A preparação deste manuscrito foi apoiada por meio de fundos iniciais da Universidade de Colorado Denver (JMRE). A AF gostaria de reconhecer o apoio de um prêmio de Pesquisa e Atividades Criativas (RaCAS, CU Denver). Financiamento do Escritório de Serviços de Pesquisa, Universidade de Denver Colorado para cobrir os custos de publicação é reconhecido. Gostaríamos de agradecer aos membros do laboratório, Sra Cassandra Herbert e ao Sr. Yannick K. Dzowo, por suas contribuições na seção de vídeo.

1. Síntese em fase sólida de oligonucleótidos de ARN <ol><li> Preparação de soluções contendo cada fosforamidite (Tabela 1). <ol><li> Contar o número de nucleótidos e encaixar na equação n + 1 (onde n = número de nucleótidos) correspondente a cada base e preencher a tabela com os valores faltantes. Volume = 0,15 mL por nucleotídeo a uma concentração de 0,1 M, dissolvido em acetonitrilo anidro. </li><li> Pesar cada fosforamidite em frascos âmbar de 10 mL secados no forno (Septum Top Amber 394 Amidite 13 mm ID x 20 mm OD Top) e coloque imediatamente sob vácuo usando um dessecador contendo um agente de secagem. </li><li> Encha o dessecador com árgon seco, remova o frasco e diluir imediatamente com a quantidade correspondente de acetonitrilo (anidro) antes de fixar no instrumento. NOTA: Certifique-se de usar seringas estanque aos gases e manter uma atmosfera anidra em todos os momentos. </li><li> Remova os septos da garrafa e coloque no mAchine, através de uma função de troca de garrafa. NOTA: Este processo requer um aumento adicional de 0,15 mL (daí o excesso de volume na equação n + 1 acima) de cada solução para iniciar a linha antes da síntese. </li></ol></li><li> Configuração da síntese de seqüência e fase sólida usando o software ( Figura 3 ). <ol><li> Clique no ícone do software ( por exemplo , OligoNet 1.0.1) e selecione Nome do instrumento&gt; OK . Crie uma nova síntese por Arquivo&gt; Nova síntese&gt; Ordem . </li><li> Fill-in: Data; RunID; Selecione o instrumento; Nome da sequência; Sequência (fim de 5 a 3 &#39;). Sob | ciclo, atribua o método criado anteriormente ( Figura 3 ). Escolha o procedimento final, ( deixa o oligonucleótido ligado à resina CPG)&gt; manual. </li><li> Selecione DMT Off&gt; (tratamento TCA no último passo para obter um grupo 5&#39;-OH no final da síntese) ; Salve Arquivo&gt; Salvar comoE forneça um nome para o experimento. </li><li> Enviar o arquivo para iniciar a síntese Ordem&gt; Enviar pedido ao sintetizador e selecionar a coluna 1-4 . Abra a janela do sintetizador e selecione o monitor triityl | escolha a função | trity&gt; monitor cada etapa . </li><li> Repita as etapas conforme necessário, dependendo do número de oligonucleótidos a serem sintetizados de uma vez (observe que todas as ordens devem ter o mesmo método, ou seja , os mesmos tempos de acoplamento e a seqüência de eventos). </li><li> Comece a síntese Sintetizador&gt; Prepare-se para começar . Coloque as colunas com a extremidade 3 &#39;desejada nas posições indicadas no instrumento. No instrumento, clique em Iniciar&gt; Não (para preparação ABI). </li><li> Uma vez que a síntese está completa, remova a coluna do instrumento e coloque em um balão de fundo redondo, seguido de secagem sob pressão reduzida durante cerca de 0,5 h. NOTA: Recomenda-se verificar se uma cor laranja profunda é observada em randOm acoplamentos (etapas 1.2.4 - 1.2.7) para evitar possíveis erros da função do monitor trityl. </li></ol></li><li> Desprotecção e purificação de oligonucleótidos de ARN. <ol><li> Abra a coluna torcendo a tampa preta e transfira tudo (ou metade, dependendo da necessidade ou finalidade) da resina branca em um tubo de centrífuga de 1,6 mL. Adicione 0,5 mL de uma metilamina (40% na água) / amônia (40% na água) a 1: 1. </li><li> Fixe a tampa do tubo de centrífuga com parafilme e, usando um bloco de calor, aqueça a 60 ° C por 1,5 h. NOTA: Um objeto pesado pode ser colocado no topo do tubo para garantir que a concentração de amônia permaneça constante dentro do tubo de reação. </li><li> Retire do bloco de calor e esfrie lentamente até a temperatura ambiente. Centrifugue brevemente a amostra para girar o conteúdo, depois transfira o sobrenadante para um novo tubo de centrífuga. </li><li> Congele as amostras submergindo tubos em nitrogênio líquido (ou banho de gelo seco / etanol) e concentre-se até a secura enquanto o spinnEm uma centrífuga sob pressão reduzida. </li><li> Re-suspender os sólidos em 0,4 mL de uma solução de trietilamina / N-metilpirrolidinona / trimetilamina-trihidrofluoreto (proporção 2: 2: 3). Aquecer até 60 ° C durante 1,5 h, seguido de arrefecimento lento até à temperatura ambiente. </li><li> Adicione 0,04 mL de uma solução de NaOAc (3M, pH 5,5 - ajustado com HCl) seguido de uma mistura suave com uma ponta de pipeta. Adicione etanol (1 mL) e arrefecer até ca. -70 ° C (banho de gelo seco / etanol) durante 15 min. </li><li> Centrifugação a 15.000 rpm e 4 ° C durante 10 min. Use uma pipeta para extrair a alíquota e secar o sedimento resultante sob pressão reduzida. </li><li> Re-suspender o sólido obtido no tampão de carga (0,2 mL, 90 mM de formamida aquosa, 1 mM de EDTA) e misturar até que a mistura seja homogênea. </li><li> Carregar a suspensão sobre um gel de poliacrilamida previamente preparado (20% de desnaturação, dimensões do poço: 30 cm x 1 mm) 22 . </li><li> Aplique uma corrente através do gel até que o marcador de bromofenol esteja localizado entre 1 / 2-2 / 3No gel (dimensões do gel: ~ 21,5 cm x 30 cm). </li><li> Retire o gel do suporte e transfira o conteúdo de gel do vidro para plástico (coberto em ambos os lados) e coloque sobre uma placa de cromatografia de camada fina (TLC) coberta com sílica (contendo corante fluorescente a 254 nm) para visualizar as bandas Usando uma lâmpada UV (λ max = 254 nm). </li><li> Use um marcador para delinear a posição onde a banda superior está localizada e cortá-la usando uma nova lâmina de barbear. Coloque gel contendo o ARN (sem plástico) em um tubo cônico de 50 mL e aplique em pequenos pedaços usando uma haste de vidro. </li><li> Suspender os resíduos de gel em um NaCl aq. Solução (2 mM e 1 mM de EDTA) e agite a suspensão a 37 ° C durante 12 h. Centrifugue o tubo cônico por 10 min. </li><li> Desalinhando usando um cartucho C18 de fase reversa. <ol><li> Prepare o cartucho usando uma seringa de 10 mL lavando com: Acetonitrilo (10 mL) H 2 O (duas vezes, 10 mL) NH 5 mM4 Cl aq. Solução (3 mL) Solução contendo RNA, tomando cuidado para não derramar nenhum dos resíduos de gel. </li><li> Lavar com H 2 O (três vezes, 10 mL). </li><li> Elute da coluna usando um 60% aq. Solução de metanol (3 mL) </li></ol></li><li> Concentre-se sob pressão reduzida e re-dissolva-se em água sem RNase (0,3 mL) </li><li> Prepare