos esterno hioideo e laringe, etc com uma pinça curva. </li><li> Retire cuidadosamente com uma pinça curva e cortar com uma tesoura o tecido fino que cobre a traquéia (adventícia) revelando a estrutura da cartilagem rodeado subjacente. </li></ol></li><li> Inserção do cateter na traqueia. <ol><li> Usando pinças curvas, colocar uma sutura de trás (dorsal) da traqueia e puxar uma 10 cm de comprimento através da abertura. </li><li> Começando acima da cricóide (o anel engrossado da cartilagem) guiar cuidadosamente um cateter 22 G até a traquéia parar onde a traquéia desaparece por trás do esterno. </li><li> Firmemente amarrar sutura em torno de traquéia e cateter para um ajuste confortável. Remova a agulha do cateter. </li></ol></li><li> Monte 4-way torneira. <ol><li> Preencherum 6 ml seringa com DPBS, 1% de FBS e anexar a 4-way torneira, como indicado na Figura 1B. </li><li> Anexar um vazio 6 ml de seringa na posição indicada na torneira de 4 vias (Figura 1B). </li><li> Anexar porta aberta no 4-way torneira de cateter (Figura 1B). Tenha cuidado para não desalojar cateter de traquéia. </li></ol></li><li> Recolha do fluido de lavagem dos pulmões. Nota: Os investigadores podem optar por utilizar menores volumes de fluido de lavagem para minimizar a possibilidade de danos para o tecido. É importante que a mesma abordagem pode ser aplicada de forma consistente em todos os grupos de ratos. <ol><li> Gire a alça da torneira para que a seringa vazia é fechado e injecte lentamente DPBS ~ 1 ml, 1% FBS para inflar os pulmões. Observe a inflação do pulmão através do buraco cortado no passo 2.4. </li><li> Tenha cuidado para não overinflate os pulmões. </li><li> Gire a alça da torneira para que a seringa cheia está fechado, e retire cuidadosamente a gripe<html> ID a partir dos pulmões. </li><li> Observe os pulmões esvaziar através do buraco cortado no passo 1.4. O cateter pode precisar ser movido ligeiramente para trás ou para frente para conseguir um bom empate. Tomar precauções especiais para manter o cateter no interior da traqueia. </li><li> Repita os passos 2.8.1-2.8.4 5-6x, até todo o DPBS, 1% de FBS foi injectado e retirado dos pulmões. Nota: recuperação do líquido do pulmão não será 100% do líquido injetado. </li></ol></li><li> Seringa vazia com lavado em um tubo cônico de 50 ml. Manter as células à temperatura ambiente. </li><li> Sedimentar as células por centrifugação a 300 xg durante 5 min à temperatura ambiente e deitar fora o sobrenadante. Isto pode ser guardado para análise de citocina, se desejado. </li><li> Ressuspender as células em 1-5 mL de meio RPMI 1640 com FBS a 10% e contagem num hemocitómetro. No rato não estimuladas,&gt; 95% de células colhidas por BAL são esperados ser os macrófagos, o que pode ser confirmado por citologia. </li></ol> 3. Cultivo e colheita Fungo &quot;&gt; O Aspergillus fumigatus utilizado neste protocolo expressa GFP ao longo de todas as fases do seu ciclo de vida:. Esporos, germlings e hifas fúngicas Esta estirpe foi fornecido pelo Dr. Margo Moore, Simon Fraser University, Burnaby, BC, Canadá. <ol><li> Placa de conídios de uma estirpe de Aspergillus fumigatus expressando GFP em Sabouraud Brain Heart Infusion (BHI) ágar slants com cloranfenicol (0,05 g / L) e gentamicina (0,5 g / L). </li><li> Incubar no escuro vagamente tampado por 7 a 10 dias em temperatura ambiente. </li><li> Colheita conídios por inclinação lavagem com 10 ml de 0,01% de Tween 20 em DPBS. Levemente raspar o fungo com a stripette a afrouxar. Lavar a inclinação várias vezes para aumentar o rendimento. </li><li> Passar a suspensão de conídios por meio de um filtro de células de 100 um em uma cónico de 50 ml. </li><li> Pellet conídios por centrifugação a 400 xg durante 10 min. </li><li> Conídios Ressuspender em 50 ml DPBS e contar com um hemocitômetro. </li><li> Lavar duas vezes com DPBS e diluir a concentração desejadatração. </li></ol> 4. Fúngica Desafio e microscopia confocal Para investigar o papel dos macrófagos da NADPH-oxidase na defesa do hospedeiro, a capacidade dos macrófagos alveolares isoladas a partir de ratinhos de três genótipos para controlar o crescimento de esporos de Aspergillus fagocitose foi avaliada. Os genótipos utilizados neste estudo incluem; 1) ratinhos de tipo selvagem, 2) NCF1 * / * Mn-ratinhos com uma mutação de ocorrência natural NCF1 (NCF1 codifica para phox p47, um componente necessário do fagócito NADPH-oxidase), deixando-os de NADPH-oxidase deficiente, e 3) NCF1 * / * Mn + ratinhos transgénicos (MN indica o transgene abrigando NCF1 tipo selvagem sob o controlo do promotor de CD68 humano), onde a actividade da NADPH-oxidase foi reconstituído na população de monócitos / macrófagos 10, 11. A microscopia confocal é o mais adequado para este ensaio, devido à presençae crescimento de conídios não fagocitados nas lâminas. O microscópio confocal irá permitir a visualização de planos individuais dentro do eixo Z, e permitir a diferenciação entre o fungo cresce em torno, em vez de no interior de macrófagos. Todas as imagens confocal são adquiridos por meio de uma lente de imersão em óleo 63X. Z-stacks são adquiridos com um fator de zoom eletrônico de 2,5. A espessura de uma pilha de-Z é determinada utilizando DAPI e as imagens de campo brilhante para localizar a parte superior e inferior do campo. Z-stacks variou 14-24 mM com fatias individuais ~ 1 mm de espessura. Para a quantificação dos macrófagos, os exames individuais de zoom eletrônico 1X foram realizados em 10 campos por genótipo. Macrófagos intactas foram identificados com base na PKH26 e coloração DAPI da membrana e do núcleo, respectivamente. Os conídios foram identificados com base na imagem de campo claro expressão e FITC. <ol><li> Prepare lamelas e placas estéreis <ol><li> Debaixo de uma cabine de segurança biológica, mergulhe 22 x 22 mm lamínulas de vidro em 70% etanol por 5-10 min. </li><li> Lavar lamínulas em PBS estéril. </li><li> Utilizando fórceps estéreis, colocar suavemente uma única lamela no fundo de cada poço de uma estéril embalado individualmente placa de 6 poços. </li></ol></li><li> Semente de ~ 1 x 10 6 colhidas PKH26 marcado macrófagos alveolares em suspensão em 300 ul de RPMI 1640, FBS a 10% para cada lamela. O número exacto pode variar, dependendo do rendimento da colheita. </li><li> Permitir macrófagos para aderir por incubação a 37 ° C com 5% de CO 2 durante a noite. </li><li> Na manhã seguinte, adicionar 1 x 10 ~ 7-expressando GFP A. fumigatus conidia suspensa em 100 ul de pré-aquecido (37 ° C), meio RPMI 1640, 10% FBS. </li><li> Retornar placa a 37 ° C incubadora com 5% de CO 2. </li><li> As células devem ser fixados para um mínimo de 2 horas à temperatura ambiente ou durante a noite a 4 ° C. No 3, 7, e 14 hr fixar as células por adição de um volume igual de 2% de formaldeído a cada cavidade (concentração final de 1% de formaldeído). Coloque placas para aOs pontos de tempo iniciais, a 4 ° C durante a noite. Para o ponto de tempo final (14 horas), fixar as células à temperatura ambiente durante 2 horas. </li><li> Após a fixação, remover suavemente lamínulas usando uma pinça e enxaguar em DPBS. </li><li> Remover o excesso de líquido, colocando a extremidade da lamela em um Kimwipe dobrado. </li><li> Aplicar 6 mL de fluorescência meio de montagem com DAPI para uma lâmina de vidro. </li><li> Colocar uma extremidade da lamela sobre a lâmina e cair suavemente com o lado das células para baixo para o meio de montagem. Meio de montagem vai se espalhar e formar uma camada uniforme por baixo da lamela. Não há necessidade de pressionar na lamela. </li><li> Selar bordas da lamínula com clara unha polonês e deixar secar ao ar. </li><li> Loja preparados slides de uma caixa corrediça (protegido da luz) à temperatura ambiente até estar pronta para análise por microscopia confocal. </li></ol>

