Nosso protocolo pode mapear a comunicação química de pequenas moléculas entre células e tecidos, e nós especificamente aplicamos isso para explorar pequenas moléculas na metatese do câncer de ovário. A principal vantagem de nossa técnica é a capacidade de medir pequenas moléculas de forma livre de rótulos, mantendo a integridade espacial das células e tecidos em 2D. Esta técnica nos permitiu interrogar a contribuição de pequenas moléculas em metástases de câncer de ovário de forma não alvo.
Isso poderia revelar novos alvos terapêuticos e caminhos que foram anteriormente negligenciados. Essa metodologia poderia facilmente ser estendida a outros cânceres que podem ser cultivados em agarose e qualquer outra doença em que um componente espacial possa ser importante para o fenótipo celular resultante. Garantir que todas as células e componentes estejam à mão e paciência com o processo de secagem é essencial para este protocolo.
Um passo de profano apressado pode muitas vezes levar a dados de espectrometria de massa de má qualidade. A demonstração visual deste método é útil na compreensão de nossas etapas de preparação e dessecação da amostra, pois elas se desviam muito de experimentos típicos de espectrometria de massa de imagem que usam tecidos ou micróbios no ágar. Para começar, liquefazer a agarose a 70 graus Celsius em uma placa quente.
Coloque o divisor de oito poços em cima do slide tratado pelo ITO. Através do tratamento padrão de trippsina, colete células MOE em um tubo cônico de 15 mililitros, centrífuga, e adicione uma vez mídia DMEM para resuspend para obter uma concentração de 50.000 células por 150 microliters, o que é duas vezes a densidade final desejada. Para coculturas não divididas, use fórceps para adicionar explante ovariana ao centro dos quatro poços.
Pouco antes do revestimento, combine 200 microliters de suspensão celular e 200 microliters de agarose liquefeita em tubos individuais de dois mililitros. Evite bolhas de ar durante a pipetação. Imediatamente, adicione 300 microliters da mistura celular-agarose a cada poço, e aplique pressão suave contínua para baixo no divisor para garantir que não haja vazamento ou mistura entre poços.
Certifique-se de que não há bolhas de ar e o ovário permanece no centro do poço. Se a agarose pipeted perturbou o ovário, use suavemente a ponta da pipeta para centralizá-la antes que a agarose esfrie. Em seguida, incubar o slide a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono em uma incubadora umidificada.
Para coculturas divididas, corte divisores de plástico fino e liso. Os lados de uma bacia de mídia estéril e descartável são usados. Corte-os apenas largo o suficiente para caber snugly na hipotenusa do poço.
Coloque o divisor de oito poços em cima do slide tratado pelo ITO e insira divisores plásticos na diagonal em poços. Prepare culturas celulares como feito anteriormente, e combine 100 microliters de suspensão celular e 100 microliters de agarose liquefeita em um tubo de dois mililitros. Imediatamente, a placa 150 microliters de mistura celular-agarose em um lado do divisor, mantendo a pressão para baixo sobre o divisor.
Deixe agarose esfriar e solidificar por aproximadamente um minuto e, em seguida, remova o divisor. Use fórceps para colocar o ovário no centro da metade vazia do poço. Adicione 150 microliters de mistura celular-agarose sobre o topo do ovário.
Incubar o slide a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono em uma incubadora umidificada. Depois de quatro dias, remova o divisor de câmara dos plugues de agarose. Com uma espátula plana, retire os lados da agarose da câmara, e puxe suavemente a câmara para cima.
Se algum plugue de garose for movido, reposicione-os suavemente para que não se toquem. Coloque o slide em um forno Celsius de 37 graus por aproximadamente quatro horas, e gire 90 graus a cada hora para garantir uma distribuição de calor uniforme em toda a amostra. O slide deve estar completamente seco.
Caso contrário, pode levar a uma explosão da amostra no ambiente de alto vácuo do espectrômetro de massa MALDI-TOF. Secar o slide e monitorar o progresso é o passo mais crítico para alcançar alta resolução espacial e espectros de massa de qualidade. Se ocorrerem descamas ou rugas excessivas, não recomendamos a coleta dos dados de espectrometria de massa.
Com os parâmetros definidos sobre o pulverizador de matriz, aplique solução de matriz ao slide. Para usar o Vermelho Fósforo como calibrante, adicione um microliter de Phosphorus Red a um ponto claro no slide. Para usar a mistura de peptídeo como calibrante, misture-a com matriz no Parafilm em uma proporção de um para um para ajudar a ionização, e local 0,5 a um microliter no slide.
Aguarde que o calibrante seque antes da aquisição de dados de espectrometria de massa por imagem. Desenhe um X usando um marcador permanente em cada canto do slide e tire uma imagem óptica usando uma câmera ou um scanner a 1200 dpi. Neste experimento, o monitoramento cuidadoso do escorregador no forno é essencial para garantir um slide oto seco ideal, o que resulta em uma amostra dessecada plana com rugas mínimas a nenhuma na superfície da ágarose.
Esta figura mostra as rugas que devem ser evitadas. Rugas podem afetar ligeiramente a altura e, portanto, a precisão de massa dos sinais de espectrometria de massa de imagem. Pequenas rugas não afetarão a qualidade dos dados.
Um tecido localizado de forma ideal deve estar o mais próximo possível do centro. O tecido utilizado deve estar no centro do poço se não estiver dividido ou no centro do meio triângulo se for dividido para que a aquisição de dados do IMS não esteja contaminada com efeitos de borda. Tecido mal posicionado, quando visualizado, pode resultar em falsos sinais de massa dos efeitos da borda.
A imagem de slides secos é usada para ensinar o espectrômetro de massa MALDI-TOF quais regiões para imagem. Pequenas regiões ao redor do tecido ovariano foram selecionadas para IMS a 50 micrômetros. Uma imagem representativa de um sinal m-over-z é mostrada para coculturas não divididas, bem como para a configuração dividida da câmara.
O mais importante a ser lembrado é que os dados resultantes são tão bons quanto a preparação da amostra. Preste atenção especial ao processo de secagem. O aspecto mais emocionante é validar as pequenas moléculas descobertas dessa forma usando outros experimentos, como ensaios de invasão ou ensaios de colonização, para informar sobre a concentração efetiva e traduzir para a biologia humana.
Esperamos que isso abra a porta para descobrir novos caminhos de potenciais alvos terapêuticos para o câncer de ovário, entendendo melhor os processos na metatese primária do câncer de ovário.
