A digestão dependente de DNAzyme é um método útil para estudar funções de snoRNAs. É um método rápido e simples para analisar a metilação de RNA específica do local. Requer um curto oligonucleotídeo de DNA e reagentes básicos presentes em qualquer laboratório de biologia molecular.
Comece projetando o DNAzyme para a sequência de interesse. Encontre a sequência de RNA ou o local de metilação putativa usando um banco de dados apropriado. Para alvos s.cerevisiae snoRNA, use o banco de dados de snoRNA de levedura.
Para encontrar um local de metilação de interesse, por exemplo, um site dependente de snR13, selecione snR13 e anote a posição do nucleotídeo modificado. Encontre a sequência rio acima e a jusante do nucleotídeo modificado usando um banco de dados apropriado, como o Banco de Dados de Genoma saccharomyces. Procure o nome do gene alvo.
Se usar um ensaio DNAzyme de 10 a 23, selecione 10 a 15 nucleotídeos rio acima e rio abaixo do local de metilação. Se estiver usando o DNAzyme 8-17, selecione 20 nucleotídeos. Crie sequências complementares dos braços de cinco prime e três prime e use-os para flanquear a sequência catalítico DNAzyme nas extremidades três-prime e cinco-prime.
Ordene o DNAzyme como um oligonucleotídeo de DNA normal. Cultivar leveduras de interesse em um meio e condições adequados. Quando as células atingem a fase exponencial média, pelota-as por centrifugação a 1.000 vezes g por três minutos a quatro graus Celsius e descartar o meio.
Prossiga com o isolamento do RNA de acordo com as instruções do manuscrito. Em seguida, resuspenque a pelota de RNA em 30 microliters de água RNase e DNase. Coloque o tubo no gelo e meça a concentração de RNA em um microspectrophotometer.
Para realizar a digestão de DNAzyme usando o DNAzyme de 10 a 23, prepare uma mistura de incubação com cinco microgramas de RNA, 200 picomoles de 10 a 23 DNAzyme e tampão de incubação de 10 a 23 em um volume total de 10 microliters. Em seguida, incubar os tubos em um bloco de calor seco definido para 95 graus Celsius por três minutos. Imediatamente depois, coloque os tubos no gelo e deixe-os lá por cinco minutos.
Gire brevemente os tubos e coloque-os de volta no gelo. Adicione 20 unidades do inibidor de RNase e coloque os tubos em um bloco de calor seco definido a 25 graus Celsius por 10 minutos. Enquanto isso, prepare uma mistura de reação combinando cinco microlitadores de tampão de reação de quatro X 10 a 23 com quatro microlitadores de cloreto de magnésio de 300 molares e uma água microlitera.
Pré-aqueça esta mistura de reação em um bloco de calor seco definido a 37 graus Celsius. Coloque o tubo com a mistura de incubação no bloco de calor seco Celsius de 37 graus e adicione 10 microliters da mistura de reação pré-armada. Incubar a mistura a 37 graus Celsius por uma hora e, em seguida, coloque o tubo no gelo.
Para realizar a digestão de DNAzyme usando o DNAzyme 8-17, prepare um microtubo de 1,5 mililitro com cinco microgramas de RNA em um volume total de seis microlitrais. Em seguida, prepare um tubo separado com 400 picomoles do DNAzyme 8-17. Enquanto trabalha, mantenha os dois tubos no gelo.
Transfira os dois tubos para um bloco de calor seco a 95 graus Celsius e incuba-os por dois minutos. Mova a amostra de RNA de volta no gelo e gire o tubo com o DNAzyme por cinco segundos. Incubar o DNAzyme a 25 graus Celsius por 10 minutos.
Enquanto o DNAzyme está incubando, prepare 10 mircoliters de tampão de reação de 2 X 8-17 e pré-aquecimento para 25 graus Celsius. Adicione o buffer pré-ensaído ao tubo com o DNAzyme e, em seguida, transfira 14 microliters desta mistura de reação para o tubo com o RNA, juntamente com 20 unidades de inibidor RNase. Incubar a reação a 25 graus Celsius por duas horas e, em seguida, coloque o tubo no gelo.
Para purificar o RNA após a digestão de DNAzyme, adicione 350 microliters de água e 400 microliters de clorofórmio ao tubo de reação. Vórtice por 30 segundos e centrífuga a 20.000 vezes g por cinco minutos. Após a centrifugação, transfira a fase superior para um novo tubo contendo um etanol mililitro, 40 microliters de acetato de amônio molar de 7,5 molares e um microlitro de glicogênio.
Vire o tubo algumas vezes para misturar e incubar a 80 graus Celsius negativos por duas horas ou a 20 graus Celsius negativos durante a noite. Prossiga com a purificação do RNA de acordo com as instruções do manuscrito e, em seguida, suspenda novamente a pelota de RNA em 10 microliters RNase e DNase-free water. Coloque o tubo de RNA no gelo imediatamente após a purificação.
Para realizar a eletroforese de RNA, comece dissolvendo 1,5 gramas de agarose em 127,5 mililitros de água dupla destilada aquecendo a mistura no micro-ondas. Em seguida, adicione 15 mililitros de MOPS 10X e 7,5 mililitros de 37% de formaldeído à solução agarose. Adicione uma quantidade apropriada de mancha de gel à solução agarose.
Despeje a agarose na bandeja e deixe esfriar por 45 minutos. Prepare as amostras de RNA combinando 10 microliters do RNA digerido e purificado com cinco microliters de tampão de desnaturação amostral e 0,5 microliters de corante de carregamento de seis X. Incubar as amostras a 70 graus Celsius por cinco minutos e, em seguida, no gelo por cinco minutos.
Coloque o gel preparado no tanque de eletroforese e encha o tanque com um X MOPS tampão. Carregue os 15 microliters inteiros da amostra no gel e execute o gel a 80 volts até que o azul bromothymol atinja 2/3 do comprimento do gel. Analise o gel com o imager apropriado.
O valor desta técnica pode ser demonstrado em um sistema de transcrição snoRNA indutível. Inserir um promotor GAL1 indutível a montante de genes snR13 ou snR47 permite a análise da metilação dependente de snoRNA de RNA ribossômico 25S. Quando as células são cultivadas em galactose, o RNA ribossômico 25S é metilado em locais guiados pelo snoRNA e permanece intacto após o tratamento de DNAzyme.
Em contraste, quando a expressão do snoRNA é desligada devido à falta de galactose, ocorre o decote dependente do DNAzyme. Além disso, nenhuma digestão de RNA é observada nos controles do tipo selvagem, uma vez que a expressão do snoRNA é independente de galactose. A atividade do decote dependente do DNAzyme na análise de nossas modificações de rRNA tem sido mostrada recentemente no contexto de maturação do snoRNA.
O ensaio dependente do DNAzyme foi usado para mostrar que a falta de processamento de cinco primes e pré-snoRNA afeta os níveis de metilação de 25S e 18S rRNA em Saccharomyces cerevisiae. Este protocolo requer o uso de fenol e clorofórmio, que são tóxicos, e devem ser manuseados sob um capô de fumaça.