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Os autores não têm nada a revelar.

Utilizando esta abordagem de análise ex vivo da actividade antifúngica de macrófagos in vivo juntamente com o desafio de fungos, que anteriormente demonstrou que a NADPH oxidase nos macrófagos desempenha um papel importante na defesa contra A. fumigatus 4. A utilização de macrófagos alveolares isolados nos permite focar a sua actividade anti-fúngica, na ausência de outras células do sistema imune (por exemplo, recrutamento de neutrófilos) que protegem contra o Aspergillus in vivo. Várias estratégias de visualização têm sido usados ​​para avaliar a actividade anti-fúngica de macrófagos in vivo e ex vivo. Luther et al., Usou microscopia confocal para estudar a fagocitose de conídios por Aspergillus humana (colhida a partir de receptores de transplante de pulmão) e AMs de rato 12. Geunes-Boyer et al. caracteriza a interação entre Candida krusei e macrófagos murinos após a fagocitose. Elesutilizada uma linha de células de macrófagos, e RAW264.7 de macrófagos primários do peritoneu 13. Garcia-Rhodes et al. mostraram que o surfactante de proteína-D se liga e facilita a fagocitose e a sobrevivência de Cryptococcus neoformans 14. Ligação de SP-D, foi também investigada in vivo utilizando SP-D - / - murganhos intranasalmente inoculados com Alexa Fluor 488 marcado com C. neoformans. Após a lavagem do pulmão, AMs imunofluorescência foram etiquetadas e microscopia confocal foi utilizada para analisar a fagocitose. Macrófagos de diferentes locais anatómicos (por exemplo, alveolar, baço, peritoneal), gerados com diferentes estímulos (por exemplo, tioglicolato de elicitação de diferenciação ou em vitro), ou a partir de linhas celulares (por exemplo, RAW264.7) pode ter dramaticamente diferentes respostas anti-microbianos e inflamatórias 15 - 18. Portanto, para modelar mais de perto a resposta do hospedeiro à diversão inaladogi, usamos macrófagos alveolares colhidas por lavagem broncoalveolar de camundongos não estimuladas imediatamente após o sacrifício. Inicialmente, utilizaram imagens ao vivo de células para avaliar a atividade antifúngica de macrófagos 4. Macrófagos alveolares foram colocadas em lâminas de vidro, em seguida semeado com septadas expressando GFP Aspergillus. Após 3 h, os conídios não fagocitados foram removidas por lavagem suave para permitir a visualização desobstruída de conídios fagocitado. A germinação dos conídios foi então monitorado por imagem time-lapse em intervalos de 30 min usando imagens de luz brilhantes para visualizar macrófagos e GFP fluorescência para visualizar fungos. Este método tem a vantagem de aquisição de imagens sequenciais da mesma cultura de células primárias. No entanto, a tendência para o macrófago para migrar através do campo de visão durante a fase de aquisição permitiu uma avaliação qualitativa, em vez de uma avaliação quantitativa da actividade conidiocidal. Outra desvantagem de geração de imagens de células vivas é tele a falta de clareza e detalhes como as células se movem dentro e fora do plano de foco. Para obter imagens com maior detalhe, escolheu microscopia confocal que permite a reconstrução de estruturas tridimensionais a partir de imagens obtidas. A reconstrução tridimensional dá a capacidade de diferenciar entre hifas em torno, em vez de em ou através de um macrófago. Com essa capacidade de ver as células e fungos em três dimensões, a remoção de conídios não fagocitado em 3 horas já não é um passo necessário. Os conídios também pode ser justamente distinguido como intracelular contra extracelular. Para uma melhor visualização, macrófagos alveolares foram rotulados in vivo com PKH26. Este corante fluorescente tem uma cauda alifática longa, que incorpora de forma estável nas regiões lipídicas das membranas celulares. Quando injectado por via intravenosa, este corante lipofílico é tomado pelas células fagocíticas, tanto na corrente sanguínea e nos tecidos. Após 10 dias, labefagócitos liderados são eliminados da circulação murino e permanecer apenas nos tecidos 9, permitindo a recolha de já rotulado macrófagos alveolares por BAL. Com a utilização in vivo da rotulagem, a manipulação de pós-colheita de macrófagos alveolares é minimizado. Outra vantagem do presente protocolo é a utilização de um expressando GFP-A. fumigatus tensão. Este fungo expressa GFP a partir da fase de conídios através da fase de hifas e não tem necessidade de uma maior coloração. Com dupla coloração de macrófagos e Aspergillus, somos capazes de identificar conídios fagocitado. Um fator limitante neste protocolo é o rendimento dos macrófagos do BAL. Um rendimento típico de um ratinho não estimulado é na gama de 3-5 x 10 5 macrófagos alveolares, no entanto, este número pode variar de acordo com factores tais como o tamanho do animal, a experiência da pessoa que realiza a lavagem, e o número de instilações de gripe lavagemid eo volume retirado dos pulmões. Neste protocolo, a lavagem pulmonar foi realizada com uma cavidade torácica fechada, que, juntamente com instilações repetidas de 1 ml contribui para aumentar o rendimento de células quando comparado com uma cavidade torácica aberta e menos instilações. Números de ratinho também pode ser aumentada para aumentar o rendimento da colheita.