uma solução diluída (10 μL) e deposite 1 μL no instrumento UV-vis ( por exemplo , Nanodrop) para medir o espectro UV-vis (200-450 nm). </li><li> Use a Lei de Lambert de Beer para determinar a concentração da solução obtida: <img alt="Equação 1" src="/files/ftp_upload/56189/56189eq1.jpg" /> Onde A = absorvência obtida; Ε = coeficiente de extinção molar calculado; C = concentração e l = 0,1 para um comprimento de trajeto de 1 mm. </li><li> Calcular os coeficientes de extinção molar para os oligonucleótidos; Calculado aqui com uma calculadora on-lineQue usa o software DINAMelt (http://unafold.ra.albany.edu/?q=dinamelt) 23 </li></ol></li><li> Determinação e caracterização de concentração via MALDI-TOF. <ol><li> Coloque amostras em uma placa MALDI usando uma ponta de pipeta carregada com uma ponta C18 para desalar e mancha cada oligonucleótido. <ol><li> Lave a ponta com 50% de acetonitrilo (10 μL x 2). Equilibre a ponta com 0,1% de ácido trifluoroacético (TFA, 10 μL x 2). Coloque a ponta com amostra (tipicamente 100-150 pmol). </li><li> Lave a ponta com 0,1% de TFA (10 μL x 2), e depois com água (10 μL x 2). </li><li> Eluir a amostra em uma solução contendo a matriz desejada; Usamos uma solução de: 10 μL de monohidrato de 25 mM-2,4,6-trihidroxiacetofenona (THAP), citrato de amônio 10 mM e fluoreto de amônio 300 mM em acetonitrilo a 50%. </li><li> Coloque diretamente na placa MALDI depositando 0,9 μL (seguido de secagem ao ar) e repita o procedimento conforme necessário. NOTA: Todos os espectros foram obtidos no modo reflector positivo. </li></ol></li></ol></li></ol> 2. Análise da Estrutura do RNA via CD <ol><li> Preparação de soluções para CD. <ol><li> Prepare 0,25 mL que continham o ARN modificado [3? M], NaCl a [10 mM], tampão de fosfato de sódio [10 mM, pH 7,2], e MgCl 2 [5 mM]. A amostra está pronta para análise tal como é, especialmente se representa uma transição unimolecular. </li><li> Se o objetivo é analisar estruturas duplex ou transições bimoleculares, adicione o complemento (1 equivalente molar, se aplicável) neste momento ou continue com o passo abaixo. </li><li> Coloque a amostra em um bloco de calor, aqueça previamente a 90 ° C e desligue o calor para controlar o resfriamento lento até a temperatura ambiente (tipicamente 2 a 4 h). </li></ol></li><li> Aquisição de Spectra <ol><li> Prepara-se uma solução em branco (10 mM de NaCl, fosfato de sódio 10 mM pH 7,3, MgCl 2 5 mM), transferência tO micro-cuvete (comprimento do caminho de 1 cm, volume mínimo de 250 μL) e coloque na posição de suporte do trocador de amostras dentro do instrumento. </li><li> Transfira a amostra contendo RNA em outra micro-cuvete e posicione-se no trocador de amostras. Se medir uma transição de desnaturação térmica, adicione cuidadosamente um leito de óleo sem interromper a camada aquosa e prenda a tampa da cuvete usando um pedaço de fita de Teflon. </li><li> Abra o tanque de nitrogênio para fornecer um fluxo que mova o flutuador de ar localizado no instrumento para ca. 40. Ligue o refrigerador. </li><li> Ligue o instrumento e abra o ícone do software Spectra Manager e, em seguida, abra a janela de aquisição Spectra Measurement . </li><li> Purgar o instrumento com nitrogênio durante 5 minutos antes da aquisição. </li><li> Adquira os espectros usando os seguintes parâmetros. Medir&gt; Parâmetros e ajustar os parâmetros da seguinte maneira: <ol><li> Em Geral , selecione: Digitalizar 200-350 nm; Canais CD e HT: dadosPasso a 0,1 nm; Velocidade de varredura a 100 nm / min; Largura da banda a 1 nm; Número de acumulações em 5. </li><li> Sob unidade celular , escolha 20 ° C. Sob controle , selecione Obturador é aberto e fechado automaticamente. Sob informações , escolha o nome, a concentração, o operador. </li><li> Em dados , navegue até a pasta desejada. Clique em OK . </li></ol></li><li> Adquira os espectros Medida&gt; Medida da amostra , identifique a (s) posição (s) das cubetas no trocador de amostras 1-6 em conformidade, clique em OK . </li></ol></li><li> Se tomar uma transição de desnaturação térmica: <ol><li> Fechar software de aquisição Arquivo&gt; Sair e abrir um novo programa Medição de temperatura variável&gt; Medir&gt; Parâmetros . </li><li> Aplique os seguintes parâmetros para registrar uma transição térmica, que pode ser ajustada conforme desejado: <ol><li> Sob temperatura , selecione a temperatura de início: 4 ° C; Intervalo: 0,2; TaRget: 90 ° C; Gradiente: 1 ° C / min; Aguarde 0 s. Em Iniciar / Fim , selecione Iniciar condição e condição final como desejado. </li><li> Em Geral , selecione 3 Canais, CD / HT / Abs; Largura de banda: 1 nm; Comprimento de onda: 270 nm (ou conforme desejado). Em Controle , selecione nenhum. Em Informações , selecione nome, concentração, operador. </li><li> Em dados , navegue até a pasta desejada. Clique em OK . </li></ol></li><li> Arrefecer as amostras a 4 ° C e esperar 5 min a esta temperatura antes de obter uma medição de espectro. </li></ol></li><li> Trabalho de dados para espectros. <ol><li> Usando a função no software, subtrair o espectro em branco da aquisição de destino para a conta dos sinais de fundo decorrentes do sistema de buffer em uso: Spectra Analysis&gt; File&gt; Open . </li><li> Uma vez que um arquivo em branco e um arquivo de espectros foram abertos, arraste View 2 em View 1 (no lado esquerdo da tela). </li><li> Clique em PrProcessamento&gt; subtração&gt; OK ou troca de dados&gt; OK . </li><li> Extraia dados como um arquivo ASCII: Arquivo&gt; Exportar e selecionar ASCII . </li><li> Use o software para traçar o espectro correspondente. O brilho dos dados é opcional nos casos em que a relação sinal-ruído é menor do que o esperado. Essa transformação pode ser aplicada aplicando a opção de suavização de dados. </li></ol></li><li> Processamento de dados para transições de desnaturação térmica. <ol><li> Extraia dados do arquivo JASCO como um arquivo ASCII. </li><li> Trace os pontos de elipticidade em função da temperatura. Normalmente, o alisamento dos dados é necessário, dependendo do comprimento de onda que está sendo examinado. Em alguns casos, o uso do comprimento de onda em 210 nm apresentou variações maiores entre os lotes que requeriam alisamento. No entanto, dependendo da amostra e das concentrações, foram realizados vários cálculos utilizando os dados brutos. </li><li> Para calcular a cova térmicaValor de transição de atuação (T m ), obtenha uma primeira derivada da curva. Os máximos ou mínimos foram uma indicação desse parâmetro. Como no passo anterior, alguns casos requeriam o alisamento dos dados para obter o valor mais preciso. NOTA: As experiências foram tipicamente realizadas em triplicado, o que resultou na média correspondente e desvio padrão para a medição. </li></ol></li></ol>

