O objetivo deste artigo é fornecer um protocolo visual detalhado e passo a passo para extrair metabólitos aquosos de células cancerígenas cultivadas para análise metabolome subsequente. A principal vantagem dessa técnica é sua simplicidade e confiabilidade para extrair metabólitos de células aderentes. Mas, acima de tudo, é bem otimizado para análise metabolome usando espectrometria de massa de eletroforese capilar ou CEMS.
Metabolômica é uma técnica poderosa para identificar biomarcadores ou detectar câncer em estágio inicial e prever a resposta quimioterapia a pacientes com câncer. Usamos células cancerígenas nesta demonstração. No entanto, essa técnica também pode ser aplicada para colher metabólitos de outras células aderentes, como fibroblastos em células iPS.
As concentrações metabólitos são normalizadas com base no número de células viáveis. Então, cuidadosa preparação da cultura, esta é a chave para a obtenção de bons dados reprodutíveis. Demonstrando o procedimento estará Ami Maruyama, um técnico do meu laboratório.
Para começar, as células placa HCC827 e PC-9 em pratos de 100 milímetros contendo 10 mililitros de RPMI-1640 médio suplementado com soro bovino 10%. Coloque os pratos em uma incubadora a 5% de dióxido de carbono e 37 graus Celsius por 24 horas para a cultura. Após a incubação, incline suavemente os pratos de cultura de 100 milímetros para aspirar a mídia de cultura celular.
Lave células em cada prato usando dois mililitros de solução salina tamponada com fosfato sem cálcio e magnésio. Balance suavemente cada prato para que a solução PBS cubra completamente a superfície do prato, em seguida, incline os pratos para aspirar o tampão de lavagem. Solução quente de 0,25% trypsin-EDTA a 37 graus Celsius.
Com uma pipeta sorológica de cinco mililitros, adicione dois mililitros da solução de trypsin-EDTA aquecida a cada prato. Balance suavemente cada prato para que o trypsin cubra completamente a superfície do prato. Incubar os pratos de cultura a 37 graus Celsius por aproximadamente cinco minutos.
Em seguida, adicione quatro mililitros do meio de crescimento completo pré-aquecido para cada prato. E gentilmente pipeta várias vezes para re-suspender as células em média. Transfira cada suspensão celular para um tubo cônico separado de 15 mililitros.
Centrifugar a 800 vezes g por cinco minutos. Descarte o supernasce e suspenda de re-suspensão cada pelota de célula em dois mililitros do meio de crescimento completo pré-aquecido. Misture 10 microliters da suspensão celular com 10 microliters de solução azul de 0,4% trypan, em um microtubo de 1,5 mililitro.
Carregue 10 microliters da mistura em uma câmara de contagem de células deslize através da ação capilar. Insira o slide da câmara no contador automático da célula e pressione o botão de captura para capturar a imagem e exibir os resultados do número total e a viabilidade por cento das células. Se o número total de células estiver acima de 0,5 milhões de células por mililitro, adicione mais meio de crescimento ao tubo cônico de 15 mililitros para obter a concentração celular desejada.
Agora, adicione dois a cinco mililitros da cultura a cada prato de cultura celular de 100 milímetros para semear aproximadamente um a 2 1/2 milhões de células por prato. Incubar os pratos da cultura em 5% de dióxido de carbono a 37 graus Celsius por 18 horas. Primeiro, em um frasco volumoso de 15 mililitros, diluir uma solução padrão interna comercial contendo sulfone L-Metionine e ácido D-Cânfora-10-sulfônico 1.000 vezes em água ultrapura.
Dissolver mannitol em água ultrauso para preparar uma solução de manitol de 0,05 gramas por mililitro em água ultrapura como tampão de lavagem. Em seguida, no copo de filtro de cada unidade de filtro centrífugo, pipeta 250 microliters de água ultrapura. Tampe as unidades do filtro firmemente, e centrífuga a 9.100 vezes g a quatro graus Celsius por cinco minutos.
Verifique o volume de cada filtrado. Se o filtrado significativo tiver se acumulado durante o primeiro giro curto, a unidade do filtro pode estar defeituosa. Descarte a unidade do filtro e use uma nova unidade de filtro.