Macrófagos alveolares são as células fagocíticas de primeira linha que encontram micróbios inalados. Os macrófagos reconhecem motivos Aspergillus por receptores de reconhecimento de patógenos, ingerir e limitar o crescimento de esporos inalados (conídios), e iniciar as respostas inflamatórias. A NADPH oxidase de fagócitos converte oxigênio molecular ao ânion superóxido e intermediários reativas de oxigênio a jusante (ROIs). A doença granulomatosa crônica (CGD) é uma desordem hereditária do sistema NADPH oxidase caracterizada por infecções bacterianas e fúngicas graves e por respostas inflamatórias excessivas. Apesar de NADPH-oxidase é crítica para a defesa do hospedeiro mediada pelos neutrófilos 1-3, a importância da NADPH-oxidase em macrófagos não está bem definido. Estudos anteriores mostraram que os macrófagos alveolares ingerir e matar os esporos de Aspergillus, enquanto que os neutrófilos como alvo principalmente o estágio de hifas 5. No entanto, tem havido resul conflitantests quanto ao papel da NADPH-oxidase em macrófagos para controlar o crescimento de A. fumigatus esporos 6, 7. O objetivo deste método foi delinear o papel específico da NADPH oxidase em macrófagos na mediação de defesa do hospedeiro contra A. esporos fumigatus. Descobrimos que a NADPH oxidase de macrófagos alveolares controla o crescimento de A. fagocitado fumigatus esporos 4. Para modelar mais de perto a resposta do hospedeiro a fungos inalados, usamos macrófagos alveolares colhidas por lavagem broncoalveolar de camundongos não estimuladas imediatamente após o sacrifício. O uso de macrófagos alveolares isolados nos permitiu concentrar em sua atividade antifúngica, na ausência de outras células do sistema imunológico (por exemplo, neutrófilos recrutados) que defendem contra Aspergillus in vivo. Neste método, os macrófagos alveolares foram coradas in vivo antes da colheita de modo a minimizar a quantidade de manipulação de pós-colheita. &lt;/ P&gt; Outra vantagem do presente protocolo é a utilização de um expressando GFP-A. fumigatus tensão. Este fungo expressa GFP a partir da fase de conídios através da fase de hifas e não tem necessidade de uma maior coloração. Para obter imagens com maior detalhe, escolhemos microscopia confocal que permite a reconstrução de estruturas tridimensionais a partir de imagens obtidas. A reconstrução tridimensional dá a capacidade de diferenciar entre hifas em torno, em vez de em ou através de um macrófago. Os conídios também pode ser justamente distinguido como intracelular contra extracelular.