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Os autores não têm nada a revelar.

A intenção deste manuscrito é servir como um guia para pesquisadores no campo, iniciante ou especialista, para alcançar com sucesso ou melhorar a síntese de oligonucleótidos de DNA ou RNA. A metodologia descrita enfoca o uso de síntese de fase sólida usando um sintetizador automatizado de DNA / RNA através de química padrão de fosforamidite. O relatório descreve uma descrição passo-a-passo da síntese, purificação e caracterização de dodecamers de RNA. Além disso, o uso de CD é utilizado para identif...

A síntese em fase sólida para obter oligonucleótidos de DNA / RNA é uma ferramenta poderosa que serviu várias aplicações em vários campos desde a década de 1970 1 , 2 , 3 usando blocos de construção de fosforamidita 4 . Exemplos de sua ampla influência incluem: seu impacto na rotulagem ( através de reações de química de clique) 5 , sondagem estrutural 6 e tecnologias anti-sentido 7 , bem como a elucidação de mecanismos biológicos 8 , 9 , fonte como material genético 10 e o estudo de Várias modificações naturais e / ou químicas 11 , 12 , entre muitos outros. A modificação que usamos aqui representa o primeiro passo em nossos esforços para obter oligonucleótidos de RNA que contenhamSondas fotoativas para permitir o controle temporal da estrutura e função deste importante biopolímero. A síntese de dodecamers de ARN com sequências: 5 &#39;- [CUA CG G A UA CAU] -3&#39; / 5 &#39;- [agosto AUU CCG UAG] -3&#39; (posições sublinhadas representam a incorporação de uma modificação -thiophenylmethyl C2&#39;- ó ) Constitui o foco deste estudo. As seqüências foram escolhidas para permitir a quantificação e medição de fios de ARN como fios simples, ou como suas estruturas duplex correspondentes (nenhuma outra estrutura secundária foi prevista como termodinamicamente estável). O CD foi utilizado para estabelecer os parâmetros estruturais, ou seja , a formação do duplex e as transições de desnaturação térmica. Síntese O procedimento geral para a obtenção destes oligonucleótidos é ilustrado na Figura 1 e segue o processo passo a passo: Síntese de fase sólida automatizada → DeprOteção → Purificação → Quantificação → Caracterização. A Figura 2 mostra as unidades monoméricas que são necessárias neste procedimento. A síntese em fase sólida do RNA é semelhante à do DNA, na medida em que se baseia na química da fosforamidite ( Figura 2 , à esquerda) e na utilização de grupos protectores base-labileis para as aminas exocíclicas nucleófilas em G, A e C, eg , Acetilo, benzoílo, fenoxiacetilo, t- butilo ou N , N- dimetilformamida ( Figura 2 , à direita). Mais um aspecto a considerar no RNA, devido à presença do grupo C2&#39;-OH (faltando nos biopolímeros desoxioligonucleotídicos), é o passo adicional que deve ser incorporado para proteção e posterior desproteção desta posição nucleofílica. A este respeito, os grupos de proteção baseados em silício tornaram-se uma estratégia atraente devido ao seu potencial como porções biortogonais (especificamenteE desprotegido na presença de fluoreto), com os grupos terc- butildimetilsililo (TBDMS) e triisopropilsililoximetilo (TOM) como escolhas populares ( Figura 2 , inferior esquerda). Neste trabalho, a síntese automatizada foi realizada em um sintetizador de DNA / RNA que usa química padrão de fosforamidite. As configurações do fabricante no instrumento incluem um passo de diluição automatizado ao usar as versões comerciais dos fosforamiditos para o DNA ou a opção de diluir nos volumes configurados pelo usuário. No entanto, decidimos pesar o ARN fosforamidito e diluir manualmente, dado que: 1) o preço dos fosforamiditos canônicos do RNA é maior (até 50 vezes mais caro em alguns casos); 2) os fosforamiditos modificados são frequentemente obtidos em pequenas quantidades; E 3) a quantidade de material desperdiçado após o uso de um passo de diluição automatizado (definido pelo fabricante) é grande. Além disso, utilizamos: 1) suportes sólidos comercialmente disponíveis(Por exemplo , CPG) contendo uma nucleobase protegida para funcionar como a extremidade 3 &#39;; E 2) fosforamiditos comerciais (nucleobases canônicas) protegidos com um grupo TBDMS na posição C2&#39;- O . A lista detalhada dos passos de síntese é fornecida na Figura 3 e Tabela 1 , juntamente com descrição e comentários adicionais para etapas que foram ajustadas para a síntese de RNA. Além disso, a Figura 4 ilustra os rendimentos passo a passo que são observados para cada passo depois de selecionar a opção &#39;Trityl Monitor&#39;, que quantifica o catião tritil que é liberado de cada passo de detrilação. Vale ressaltar que tipicamente, em nossa experiência, o fator limitante foi a obtenção da fosforamidita contendo a modificação desejada. Ou seja, o desenvolvimento de uma metodologia sintética que permite a incorporação de modificações em sites selecionados. Neste relatório, nos concentramos naIncorporação de um nucleótido modificado para o qual estabelecemos a metodologia sintética correspondente, o grupo C2&#39;- O- tiofenilmetilo. Este grupo é de tamanho pequeno e não afeta a síntese em fase sólida de qualquer maneira. Uma vez que a incorporação deste grupo em oligonucleótidos de ARN foi relatada, juntamente com os parâmetros estruturais e termodinâmicos 4 , não serão descritos aqui os aspectos de síntese orgânica que levem aos fosforamiditos modificados. Desproteção, Purificação e Caracterização A desprotecção das aminas exocíclicas e dos grupos ß-cianoetilo ocorre no mesmo passo que a da clivagem da resina CPG. Aplicamos as condições comumente usadas para aquecer a resina obtida na presença de uma solução aquosa de AMA, seguida por clivagem dos grupos C2&#39;- O- sililo na presença de iões fluoreto e depois purificação através de gelEletroforese. Embora estes tenham se tornado condições padrão em muitos casos, modificações que são lábiles para condições básicas ou íons fluoreto podem exigir condições mais suaves 13 , 14 , por exemplo , metanol / carbonato de potássio (MeOH / K 2 CO 3 ) ou butilamina. Assim, é necessário um conjunto diferente de grupos de proteção sobre os fosforamidites correspondentes. Além disso, escolhemos a eletroforese como a alternativa preferida para purificar os oligómeros desprotegidos, dada a nossa experiência anterior com este método e a falta de outras instrumentações. No entanto, a HPLC pode alternativamente ser utilizada como um método eficaz 15 . A caracterização dos oligonucleótidos purificados foi realizada através de espectrometria de massa, dessorção / ionização de laser assistida por matriz - tempo de voo (MALDI-TOF), utilizando um procedimento relatado pelo nosso grupo 16 . Caracterização estrutural e<html> A estabilidade incorreta dos duplexs obtidos foi realizada via CD. Especificamente, utilizamos o CD para determinar as transições de desnaturação térmica de oligonucleótidos modificados e não modificados de RNA seguindo a diminuição da elipticidade da banda em aprox. 270 nm, bem como o desaparecimento da banda (com elipticidade negativa) com λ máx . A 210 nm. Uma comparação de espectros antes e após a hibridação é fornecida para ilustrar suas diferenças e fornecer a validação da metodologia empregada. O uso de CD é amplamente aceito na determinação de motivos estruturais em ácidos nucleicos e aminoácidos 17 e, portanto, pode ser empregado como uma ferramenta para determinar vários parâmetros estruturais e termodinâmicos 18 ; No entanto, não há muitos exemplos em que a técnica é utilizada para avaliar as transições de desnaturação térmica. Alguns casos incluem a determinação de estabilidades térmicas em ADN contendo quadruplexos GAss = &quot;xref&quot;&gt; 19 , 20 ou em duplex e grampos de RNA 21 . Este relatório pretende fornecer ao leitor ou espectador não especialista um conjunto de ferramentas que permitem um bom início desse tipo de pesquisa. Isso servirá para melhorar e comparar com metodologias e técnicas em outros laboratórios de pesquisa que estão envolvidos neste poderoso ramo da ciência. O conteúdo deste relatório adiciona aos protocolos existentes desta tecnologia de várias fontes, e enriquece e facilita a experiência com um auxílio visual para cada etapa.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="778">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:445px;">AbsolveTM</td>
