ДНКАзиме-зависимое пищеварение является полезным методом для изучения функций сноРНК. Это быстрый и простой метод для анализа сайта конкретных РНК метилирования. Для этого требуется короткий олигонуклеотид ДНК и основные реагенты, присутствующие в любой лаборатории молекулярной биологии.
Начните с разработки DNAzyme для последовательности интереса. Найдите последовательность РНК или место метилирования с помощью соответствующей базы данных. Для целей S.cerevisiae snoRNA используйте базу данных дрожжей snoRNA.
Например, чтобы найти место метилирования, например, зависимое от snR13 место, выберите snR13 и обратите внимание на положение модифицированного нуклеотида. Найдите последовательность вверх и вниз по течению модифицированного нуклеотида с помощью соответствующей базы данных, такой как база данных генома Saccharomyces. Поиск имени гена цели.
При использовании анализа 10-23 ДНКАЗИМ выберите от 10 до 15 нуклеотидов вверх по течению и вниз по течению от места метилирования. При использовании 8-17 DNAzyme выберите 20 нуклеотидов. Создайте дополнительные последовательности пяти-премьер и три-премьер оружия и использовать их для фланга DNAzyme каталитической последовательности на трех-премьер и пять премьер-концов.
Закажите ДНКАзим как нормальный олигонуклеотид ДНК. Выращиваем дрожжевые штаммы, представляющие интерес в соответствующей среде и условиях. Когда клетки достигают средней экспоненциальной фазы, гранулы их центрифугирования на 1000 раз г в течение трех минут при четырех градусах по Цельсию и отказаться от среды.
Продолжить изоляцию РНК в соответствии с рукописными указаниями. Затем повторно посовестите гранулы РНК в 30 микролитров воды без RNase и DNase. Поместите трубку на лед и измерьте концентрацию РНК на микроспектрофотометре.
Для выполнения пищеварения DNAzyme с использованием 10 до 23 DNAzyme, подготовить инкубационный микс с пятью микрограммами РНК, 200 пикомолов от 10 до 23 DNAzyme, и один-X от 10 до 23 инкубационный буфер в общем объеме 10 микролитров. Затем инкубировать трубки на сухой тепловой блок установлен до 95 градусов по Цельсию в течение трех минут. Сразу после этого поместите трубки на лед и оставьте их там на пять минут.
Кратко спина вниз труб и положить их обратно на лед. Добавьте 20 единиц ингибитора RNase и поместите трубки на сухой тепловой блок, установленный до 25 градусов по Цельсию в течение 10 минут. Между тем, подготовить реакционной смеси путем объединения пяти микролитров 4-X 10 до 23 буфер реакции с четырьмя микролитров 300-молярного хлорида магния и один микролитер воды.
Разогреть эту реакцию смесь на сухой тепловой блок установлен до 37 градусов по Цельсию. Поместите трубку с инкубационной смесью на 37-градусный сухой тепловой блок по Цельсию и добавьте 10 микролитров довоенной смеси реакции. Инкубировать смесь при 37 градусах по Цельсию в течение одного часа, а затем, поместите трубку на лед.
Для выполнения пищеварения DNAzyme с помощью 8-17 DNAzyme, подготовить 1,5-миллилитровую микротрубку с пятью микрограммами РНК в общем объеме шесть микролитров. Затем подготовь отдельную трубку с 400 пикомолами 8-17 ДНАЗИМе. Во время работы держите обе трубы на льду.
Перенесите обе трубы в сухой тепловой блок, установленный до 95 градусов по Цельсию, и инкубировать их в течение двух минут. Перемести образец РНК обратно на лед и вращай трубку с ДНКАзимом в течение пяти секунд. Инкубировать DNAzyme при 25 градусах по Цельсию в течение 10 минут.
В то время как DNAzyme инкубирует, подготовить 10 mircoliters из двух-X 8-17 буфер реакции и довоенную его до 25 градусов по Цельсию. Добавьте довоенный буфер в трубку с помощью ДНКАзим, а затем перенесите 14 микролитров этой реакционной смеси в трубку с РНК, а также 20 единиц ингибитора RNase. Инкубировать реакцию при 25 градусах по Цельсию в течение двух часов, а затем, поместите трубку на лед.
Для очистки РНК после пищеварения ДНКАзима добавьте в реакционной трубке 350 микролитров воды и 400 микролитров хлороформа. Вихрь в течение 30 секунд и центрифуга при 20 000 раз г в течение пяти минут. После центрифугации перенесите верхнюю фазу в новую трубку, содержащую один миллилитр этанола, 40 микролитров 7,5-молярного ацетата аммония и один микролитр гликогена.
Переверните трубку несколько раз, чтобы смешать и инкубировать либо при отрицательных 80 градусов по Цельсию в течение двух часов или при отрицательных 20 градусов по Цельсию в одночасье. Продолжить очистку РНК в соответствии с рукописными указаниями, а затем, повторно приостановить РНК гранулы в 10 микролитров RNase и DNase свободной воды. Поместите РНК-трубку на лед сразу после очистки.
Для выполнения РНК-электрофорез, начните с растворения 1,5 грамма агарозы в 127,5-миллилитров двойной дистиллированной воды путем нагрева смеси в микроволновой печи. Затем добавьте 15 миллилитров 10X MOPS и 7,5 миллилитров 37%формальдегида в раствор агарозы. Добавьте соответствующее количество геля пятна в раствор агарозы.
Налейте агарозу в лоток и дайте ему остыть в течение 45 минут. Подготовь образцы РНК, объединив 10 микролитров переваренной и очищенной РНК с пятью микролитров буфера денатурации образца и 0,5 микролитров шести-X погрузочного красителя. Инкубировать образцы при 70 градусах по Цельсию в течение пяти минут, а затем, на льду в течение пяти минут.
Положите подготовленный гель в бак электрофорезы и заполните бак буфером ONE-X MOPS. Загрузите все 15 микролитров образца на гель и запустите гель на 80 вольт, пока бромотимол синий не достигнет 2/3 длины геля. Проанализируйте гель с соответствующим изображением.
Ценность этого метода может быть продемонстрирована на неуясной системе транскрипции snoRNA. Вставка неизгладимый промоутер GAL1 вверх по течению либо snR13 или snR47 генов позволяет для анализа snoRNA-зависимого метилирования 25S рибосомной РНК. Когда клетки выращиваются на галактозе, 25S рибосомная РНК метилируется в сноРНК управляемых участках и остается нетронутым после лечения DNAzyme.
В отличие от этого, когда выражение snoRNA выключен из-за отсутствия галактозы, DNAzyme зависимого расщепления происходит. Кроме того, не наблюдается переваривания РНК в контроле дикого типа, так как экспрессия сноРНК является галактозной независимой. Активность DNAzyme-зависимого расщепления в анализе наших модификаций рРНК была показана в последнее время в контексте созревания snoRNA.
Анализ, зависящий от ДНКАзыма, был использован, чтобы показать, что отсутствие пяти-премьер и предварительной обработки сноРНК влияет на уровни метилирования 25S и 18S rRNA в Saccharomyces cerevisiae. Этот протокол требует использования фенола и хлороформа, которые являются токсичными, и должны быть обработаны под капотом дыма.