<table><tbody><tr><td>PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit for General Cell Membrane Labeling</td><td>Sigma</td><td>PKH26GL-1KT</td><td></td></tr><tr><td>2,2,2 Tribromoethanol</td><td>Sigma</td><td>T48402</td><td>Used to make AvertinAnesthetic</td></tr><tr><td>2-methyl-2-butanol</td><td>Sigma</td><td>A-1685</td><td>Used to make AvertinAnesthetic</td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;#039;s Phosphate Buffered Saline (without calcium and magnesium)</td><td>Corning</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>NH&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;Cl</td><td>Sigma</td><td>A0171</td><td>Used to make ACK red cell lysis buffer</td></tr><tr><td>KHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>P91444</td><td>Used to make ACK red cell lysis buffer</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>E6758</td><td>Used to make ACK red cell lysis buffer</td></tr><tr><td>22 G x 1.00 inch i.v. catheter</td><td>BD</td><td>381523</td><td>Insyte Autoguard Winged</td></tr><tr><td>Insulin syringes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>6 ml Syringes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>4-way stopcock</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-700-077</td><td></td></tr><tr><td>Suture thread</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 ml conical centrifuge tubes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>gauze sponges (4 inch square)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 with L-glutamine</td><td>Corning</td><td>10-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Hyclone</td><td>SH30396.03</td><td>heat inactivated</td></tr><tr><td>Hema 3 Stain Set</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-122-911</td><td></td></tr><tr><td>Cytoseal 60</td><td>Thermo Scientific</td><td>8310-4</td><td></td></tr><tr><td>Sabouraud Brain Heart Infusion Agar with Chloramphenicol and Gentamicin Slants</td><td>BD</td><td>297252</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Aspergillus fumigatous&lt;/em&gt; strain expressing green fluorescent protein</td><td></td><td></td><td>provided by Dr Margo Moore, Simon Fraser University, Burnaby, BC, Canada</td></tr><tr><td>100 &amp;mu;m Cell strainers</td><td>BD Falcon</td><td>64753-00</td><td></td></tr><tr><td>Scissors</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Forceps</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Biological Safety Cabinet Class II</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sorval ST40 Centrifuge with swing bucket rotor</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leica DM1000 light microscope</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hemocytometer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cytospin 2 centrifuge</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cell culture incubator</td><td></td><td></td><td>37 &amp;deg;C, 5%&amp;nbsp; CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td></tr><tr><td>22 x 22 mm micro cover glass</td><td>VWR</td><td>48366-227</td><td>glass coverslips</td></tr><tr><td>6-well Cell culture plates</td><td>Corning</td><td>3506</td><td></td></tr><tr><td>10% Neutral Buffered Formalin</td><td>VWR</td><td>BDH0502-1LP</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield mounting medium with DAPI</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>Leica TCS SP2 system with a laser point scanner</td><td></td><td></td><td>Mounted on DMIRE2 fluorescence microscope</td></tr></tbody></table>

assessing anti-fungal activity of isolated alveolar macrophages by confocal microscopy

O pulmão é uma interface em que as células hospedeiras são rotineiramente expostas a microorganismos e produtos microbianos. Macrófagos alveolares são células fagocíticas de primeira linha que encontram fungos inalados e outros micróbios. Os macrófagos e outras células do sistema imunológico reconhecem motivos Aspergillus por receptores de reconhecimento de patógenos e iniciar respostas inflamatórias a jusante. A NADPH oxidase de fagócitos gera intermediários reativas de oxigênio (ROIs) e é fundamental para a defesa do hospedeiro. Apesar de NADPH-oxidase é crítica para a defesa do hospedeiro mediada pelos neutrófilos 1-3, a importância da NADPH-oxidase em macrófagos não está bem definido. O objetivo deste estudo foi delinear o papel específico da NADPH oxidase em macrófagos na mediação de defesa do hospedeiro contra A. fumigatus. Descobrimos que a NADPH oxidase de macrófagos alveolares controla o crescimento de A. fagocitado fumigatus esporos 4. Aqui, descrevemos um método para avaliar a capacidade de um ratomacrófagos lveolar (AMS) para controlar o crescimento de esporos de Aspergillus fagocitados (conídios). Macrófagos alveolares são coradas in vivo e dez dias mais tarde isolado a partir de murganhos por lavagem broncoalveolar (BAL). Os macrófagos são semeadas em lamínulas de vidro, então semeado com a proteína verde fluorescente (GFP) expressando A. esporos fumigatus. Em momentos específicos, as células são fixadas e o número de macrófagos intactas com esporos fagocitados é avaliada por microscopia confocal.