			<td style="width:152px;">PerkinElmer</td>
			<td style="width:117px;">6NE9711</td>
			<td style="width:64px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Acetonitrile 99.9%, HPLC Grade</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>75-05-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Acetonitrile 99.9%, anhydrous for DNA sequencing</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>75-05-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Acrylamide, 99+%</td>
			<td>ACROS Organics</td>
			<td>164850025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ammonium chloride 98+%</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>12125-02-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ammonium citrate, dibasic 98%</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>3012-65-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ammonium Fluoride&#160; 98.0%, ACS grade</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>12125-01-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ammonium hydroxide 28-30% in water, ACS Plus</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>1336-21-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ammonium persulfate</td>
			<td>ACROS Organics</td>
			<td>1444</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Argon-ultra high purity</td>
			<td>&#160;Airgas</td>
			<td>7440-37-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Bis-acrylamide Ultra pure</td>
			<td>VWR-Amresco</td>
			<td>172</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Boric Acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A73-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Diethyl pyrocarbonate, 97%</td>
			<td>ACROS Organics</td>
			<td>A0368487</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ethanol, anhydrous, histological grade</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>64-17-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ethylenediamine tetraacetic acid, disodium salt dehydrate 100.2%</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>6381-92-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Formamide&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>75-12-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Hydrochloric acid, 36.5-38.0%, Certified ACS Plus</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>7647-01-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Magnesium chloride hexahydrate, 99%</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>7786-30-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Methanol, 99.9%,&#160; HPLC Grade</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>67-56-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Methylamine 40% in water</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>74-89-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">1-Methyl-2-pyrrolidinone, andhydrous, 99.5%</td>
			<td>Aldrich</td>
			<td>872-50-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Opti-TOFTM 96 Well Insert (123 x 81 mm)&#160;</td>
			<td>MDS SCIEX</td>
			<td>1020157</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">RNase Away</td>
			<td>Molecular BioProducts</td>
			<td>7005-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium acetate, anhydrous 99.2%, Certified ACS</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>127-09-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium chloride, 100.5%, Certified ACS</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>7647-14-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium phosphate monobasic dihydrate 99.0%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>13472-35-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">2&#8217;,4&#8217; Triethylamine, 99+%</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>121-44-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">TEMED</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Triethylamine trihydrofluoride, 98%</td>
			<td>Aldrich</td>
			<td>73602-61-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Trifluoroacetic acid, 99%</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>76-05-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">6&#8217;-Trihydroxyacetophenone monohydrate 98%</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>480-66-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tris Base</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP154-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Urea</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>U15-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Reagents for the RNA synthesis:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Deblocking mix, 3% trichloroacetic acid in dichloromethane</td>
			<td>Glen Research</td>
			<td>&#160;40-4140-57</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cap Mix A, THF/Pyridine/Acetic anhydride</td>
			<td>Glen Research</td>
			<td>40-4110-52</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cap Mix B, 10% 1-methylimidazole in THF</td>
			<td>Glen Research</td>
			<td>40-4120-52</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Activator, 0.25 M 5-ethylthio-1H-tetrazole in anhydrous acetonitrile</td>
			<td>Glen Research</td>
			<td>&#160;30-3140-52</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Oxidizing Solution, 0.02 M iodine in THF/Pyridine/Water</td>
			<td>Glen Research</td>
			<td>40-4330-52</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">U-RNA-CPG</td>
			<td>Glen Research</td>
			<td>20-3330-xx</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ac-G-RNA-CPG&#160;</td>
			<td>Glen Research</td>
			<td>20-3324-xx</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ac-G-CE Phosphoramidite&#160;</td>
			<td>Glen Research</td>
			<td>10-3025-xx</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">U-CE Phosphoramidite</td>
			<td>Glen Research</td>
			<td>10-3030-xx</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ac-C-CE Phosphoramidite</td>
			<td>Glen Research</td>
			<td>10-3015-xx</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Bz-A-CE Phosphoramidite&#160;</td>
			<td>Glen Research</td>
			<td>10-3003-xx</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