Feche as tampas das unidades do filtro firmemente e centrífuga novamente a 9, 100 vezes g a quatro graus Celsius por 30 minutos. Certifique-se de que nenhuma água ultrauso permaneça em nenhum dos copos do filtro e remova a água ultrapura filtrada em cada tubo de coleta com uma pipeta. Coloque os copos do filtro de volta em seus tubos de coleta e use as unidades de filtro centrífugo dentro de uma hora para evitar danos ao secar.
Retire os pratos de cultura de 100 milímetros da incubadora e aspire o meio de cultura celular de cada prato. Adicione 10 mililitros de meio de cultura PBS com ou sem 250 diamidas micromolar a cada prato, tomando cuidado para não perturbar a camada celular. Incubar os pratos de cultura a 37 graus Celsius por 30 minutos.
Após a incubação, aspire o meio de cultura celular de cada prato de cultura de 100 milímetros. Incline ligeiramente o prato, e adicione suavemente dois mililitros de 5% de manitol lavar tampão na borda de cada prato para lavar as células, tomando cuidado para não perturbar a camada celular. Aspire o tampão de lavagem de cada prato de cultura, e lave as células novamente inclinando ligeiramente o prato e adicionando suavemente 10 mililitros de tampão de lavagem por prato.
Em seguida, aspirar completamente o tampão de lavagem da borda de cada prato de cultura. Agora, adicione 800 microliters de 99,7% de metanol por prato de cultura, e gentilmente balançar cada prato de cultura para frente e para trás, para cobrir toda a sua superfície. Deixe os pratos em temperatura ambiente por 30 segundos.
Adicione lentamente 550 microliters da solução padrão interna diluída por prato, imergindo a ponta da pipeta no metanol e gentilmente tubos para cima e para baixo, várias vezes. Balance suavemente cada prato de cultura para frente e para trás para cobrir toda a sua superfície, e deixe os pratos em temperatura ambiente por 30 segundos. Em seguida, transfira a solução extraída de cada prato de cultura para um tubo de microcentrífuga separado de 1,5 mililitro.
Centrifugar os tubos a 2.300 vezes g a quatro graus Celsius por cinco minutos. Transfira 700 microlitadores de cada supernaente para duas unidades de filtro centrífugas, com 350 microliters por unidade. Centrifugar os tubos do filtro a 9,100 vezes g a quatro graus Celsius por aproximadamente duas horas, até que nenhum líquido permaneça nos copos do filtro.
Remova os copos do filtro e feche bem as tampas dos tubos de coleta. Neste estudo, as células HCC827 e PC-9 cresceram igualmente por três horas. A análise do CEMS indica diferença entre células tratadas com diamida e células tratadas com PBS para ambas as linhas celulares.
Entre estes, vários intermediários na via fosfato pentose e na glicólise superior foram significativamente maiores nas condições tratadas com diamida, enquanto alguns intermediários do ciclo tricarboxílico foram menores nas condições tratadas. Perfis metabolomes de metabólitos intracelulares revelaram 175 e 150 metabólitos diferenciais nas células HCC827 e PC-9, respectivamente. Após o tratamento de diamida, o nível de ácido glucônico e glicose oxidada aumentou 12 vezes nas células HCC827 e 10 vezes nas células PC-9.
Da mesma forma, o nível de glicose 6-fosfato, uma glicose fosforilada no primeiro produto de glicólise catalisada por hexokinase, também aumentou 6,3 e 3,5 vezes nas células HCC827 e PC-9, respectivamente. Além disso, os níveis de 6-fosfogluconato, o primeiro intermediário na via fosfato pentose, aumentaram drasticamente 89 vezes em células HCC827 e 231 vezes em células PC-9. Em contraste, os níveis de outros intermediários glicógliticos, como a frutose 6-fosfato, não mudaram na condição experimental de diamida.
Os níveis totais de dinucleotídeos de nicotinamida dinucleotídeo foram quase equivalentes entre o tratamento de diamida e as condições de controle da PBS. Usar 5% de solução de mannil, além da PBS, como tampão de lavagem para células de lavagem é muito importante para a análise do CEMS, pois os buffers à base de sal interferem na análise e afetam negativamente a medição. Este protocolo é inadequado para extrair metabólitos hidrofóbicos como lipídios, por isso precisamos desenvolver um protocolo para extrair convenientemente metabólitos hidrofílicos e hidrofóbicos para análise metabolômica mais abrangente.
Esta técnica realiza uma fácil extração de metabólitos de quase todas as células aderentes e, portanto, é aplicável para uma variedade de pesquisas como câncer, células-tronco, farmacologia, nutrição e ciência cosmética.