<html> A recolha dos macrófagos alveolares pelo LBA de ratinhos não estimulados irá resultar numa população pura de&gt; 95% com base na citologia. A 3 e 7 horas (Figura 2) pontos de tempo preceder a fase de hifas de crescimento fúngico e permitir uma comparação da eficiência fagocítica de conídios entre genótipos. O ponto de tempo de 14 horas é onde genótipos pode ser comparado no que respeita à capacidade para inibir a passagem de conídios fagocitado para a fase de hifas tecido invasiva (Figura 3). Macrófago intacto pode ser identificado por microscopia confocal baseado em PKH26 e coloração DAPI da membrana e do núcleo, respectivamente (Figuras 2 e 3). Os conídios e as hifas são identificados com base na expressão de GFP (Figuras 2 e 3). iles/ftp_upload/51678/51678fig1.jpg &quot;/&gt; Figura 1. Anatomical direcionais Referências eo 4-Way torneira. A) As referências direcionais anatômicas para um mouse são mostrados. Craniana é na direcção da cabeça, enquanto caudal é na direcção da cauda. O lado ventral de um quadrúpede é em direção a barriga ou a superfície inferior do animal, enquanto o lado dorsal é para a parte traseira ou a superfície superior do animal. B) O 4-way torneira tem três conexões luer e um identificador que gira 360 ° para dirigir o fluxo de fluidos através da torneira. Colocação da seringa vazia, a seringa cheia eo cateter são indicados. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/51678/51678fig1highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver imagem ampliada.</a> <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51678/51678fig2highres.jpg" src = &quot;/ files/ftp_upload/51678/51678fig2.jpg&quot; /&gt; Figura 2. Fagocitose de A. esporos de A. fumigatus é semelhante entre os genótipos de 7 horas. Para avaliar a capacidade dos macrófagos alveolares isoladas com actividade da NADPH-oxidase para limitar o crescimento de conídios fagocitado, (A) de tipo selvagem, (B) NCF1 * / * Mn +, e (C NCF1) * / * Mn - ratos foram administrados iv PKH26. Macrófagos alveolares foram colhidas por BAL 10 dias mais tarde e semeadas com conídios de A.-expressando GFP fumigatus. As células foram fixadas em 3, 7, e 14 horas após a adição de conídios. No 3 (dados não mostrados) e 7 h, tanto o número total de macrófagos e macrófagos com ≥ 1 fagocitado conídios (setas) foram semelhantes entre os três genótipos, reflectindo a eficiência semelhante fagocitose. Macrófagos intactos são identificados com base em PKH26 (vermelho) e DAPI (azul) a coloração da membrana umanúcleos nd respectivamente. As imagens de fluorescência de um único plano-Z são sobrepostas à imagem de campo claro com. A imagem de campo brilhante consiste de luz transmitida através de toda a amostra e por isso, quando sobreposta sobre o Z-liso fluorescente permite a visualização de células e de conídios na totalidade Z-pilha. Barra de escala, 19 mM. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/51678/51678fig2highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver imagem ampliada.</a> <img alt="Figura 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51678/51678fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51678/51678fig3.jpg" /> Figura 3. Macrófago NADPH-oxidase é necessária para controlar o crescimento de A. . esporos de A. fumigatus de microscopia confocal de (A, D) de tipo selvagem, (B, E) NCF1 * / * Mn +, e (C, F) NCF1 * / * Mn - &lt;<html> / Sup&gt; macrófagos alveolares em 14 horas após a semeadura com GFP + A. fumigatus conídios. Macrófagos intactos são identificados com base em PKH26 (vermelho) e DAPI (azul) coloração das membranas e os núcleos, respectivamente. Setas sólidas mostram macrófagos intactas com pelo menos um conídios fagocitados e setas ocos apontam para hifas. Numerosos AMs com, pelo menos, um fagocitado conídios foram observados com * / * células do tipo selvagem e NCF1 Mn +, mas não com as células-oxidase deficiente NADPH. Sinal de GFP em hifas foi variável, com base no plano da imagem empilhados-z mostrado. AC) imagens de fluorescência de um único plano-Z a imagem de campo claro com permitir a visualização das células e hifas dentro de todo o Z-stack. DF) imagens de fluorescência a partir de um único plano Z, sem o fundo do campo luminoso de permitir a identificação de células, mas não a relação espacial das células e fungos em diferentes planos-Z. Barra de escala, 19 mM..jove.com/files/ftp_upload/51678/51678fig3highres.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; Clique aqui para ver imagem ampliada.

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Assessing Anti-fungal Activity of Isolated Alveolar Macrophages by Confocal Microscopy

Um método para avaliar a capacidade dos isolados macrófagos alveolares do rato para controlar o crescimento de esporos de Aspergillus fagocitados por microscopia confocal.

Avaliar a atividade anti-fúngica isolada de macrófagos alveolares por microscopia confocal

The lung is an interface where host cells are routinely exposed to microbes and microbial products. Alveolar macrophages are the first-line phagocytic ...

assessing-anti-fungal-activity-isolated-alveolar-macrophages-confocal

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

11.4K visualizações.  Roswell Park Cancer Institute.  Um método para avaliar a capacidade dos isolados macrófagos alveolares do rato para controlar o crescimento de esporos de Aspergillus fagocitados por microscopia confocal. 

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Harvesting Murine Alveolar Macrophages and Evaluating Cellular Activation Induced by Polyanhydride Nanoparticles

Biodegradable nanoparticles have emerged as a versatile platform for the design and implementation of new intranasal vaccines against respiratory infectious diseases. Specifically, polyanhydride nanoparticles composed of the aliphatic sebacic acid (SA), the aromatic 1,6-bis(p-carboxyphenoxy)hexane (CPH), or the amphiphilic 1,8-bis(p-carboxyphenoxy)-3,6-dioxaoctane (CPTEG) display unique bulk and surface erosion kinetics1,2 and can be exploited to slowly release functional biomolecules (e.g., protein antigens, immunoglobulins, etc.) in vivo3,4,5. These nanoparticles also possess intrinsic adjuvant activity, making them an excellent choice for a vaccine delivery platform6,7,8.
	In order to elucidate the mechanisms governing the activation of innate immunity following intranasal mucosal vaccination, one must evaluate the molecular and cellular responses of the antigen presenting cells (APCs) responsible for initiating immune responses. Dendritic cells are the principal APCs found in conducting airways, while alveolar macrophages (AM&#632;) predominate in the lung parenchyma9,10,11. AM&#632; are highly efficient in clearing the lungs of microbial pathogens and cell debris12,13. In addition, this cell type plays a valuable role in the transport of microbial antigens to the draining lymph nodes, which is an important first step in the initiation of an adaptive immune response9. AM&#632; also express elevated levels of innate pattern recognition and scavenger receptors, secrete pro-inflammatory mediators, and prime na&iuml;ve T cells12,14. A relatively pure population of AM&#632; (e.g., greater than 80%) can easily be obtained via lung lavage for study in the laboratory. Resident AM&#632; harvested from immune competent animals provide a representative phenotype of the macrophages that will encounter the particle-based vaccine in vivo. Herein, we describe the protocols used to harvest and culture AM&#632; from mice and examine the activation phenotype of the macrophages following treatment with polyanhydride nanoparticles in vitro.

Herein, we describe protocols for harvesting murine alveolar macrophages, which are resident innate immune cells in the lung, and examining their activation in response to co-culture with polyanhydride nanoparticles.