protocol for the solid-phase synthesis of oligomers of rna containing a 2'-o-thiophenylmethyl modification and characterization via circular dichroism

A síntese em fase sólida tem sido utilizada para obter polímeros canônicos e modificados de ácidos nucleicos, especificamente de DNA ou RNA, o que tornou uma metodologia popular para aplicações em vários campos e para diferentes fins de pesquisa. O procedimento aqui descrito concentra-se na síntese, purificação e caracterização de dodecamers de RNA 5 &#39;- [CUA CGG AAU CAU] -3&#39; contendo zero, uma ou duas modificações localizadas na posição C2&#39;- O . As sondas são baseadas em grupos 2-tiofenilmetilo, incorporados em nucleótidos de ARN através de síntese orgânica padrão e introduzidos nos oligonucleótidos correspondentes através dos seus respectivos fosforamiditos. Este relatório faz uso da química da fosforamidita através das quatro nucleobases canônicas (Uridina (U), Citosina (C), Guanosina (G), Adenosina (A)), bem como nucleotídeos funcionalizados com 2-tiofenilmetilo modificados no 2&#39;- O- posição; No entanto, a metodologia é favorável para uma grande variedadeMuitas modificações que foram desenvolvidas ao longo dos anos. Os oligonucleótidos foram sintetizados em um suporte de vidro de poro controlado (CPG) seguido por clivagem da resina e desprotecção em condições padrão, isto é , uma mistura de amônia e metilamina (AMA) seguida de fluoreto de hidrogênio / trietilamina / N-metilpirrolidinona. Os oligonucleótidos correspondentes foram purificados por meio de eletroforese de poliacrilamida (20% de desnaturação) seguido por eluição, dessalinização e isolamento através de cromatografia de fase reversa (Sep-pak, coluna C18 ). A quantificação e os parâmetros estruturais foram avaliados através de análise fotométrica de dicroísmo circular (CD-UV) visível ultravioleta (UV-vis), respectivamente. Este relatório pretende servir como um recurso e guia para iniciantes e especialistas pesquisadores interessados ​​em embarcar neste campo. Espera-se que sirva como um trabalho em andamento à medida que novas tecnologias e metodologias são desenvolvidas. A descrição das metodologias e técnicas dentroO documento da S corresponde a um sintetizador de DNA / RNA (remodelado e comprado em 2013) que utiliza química de fosforamidite.

A síntese de dodecamers de RNA contendo zero, uma ou duas modificações de 2-tiofenilmetilo na posição C2&#39;- O é descrita juntamente com a sua correspondente purificação e caracterização. Além disso, está incluída uma descrição detalhada da análise estrutural que foi realizada via CD. As quatro cadeias de ARN (incluindo uma cadeia com uma sequência complementar) foram obtidas através de síntese em...

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Protocol for the Solid-phase Synthesis of Oligomers of RNA Containing a 2'-O-thiophenylmethyl Modification and Characterization via Circular Dichroism

Este artigo fornece um procedimento detalhado sobre a síntese em fase sólida, a purificação e a caracterização de dodecamers de ARN modificados na posição C2&#39;- O . As análises fotométricas UV-vis e dicroísmo circular são usadas para quantificar e caracterizar aspectos estruturais, ou seja , de uma única linha ou de duas vertentes.