Colheita Murino macrófagos alveolares e Avaliação de ativação celular induzida por nanopartículas polianidrido

Biodegradable nanoparticles have emerged as a  versatile platform for the design and implementation of new intranasal vaccines  against respiratory ...

Bioengenharia

Live-cell Video Microscopy of Fungal Pathogen Phagocytosis

Phagocytic clearance of fungal pathogens, and microorganisms more generally, may be considered to consist of four distinct stages: (i) migration of phagocytes to the site where pathogens are located; (ii) recognition of pathogen-associated molecular patterns (PAMPs) through pattern recognition receptors (PRRs); (iii) engulfment of microorganisms bound to the phagocyte cell membrane, and (iv) processing of engulfed cells within maturing phagosomes and digestion of the ingested particle. Studies that assess phagocytosis in its entirety are informative1, 2, 3, 4, 5 but are limited in that they do not normally break the process down into migration, engulfment and phagosome maturation, which may be affected differentially. Furthermore, such studies assess uptake as a single event, rather than as a continuous dynamic process. We have recently developed advanced live-cell imaging technologies, and have combined these with genetic functional analysis of both pathogen and host cells to create a cross-disciplinary platform for the analysis of innate immune cell function and fungal pathogenesis. These studies have revealed novel aspects of phagocytosis that could only be observed using systematic temporal analysis of the molecular and cellular interactions between human phagocytes and fungal pathogens and infectious microorganisms more generally. For example, we have begun to define the following: (a) the components of the cell surface required for each stage of the process of recognition, engulfment and killing of fungal cells1, 6, 7, 8; (b) how surface geometry influences the efficiency of macrophage uptake and killing of yeast and hyphal cells7; and (c) how engulfment leads to alteration of the cell cycle and behavior of macrophages 9, 10.
In contrast to single time point snapshots, live-cell video microscopy enables a wide variety of host cells and pathogens to be studied as continuous sequences over lengthy time periods, providing spatial and temporal information on a broad range of dynamic processes, including cell migration, replication and vesicular trafficking. Here we describe in detail how to prepare host and fungal cells, and to conduct the video microscopy experiments. These methods can provide a user-guide for future studies with other phagocytes and microorganisms.

We describe methods for live-cell video microscopy of Candida albicans phagocytosis by macrophages. These methods enable stage-specific analysis of macrophage migration, recognition, engulfment and phagosome maturation and reveal novel aspects of phagocytosis.

Live-célula Microscopia vídeo de Fagocitose patógeno fúngico

Phagocytic clearance of fungal pathogens, and microorganisms more generally, may be considered to consist of four distinct stages: (i) migration of ...

Imunologia e Infecção

Use of Image Cytometry for Quantification of Pathogenic Fungi in Association with Host Cells

Studies of the cellular pathogenesis mechanisms of pathogenic yeasts such as Candida albicans, Histoplasma capsulatum, and Cryptococcus neoformans commonly employ infection of mammalian hosts or host cells (i.e. macrophages) followed by yeast quantification using colony forming unit analysis or flow cytometry. While colony forming unit enumeration has been the most commonly used method in the field, this technique has disadvantages and limitations, including slow growth of some fungal species on solid media and low and/or variable plating efficiencies, which is of particular concern when comparing growth of wild-type and mutant strains. Flow cytometry can provide rapid quantitative information regarding yeast viability, however, adoption of flow cytometric detection for pathogenic yeasts has been limited for a number of practical reasons including its high cost and biosafety considerations. Here, we demonstrate an image-based cytometric methodology using the Cellometer Vision (Nexcelom Bioscience, LLC) for the quantification of viable pathogenic yeasts in co-culture with macrophages. Our studies focus on detection of two human fungal pathogens: Histoplasma capsulatum and Candida albicans. H. capsulatum colonizes alveolar macrophages by replicating within the macrophage phagosome, and here, we quantitatively assess the growth of H. capsulatum yeasts in RAW 264.7 macrophages using acridine orange/propidium iodide staining in combination with image cytometry. Our method faithfully recapitulates growth trends as measured by traditional colony forming unit enumeration, but with significantly increased sensitivity. Additionally, we directly assess infection of live macrophages with a GFP-expressing strain of C. albicans. Our methodology offers a rapid, accurate, and economical means for detection and quantification of important human fungal pathogens in association with host cells.

Here, we demonstrate how image cytometry can be used for quantification of pathogenic fungi in association with host cells in culture. This technique can be used as an alternative to CFU enumeration.

Uso de Citometria de imagem para quantificação de fungos patogênicos em associação com células do hospedeiro

Studies of the cellular pathogenesis mechanisms of pathogenic yeasts such as Candida albicans, Histoplasma capsulatum, and Cryptococcus neoformans ...

Live Imaging of Antifungal Activity by Human Primary Neutrophils and Monocytes in Response to A. fumigatus