Protocolo para síntese de fase sólida de oligómeros de ARN contendo um 2&#39;-<em&gt; O</em&gt; -tiofenilmetilo Modificação e Caracterização através do Dicroísmo Circular

Solid-phase synthesis has been used to obtain canonical and modified polymers of nucleic acids, specifically of DNA or RNA, which has made it a popular ...

protocol-for-solid-phase-synthesis-oligomers-rna-containing-2-o

Research

JoVE Journal

Chemistry

Protocol for the Solid-phase Synthesis of Oligomers of RNA Containing a 2'-O-thiophenylmethyl Modification and Characterization via Circular Dichroism

18.8K visualizações.  University of Colorado Denver.  Este artigo fornece um procedimento detalhado sobre a síntese em fase sólida, a purificação e a caracterização de dodecamers de ARN modificados na posição C2'- O . As análises fotométricas UV-vis e dicroísmo circular são usadas para quantificar e caracterizar aspectos estruturais, ou seja , de uma única linha ou de duas vertentes. 

Vídeo: Protocol for the Solid-phase Synthesis of Oligomers of RNA Containing a 2'-O-thiophenylmethyl Modification and Characterization via Circular Dichroism

Split-and-pool Synthesis and Characterization of Peptide Tertiary Amide Library

Peptidomimetics are great sources of protein ligands. The oligomeric nature of these compounds enables us to access large synthetic libraries on solid phase by using combinatorial chemistry. One of the most well studied classes of peptidomimetics is peptoids. Peptoids are easy to synthesize and have been shown to be proteolysis-resistant and cell-permeable. Over the past decade, many useful protein ligands have been identified through screening of peptoid libraries. However, most of the ligands identified from peptoid libraries do not display high affinity, with rare exceptions. This may be due, in part, to the lack of chiral centers and conformational constraints in peptoid molecules. Recently, we described a new synthetic route to access peptide tertiary amides (PTAs). PTAs are a superfamily of peptidomimetics that include but are not limited to peptides, peptoids and N-methylated peptides. With side chains on both &#945;-carbon and main chain nitrogen atoms, the conformation of these molecules are greatly constrained by sterical hindrance and allylic 1,3 strain. (Figure 1) Our study suggests that these PTA molecules are highly structured in solution and can be used to identify protein ligands. We believe that these molecules can be a future source of high-affinity protein ligands. Here we describe the synthetic method combining the power of both split-and-pool and sub-monomer strategies to synthesize a sample one-bead one-compound (OBOC) library of PTAs.

Peptide tertiary amides (PTAs) are a superfamily of peptidomimetics that include but are not limited to peptides, peptoids and N-methylated peptides. Here we describe a synthetic method which combines&#160;both split-and-pool and sub-monomer strategies to synthesize a one-bead one-compound library of PTAs.

Split-and-piscina Síntese e Caracterização de Peptídeos Terciário Amide Biblioteca

Peptidomimetics are great sources of protein ligands. The oligomeric nature of these compounds enables us to access large synthetic libraries on solid ...

Química

Synthesis and Characterization of Functionalized Metal-organic Frameworks

Metal-organic frameworks have attracted extraordinary amounts of research attention, as they are attractive candidates for numerous industrial and technological applications. Their signature property is their ultrahigh porosity, which however imparts a series of challenges when it comes to both constructing them and working with them. Securing desired MOF chemical and physical functionality by linker/node assembly into a highly porous framework of choice can pose difficulties, as less porous and more thermodynamically stable congeners (e.g., other crystalline polymorphs, catenated analogues) are often preferentially obtained by conventional synthesis methods. Once the desired product is obtained, its characterization often requires specialized techniques that address complications potentially arising from, for example, guest-molecule loss or preferential orientation of microcrystallites. Finally, accessing the large voids inside the MOFs for use in applications that involve gases can be problematic, as frameworks may be subject to collapse during removal of solvent molecules (remnants of solvothermal synthesis). In this paper, we describe synthesis and characterization methods routinely utilized in our lab either to solve or circumvent these issues. The methods include solvent-assisted linker exchange, powder X-ray diffraction in capillaries, and materials activation (cavity evacuation) by supercritical CO2 drying. Finally, we provide a protocol for determining a suitable pressure region for applying the Brunauer-Emmett-Teller analysis to nitrogen isotherms, so as to estimate surface area of MOFs with good accuracy.

Synthesis, activation, and characterization of intentionally designed metal-organic framework materials is challenging, especially when building blocks are incompatible or unwanted polymorphs are thermodynamically favored over desired forms. We describe how applications of solvent-assisted linker exchange, powder X-ray diffraction in capillaries and activation via supercritical CO2 drying, can address some of these challenges.

Síntese e caracterização de funcionalizados metal-organic frameworks

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Synthetic Methodology for Asymmetric Ferrocene Derived Bio-conjugate Systems via Solid Phase Resin-based Methodology

Early detection is a key to successful treatment of most diseases, and is particularly imperative for the diagnosis and treatment of many types of cancer. The most common techniques utilized are imaging modalities such as Magnetic Resonance Imaging (MRI), Positron Emission Topography (PET), and Computed Topography (CT) and are optimal for understanding the physical structure of the disease but can only be performed once every four to six weeks due to the use of imaging agents and overall cost. With this in mind, the development of &#8220;point of care&#8221; techniques, such as biosensors, which evaluate the stage of disease and/or efficacy of treatment in the clinician&#8217;s office and do so in a timely manner, would revolutionize treatment protocols.1 As a means to exploring ferrocene based biosensors for the detection of biologically relevant molecules2, methods were developed to produce ferrocene-biotin bio-conjugates described herein. This report will focus on a biotin-ferrocene-cysteine system that can be immobilized on a gold surface.

The synthesis of asymmetric species of ferrocene is challenging using solution techniques. This report focuses on the methods carried out to produce a ferrocene-biotin bioconjugate using facile and clean reactions accomplished via solid-phase synthesis. Incorporation of a thiolate moiety is shown to impart the ability for immobilization on gold surfaces.

Metodologia sintética para Asymmetric Ferroceno Derivados Sistemas Bio-conjugadas via Metodologia base de resina em Fase Sólida

Early detection is a key to successful treatment of most diseases, and is particularly imperative for the diagnosis and treatment of many types of cancer. ...

The Synthesis, Characterization and Reactivity of a Series of Ruthenium N-triphosPh Complexes

Herein we report the synthesis of a tridentate phosphine ligand N(CH2PPh2)3 (N-triphosPh) (1) via a phosphorus based Mannich reaction of the hydroxylmethylene phosphine precursor with ammonia in methanol under a nitrogen atmosphere. The N-triphosPh ligand precipitates from the solution after approximately 1 hr of reflux and can be isolated analytically pure via simple cannula filtration procedure under nitrogen. Reaction of the N-triphosPh ligand with [Ru3(CO)12] under reflux affords a deep red solution that show evolution of CO gas on ligand complexation. Orange crystals of the complex [Ru(CO)2{N(CH2PPh2)3}-&#954;3P] (2) were isolated on cooling to RT. The 31P{1H} NMR spectrum showed a characteristic single peak at lower frequency compared to the free ligand. Reaction of a toluene solution of complex 2 with oxygen resulted in the instantaneous precipitation of the carbonate complex [Ru(CO3)(CO){N(CH2PPh2)3}-&#954;3P] (3) as an air stable orange solid. Subsequent hydrogenation of 3 under 15 bar of hydrogen in a high-pressure reactor gave the dihydride complex [RuH2(CO){N(CH2PPh2)3}-&#954;3P] (4), which was fully characterized by X-ray crystallography and NMR spectroscopy. Complexes 3 and 4 are potentially useful catalyst precursors for a range of hydrogenation reactions, including biomass-derived products such as levulinic acid (LA). Complex 4 was found to cleanly react with LA in the presence of the proton source additive NH4PF6 to give [Ru(CO){N(CH2PPh2)3}-&#954;3P{CH3CO(CH2)2CO2H}-&#954;2O](PF6) (6).

The Synthesis, Characterization and Reactivity of a Series of Ruthenium N-triphosPh Complexes

Ruthenium phosphine complexes are widely used for homogeneous catalytic reactions such as hydrogenations. The synthesis of a series of novel tridentate ruthenium complexes bearing the N-triphos ligand N(CH2PPh2)3 is reported. Additionally, the stoichiometric reaction of a dihydride Ru&#8211;N-triphos complex with levulinic acid is described.

A Síntese, Caracterização e Reatividade de uma série de Rutênio<em&gt; N</em&gt; -triphos<sup&gt; Ph</sup&gt; Complexos

Herein we report the synthesis of a tridentate phosphine ligand N(CH2PPh2)3 (N-triphosPh) (1) via a phosphorus based Mannich reaction of the ...

A Direct, Early Stage Guanidinylation Protocol for the Synthesis of Complex Aminoguanidine-containing Natural Products

The guanidine functional group, displayed most prominently in the amino acid arginine, one of the fundamental building blocks of life, is an important structural element found in many complex natural products and pharmaceuticals. Owing to the continual discovery of new guanidine-containing natural products and designed small molecules, rapid and efficient guanidinylation methods are of keen interest to synthetic and medicinal organic chemists. Because the nucleophilicity and basicity of guanidines can affect subsequent chemical transformations, traditional, indirect guanidinylation is typically pursued. Indirect methods commonly employ multiple protection steps involving a latent amine precursor, such as an azide, phthalimide, or carbamate. By circumventing these circuitous methods and employing a direct guanidinylation reaction early in the synthetic sequence, it was possible to forge the linear terminal guanidine containing backbone of clavatadine A to realize a short and streamlined synthesis of this potent factor XIa inhibitor. In practice, guanidine hydrochloride is elaborated with a carefully constructed protecting array that is optimized to survive the synthetic steps to come. In the preparation of clavatadine A, direct guanidinylation of a commercially available diamine eliminated two unnecessary steps from its synthesis. Coupled with the wide variety of known guanidine protecting groups, direct guanidinylation evinces a succinct and efficient practicality inherent to methods that find a home in a synthetic chemist&#39;s toolbox.

Here, we present a protocol for direct, early stage guanidinylation that enables rapid total synthesis of aminoguanidine-containing small organic molecules. An advanced synthetic intermediate used in the synthesis of a blood coagulation factor XIa inhibitor was prepared using this protocol.

Um direto, Early Stage Guanidinylation Protocolo para a Síntese de complexos contendo aminoguanidina Produtos Naturais

The guanidine functional group, displayed most prominently in the amino acid arginine, one of the fundamental building blocks of life, is an important ...

Protocol for the Synthesis of Ortho-trifluoromethoxylated Aniline Derivatives

Molecules bearing trifluoromethoxy (OCF3) group often show desired pharmacological and biological properties. However, facile synthesis of trifluoromethoxylated aromatic compounds remains a formidable challenge in organic synthesis. Conventional approaches often suffer from poor substrate scope, or require use of highly toxic, difficult-to-handle, and/or thermally labile reagents. Herein, we report a user-friendly protocol for the synthesis of methyl 4-acetamido-3-(trifluoromethoxy)benzoate using 1-trifluoromethyl-1,2-benziodoxol-3(1H)-one (Togni reagent II). Treating methyl 4-(N-hydroxyacetamido)benzoate (1a) with Togni reagent II in the presence of a catalytic amount of cesium carbonate (Cs2CO3) in chloroform at RT afforded methyl 4-(N-(trifluoromethoxy)acetamido)benzoate (2a). This intermediate was then converted to the final product methyl 4-acetamido-3-(trifluoromethoxy)benzoate (3a) in nitromethane at 120 &#176;C. This procedure is general and can be applied to the synthesis of a broad spectrum of ortho-trifluoromethoxylated aniline derivatives, which could serve as useful synthetic building blocks for the discovery and development of new pharmaceuticals, agrochemicals, and functional materials.

Protocol for the Synthesis of Ortho-trifluoromethoxylated Aniline Derivatives

An operationally simple procedure for the synthesis of ortho-trifluoromethoxylated aniline derivatives via a two-step sequence of O-trifluoromethylation of N-aryl-N-hydroxyacetamide followed by thermally induced intramolecular OCF3-migration is reported.