Aspergillus fumigatus is an opportunistic fungal pathogen causing invasive infections in immunocompromised hosts with a high case-fatality rate. Research investigating immunological responses against A. fumigatus has been limited by the lack of consistent and reliable assays for measuring the antifungal activity of specific immune cells in vitro. A new method is described to assess the antifungal activity of primary monocytes and neutrophils from human donors against A. fumigatus using FLuorescent Aspergillus REporter (FLARE) conidia. These conidia contain a genetically encoded dsRed reporter, which is constitutively expressed by live FLARE conidia, and are externally labeled with Alexa Fluor 633, which is resistant to degradation within the phagolysosome, thus allowing a distinction between live and dead A. fumigatus conidia. Video microscopy and flow cytometry are subsequently used to visualize the interaction between conidia and innate immune cells, assessing fungicidal activity whilst also providing a wealth of information on phagocyte migration, phagocytosis and the inhibition of fungal growth. This novel technique has already provided exciting new insights into the host-pathogen interaction of primary immune cells against A. fumigatus. It is important to note the laboratory setup required to perform this assay, including the necessary microscopy and flow cytometry facilities, and the capacity to work with human donor blood and genetically manipulated fungi. However, this assay is capable of generating large amounts of data and can reveal detailed insights into the antifungal response. This protocol has successfully been used to study the host-pathogen interaction of primary immune cells against A. fumigatus.
It is important to note the laboratory setup required to perform this assay, including the necessary microscopy and flow cytometry facilities, and the capacity to work with human donor blood and genetically manipulated fungi. However, this assay is capable of generating large amounts of data and can reveal detailed insights into the antifungal response. This protocol has successfully been used to study the host-pathogen interaction of primary immune cells against A. fumigatus.

Live Imaging of Antifungal Activity by Human Primary Neutrophils and Monocytes in Response to A. fumigatus

Here, we describe a protocol to assess antifungal activity of primary human immune cells in real-time using fluorescent Aspergillus reporter conidia in conjunction with live-cell video microscopy and flow cytometry. Generated data provide insight into host cell-Aspergillus interactions such as fungicidal activity, phagocytosis, cell migration and inhibition of fungal growth.

Imagens ao vivo de antifúngicos Atividade por neutrófilos humanos primários e monócitos em resposta à<em&gt; A. fumigatus</em

Aspergillus fumigatus is an opportunistic fungal pathogen causing invasive infections in immunocompromised hosts with a high case-fatality rate. Research ...

Studying the Role of Alveolar Macrophages in Breast Cancer Metastasis

This paper describes the application of the syngeneic model of breast cancer (4T1) to the studies on a role of pulmonary alveolar macrophages in cancer metastasis. The 4T1 cells expressing GFP in combination with imaging and confocal microscopy are used to monitor tumor growth, track metastasizing tumor cells, and quantify the metastatic burden. These approaches are supplemented by digital histopathology that allows the automated and unbiased quantification of metastases. In this method the routinely prepared histological lung sections, which are stained with hematoxylin and eosin, are scanned and converted to the digital slides that are then analyzed by the self-trained pattern recognition software. In addition, we describe the flow cytometry approaches with the use of multiple cell surface markers to identify alveolar macrophages in the lungs. To determine impact of alveolar macrophages on metastases and antitumor immunity these cells are depleted with the clodronate-containing liposomes administrated intranasally to tumor-bearing mice. This approach leads to the specific and efficient depletion of this cell population as confirmed by flow cytometry. Tumor volumes and lung metastases are evaluated in mice depleted of alveolar macrophages, to determine the role of these cells in the metastatic progression of breast cancer.

Here we describe the model and approach to study functions of pulmonary alveolar macrophages in cancer metastasis. To demonstrate the role of these cells in metastasis, the syngeneic (4T1) model of breast cancer in conjunction with the depletion of alveolar macrophage with clodronate liposomes was used.

Estudar o papel dos macrófagos alveolares em câncer de mama metastático

This paper describes the application of the syngeneic model of breast cancer (4T1) to the studies on a role of pulmonary alveolar macrophages in cancer ...

Medicina

In Vivo Assessment of Alveolar Macrophage Efferocytosis Following Ozone Exposure

Ozone (O3) is a criteria air pollutant that exacerbates and increases the incidence of chronic pulmonary diseases. O3 exposure is known to induce pulmonary inflammation, but little is known regarding how exposure alters processes important to the resolution of inflammation. Efferocytosis is a resolution process, whereby macrophages phagocytize apoptotic cells. The purpose of this protocol is to measure alveolar macrophage efferocytosis following O3-induced lung injury and inflammation. Several methods have been described for measuring efferocytosis; however, most require ex vivo manipulations. Described in detail here is a protocol to measure in vivo alveolar macrophage efferocytosis 24 h after O3 exposure, which avoids ex vivo manipulation of macrophages and serves as a simple technique that can be used to accurately represent perturbations in this resolution process. The protocol is a technically non-intensive and relatively inexpensive method that involves whole-body O3 inhalation followed by oropharyngeal aspiration of apoptotic cells (i.e., Jurkat T cells) while under general anesthesia. Alveolar macrophage efferocytosis is then measured by light microscopy evaluation of macrophages collected from bronchoalveolar (BAL) lavage. Efferocytosis is finally measured by calculating an efferocytic index. Collectively, the outlined methods quantify efferocytic activity in the lung in vivo while also serving to analyze the negative health effects of O3 or other inhaled insults.

This manuscript describes a protocol for determining whether exposure to ozone, a criteria air pollutant, impairs alveolar macrophage efferocytosis in vivo. This protocol utilizes commonly used reagents and techniques and can be adapted to multiple models of pulmonary injury to determine effects on alveolar macrophage efferocytosis.

In vivo avaliação da Efferocitose de macrófago alveolar após exposição ao ozônio

Ozone (O3) is a criteria air pollutant that exacerbates and increases the incidence of chronic pulmonary diseases. O3 exposure is known to induce ...

Measuring Phagocytosis of Aspergillus fumigatus Conidia by Human Leukocytes using Flow Cytometry

Invasive pulmonary infection by the mold Aspergillus fumigatus poses a great threat to immunocompromised patients. Inhaled fungal conidia (spores) are cleared from the human lung alveoli by being phagocytosed by innate monocytes and/or neutrophils. This protocol offers a fast and reliable measurement of phagocytosis by flow cytometry using fluorescein isothiocyanate (FITC)-labeled conidia for co-incubation with human leukocytes and subsequent counterstaining with an anti-FITC antibody to allow discrimination of internalized and cell-adherent conidia. Major advantages of this protocol are its rapidness, the possibility to combine the assay with cytometric analysis of other cell markers of interest, the simultaneous analysis of monocytes and neutrophils from a single sample and its applicability to other cell wall-bearing fungi or bacteria. Determination of percentages of phagocytosing leukocytes provides a means to microbiologists for evaluating virulence of a pathogen or for comparing pathogen wildtypes and mutants as well as to immunologists for investigating human leukocyte capabilities to combat pathogens.