Protocolo para a Síntese de Derivados de Anilina Orto-trifluorometoxilados

Molecules bearing trifluoromethoxy (OCF3) group often show desired pharmacological and biological properties. However, facile synthesis of ...

Synthesis and Characterization of Supramolecular Colloids

Control over colloidal assembly is of utmost importance for the development of functional colloidal materials with tailored structural and mechanical properties for applications in photonics, drug delivery and coating technology. Here we present a new family of colloidal building blocks, coined supramolecular colloids, whose self-assembly is controlled through surface-functionalization with a benzene-1,3,5-tricarboxamide (BTA) derived supramolecular moiety. Such BTAs interact via directional, strong, yet reversible hydrogen-bonds with other identical BTAs. Herein, a protocol is presented that describes how to couple these BTAs to colloids and how to quantify the number of coupling sites, which determines the multivalency of the supramolecular colloids. Light scattering measurements show that the refractive index of the colloids is almost matched with that of the solvent, which strongly reduces the van der Waals forces between the colloids. Before photo-activation, the colloids remain well dispersed, as the BTAs are equipped with a photo-labile group that blocks the formation of hydrogen-bonds. Controlled deprotection with UV-light activates the short-range hydrogen-bonds between the BTAs, which triggers the colloidal self-assembly. The evolution from the dispersed state to the clustered state is monitored by confocal microscopy. These results are further quantified by image analysis with simple routines using ImageJ and Matlab. This merger of supramolecular chemistry and colloidal science offers a direct route towards light- and thermo-responsive colloidal assembly encoded in the surface-grafted monolayer.

A protocol for the synthesis and characterization of colloids coated with supramolecular moieties is described. These supramolecular colloids undergo self-assembly upon the activation of the hydrogen-bonds between the surface-anchored molecules by UV-light.

Síntese e Caracterização de Supramoleculares Colloids

Control over colloidal assembly is of utmost importance for the development of functional colloidal materials with tailored structural and mechanical ...

Synthesis of Protein Bioconjugates via Cysteine-maleimide Chemistry

The chemical linking or bioconjugation of proteins to fluorescent dyes, drugs, polymers and other proteins has a broad range of applications, such as the development of antibody drug conjugates (ADCs) and nanomedicine, fluorescent microscopy and systems chemistry. For many of these applications, specificity of the bioconjugation method used is of prime concern. The Michael addition of maleimides with cysteine(s) on the target proteins is highly selective and proceeds rapidly under mild conditions, making it one of the most popular methods for protein bioconjugation.
We demonstrate here the modification of the only surface-accessible cysteine residue on yeast cytochrome c with a ruthenium(II) bisterpyridine maleimide. The protein bioconjugation is verified by gel electrophoresis and purified by aqueous-based fast protein liquid chromatography in 27% yield of isolated protein material. Structural characterization with MALDI-TOF MS and UV-Vis is then used to verify that the bioconjugation is successful. The protocol shown here is easily applicable to other cysteine - maleimide coupling of proteins to other proteins, dyes, drugs or polymers.

Synthesis of Protein Bioconjugates via Cysteine-maleimide Chemistry

This protocol details the important steps required for the bioconjugation of a cysteine containing protein to a maleimide, including reagent purification, reaction conditions, bioconjugate purification and bioconjugate characterization.

Síntese de Bioconjugados de proteínas<em&gt; via</em&gt; Química cisteína-maleimida

The chemical linking or bioconjugation of proteins to fluorescent dyes, drugs, polymers and other proteins has a broad range of applications, such as the ...

Microfluidic Dry-spinning and Characterization of Regenerated Silk Fibroin Fibers

The protocol demonstrates a method for mimicking the spinning process of silkworm. In the native spinning process, the contracting spinning duct enables the silk proteins to be compact and ordered by shearing and elongation forces. Here, a biomimetic microfluidic channel was designed to mimic the specific geometry of the spinning duct of the silkworm. Regenerated silk fibroin (RSF) spinning doped with high concentration, was extruded through the microchannel to dry-spin fibers at ambient temperature and pressure. In the post-treated process, the as-spun fibers were drawn and stored in ethanol aqueous solution. Synchrotron radiation wide-angle X-ray diffraction (SR-WAXD) technology was used to investigate the microstructure of single RSF fibers, which were fixed to a sample holder with the RSF fiber axis normal to the microbeam of the X-ray. The crystallinity, crystallite size, and crystalline orientation of the fiber were calculated from the WAXD data. The diffraction arcs near the equator of the two-dimensional WAXD pattern indicate that the post-treated RSF fiber has a high orientation degree.

A protocol for the microfluidic spinning and microstructure characterization of regenerated silk fibroin monofilament is presented.

Microfluidic seco-fiação e caracterização de fibras regeneradas da fibroína de seda

The protocol demonstrates a method for mimicking the spinning process of silkworm. In the native spinning process, the contracting spinning duct enables ...

Synthesis of Substrate-Bound Au Nanowires Via an Active Surface Growth Mechanism

Advancing synthetic capabilities is important for the development of nanoscience and nanotechnology. The synthesis of nanowires has always been a challenge, as it requires asymmetric growth of symmetric crystals. Here, we report a distinctive synthesis of substrate-bound Au nanowires. This template-free synthesis employs thiolated ligands and substrate adsorption to achieve the continuous asymmetric deposition of Au in solution at ambient conditions. The thiolated ligand prevented the Au deposition on the exposed surface of the seeds, so the Au deposition only occurs at the interface between the Au seeds and the substrate. The side of the newly deposited Au nanowires is immediately covered with the thiolated ligand, while the bottom facing the substrate remains ligand-free and active for the next round of Au deposition. We further demonstrate that this Au nanowire growth can be induced on various substrates, and different thiolated ligands can be used to regulate the surface chemistry of the nanowires. The diameter of the nanowires can also be controlled with mixed ligands, in which another &#34;bad&#34; ligand could turn on the lateral growth. With the understanding of the mechanism, Au nanowire-based nanostructures can be designed and synthesized.

We report a solution-based method to synthesize substrate-bound Au nanowires. By tuning the molecular ligands used during the synthesis, the Au nanowires can be grown from various substrates with different surface properties. Au nanowire-based nanostructures can also be synthesized by adjusting the reaction parameters.