Measuring Phagocytosis of Aspergillus fumigatus Conidia by Human Leukocytes using Flow Cytometry

This protocol provides a fast and reliable method to quantitatively measure phagocytosis of Aspergillus fumigatus conidia by human primary phagocytes using flow cytometry and to discriminate phagocytosis of conidia from mere adhesion to leukocytes.

Medição de phagocitose de Aspergillus fumigatus Conidia por Leukocytes Humanos usando citometria flow

Invasive pulmonary infection by the mold Aspergillus fumigatus poses a great threat to immunocompromised patients. Inhaled fungal conidia (spores) are ...

Confocal Laser Scanning Microscopy-Based Quantitative Analysis of Aspergillus fumigatus Conidia Distribution in Whole-Mount Optically Cleared Mouse Lung

Aspergillus fumigatus conidia are airborne pathogens that can penetrate human airways. Immunocompetent people without allergies exhibit resistance and immunological tolerance, while in immunocompromised patients, conidia can colonize airways and cause severe invasive respiratory disorders. Various cells in different airway compartments are involved in the immune response that prevents fungal invasion; however, the spatio-temporal aspects of pathogen elimination are still not completely understood. Three-dimensional (3D) imaging of optically cleared whole-mount organs, particularly the lungs of experimental mice, permits detection of fluorescently labeled pathogens in the airways at different time points after infection. In the present study, we describe an experimental setup to perform a quantitative analysis of A. fumigatus conidia distribution in the airways. Using fluorescent confocal laser scanning microscopy (CLSM), we traced the location of fluorescently labeled&#160;conidia in the bronchial branches and the alveolar compartment 6 hours after oropharyngeal application to mice. The approach described here was previously used for detection of the precise pathogen location and identification of the pathogen-interacting cells at different phases of the immune response. The experimental setup can be used to estimate the kinetics of the pathogen elimination in different pathological conditions.

Confocal Laser Scanning Microscopy-Based Quantitative Analysis of Aspergillus fumigatus Conidia Distribution in Whole-Mount Optically Cleared Mouse Lung

We describe the method for quantitative analysis of the distribution of Aspergillus fumigatus conidia (3 &#181;m in size) in the airways of mice. The method also can be used for the analysis of microparticles and nanoparticle agglomerate distribution in the airways in various pathological condition models.

Análise quantitativa baseada em microscopia a laser confocal da distribuição de aspergillus fumigatus conidia em pulmão de rato totalmente limpo opticamente

Aspergillus fumigatus conidia are airborne pathogens that can penetrate human airways. Immunocompetent people without allergies exhibit resistance and ...

Eficiência de depuração de fungos de macrófagos

Viability Assay of Trichoderma stromaticum Conidia Inside Human Peripheral Blood Mononuclear-Derived Macrophages

Macrophages represent a crucial line of defense and are responsible for preventing the growth and colonization of pathogens in different tissues. Conidial phagocytosis is a key process that allows for the investigation of the cytoplasmic and molecular events involved in macrophage-pathogen interactions, as well as for the determination of the time of death of internalized conidia. The technique involving the phagocytosis of fungal conidia by macrophages is widely used for studies evaluating the modulation of the immune responses against fungi. The evasion of phagocytosis and escape of phagosomes are mechanisms of fungal virulence. Here, we report the methods that can be used for the analysis of the phagocytosis, clearance, and viability of T. stromaticum conidia, a fungus which is used as a biocontrol and biofertilizer agent and is capable of inducing human infections. The protocol consists of 1) Trichoderma culture, 2) washing to obtain conidia, 3) the isolation of peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) using the polysucrose solution method and the differentiation of the PBMCs into macrophages, 4) an in vitro phagocytosis method using round glass coverslips and coloration, and 5) a clearance assay to assess the conidia viability after conidia phagocytosis. In summary, these techniques can be used to measure the&#160;fungal clearance efficiency of macrophages.

Autor em destaque: Desvendando a interação entre Trichoderma stromaticum e o sistema imunológico de mamíferos

The technique involving the phagocytosis of fungal conidia by macrophages is widely used for studies evaluating the modulation of the immune responses against fungi. The purpose of this manuscript is to present a method for evaluating the phagocytosis and clearance abilities of human peripheral blood mononuclear-derived macrophages stimulated with Trichoderma stromaticum conidia.

Ensaio de viabilidade de conídios de Trichoderma stromaticum dentro de macrófagos mononucleares derivados do sangue periférico humano

Macrophages represent a crucial line of defense and are responsible for preventing the growth and colonization of pathogens in different tissues. Conidial ...

Avaliar a atividade anti-fúngica isolada de macrófagos alveolares por microscopia confocal

Resumo

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Colheita Murino macrófagos alveolares e Avaliação de ativação celular induzida por nanopartículas polianidrido

Live-célula Microscopia vídeo de Fagocitose patógeno fúngico

Uso de Citometria de imagem para quantificação de fungos patogênicos em associação com células do hospedeiro

Imagens ao vivo de antifúngicos Atividade por neutrófilos humanos primários e monócitos em resposta à

Estudar o papel dos macrófagos alveolares em câncer de mama metastático

In vivo avaliação da Efferocitose de macrófago alveolar após exposição ao ozônio

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