我々のプロトコルは、細胞と組織の間の低分子化学通信をマッピングすることができ、我々は特に卵巣癌メタセシスの小分子を探求するためにこれを適用しました。この技術の主な利点は、細胞と組織の空間的完全性を2Dで維持しながら、ラベルフリーの方法で小分子を測定できることです。この技術により、卵巣癌転移における小分子の寄与を、標的のない方法で問い込むことができた。
これは、以前に見落とされていた新しい治療目標と経路を明らかにすることができます。この方法論は、アガロースで増殖できる他の癌や、結果として生じる細胞表現型にとって空間的成分が重要である可能性のある他の疾患に容易に拡張することができる。すべての細胞とコンポーネントが手に入り、乾燥プロセスに対する忍耐力を確保することは、このプロトコルにとって不可欠です。
急いで乾燥ステップを行うと、質の悪い質量分析データが得られることが多い。この方法の視覚的なデモンストレーションは、寒天上の組織または微生物を使用する典型的なイメージング質量分析実験から大きく逸脱するため、サンプル調製および乾燥ステップを理解するのに役立ちます。まず、ホットプレートでアガロースを摂氏70度で液化します。
ITO処理スライドの上に8ウェルディバイダーを置きます。標準的なトリプシン処理を介して、MOE細胞を15ミリリットル円錐形チューブ、遠心分離機に集め、DMEM培地を1回加えて再懸濁し、150マイクロリットル当たり50,000細胞の濃度を得る。分割されていない共同培養の場合は、鉗子を使用して4つの井戸の中心に卵巣外植を加えます。
めっきの直前に、200マイクロリットルの細胞懸濁液と200マイクロリットルのリ定量アガロースを個々の2ミリリットルチューブに組み合わせます。ピペットの際に気泡を避けてください。すぐに、各ウェルに細胞アガロース混合物の300マイクロリットルを追加し、井戸間の漏れや混合を確実にするために、仕切りに連続的な穏やかな下向き圧力を適用します。
気泡がなく、卵巣が井戸の中央に残っていることを確認してください。ピペット状のアガロースが卵巣を乱した場合は、ピペットチップをそっと使用してアガロースが冷める前に中央に配置します。次に、加湿インキュベーターで37°C、炭酸ガス5%でスライドをインキュベートします。
分割された共同培養物の場合は、薄くて滑らかなプラスチックから仕切り分げをカットします。滅菌、使い捨て媒体の洗面器の側面が使用される。井戸の斜辺にぴったりと収まるほど広く切ります。
ITO処理スライドの上に8ウェルディバイダーを置き、プラスチック製の仕切り機を斜めに井戸に挿入します。先に行われたように細胞培養を調製し、2ミリリットルチューブに100マイクロリットルの細胞懸濁液と100マイクロリットルのリケ化アガロースを組み合わせます。直ちに、150マイクロリットルのセルアガロース混合物を仕切りの片側にプレートし、仕切り上げに下降圧力を保つ。
アガロースを約1分間冷却して固め、仕切りを取り除きます。鉗子を使用して、井戸の空の半分の中央に卵巣外植を配置します。卵巣の上に150マイクロリットルの細胞アガロース混合物を加える。
加湿インキュベーターで37°C、炭酸ガス5%でスライドをインキュベートします。4日後、アガロースプラグからチャンバーディバイダーを取り外します。平らなへらで、アガロースの側面をチャンバーから取り外し、チャンバーを優しく上に引っ張ります。
アガロースプラグが動かされた場合は、互いに触れていないようにそっと位置を変更します。スライドを約4時間摂氏37度のオーブンに入れ、1時間ごとに90度回転させて、サンプル全体に熱を分配します。スライドは完全に乾燥する必要があります。
それ以外の場合は、MALDI-TOF質量分析計の高真空環境でサンプルの爆発につながる可能性があります。スライドを乾燥し、進行状況を監視することは、高い空間分解能と品質の質量スペクトルを達成するための最も重要なステップです。剥離や過度のしわが発生した場合は、質量分析データを収集することはお勧めしません。
マトリックス噴霧器にパラメータを設定して、マトリックス溶液をスライドに適用します。リンレッドをキャリブラントとして使用するには、スライド上の明確な場所に1マイクロリットルのリンレッドを追加します。ペプチド混合物をキャリブラントとして使用するには、1対1の比率でパラフィルム上のマトリックスと混合してイオン化を助け、0.5~1マイクロリットルをスライドにスポットします。
質量分析データ取得をイメージングする前に、キャリブレーションが乾燥するのを待ちます。スライドの各隅に固定マーカーを使用してXを描き、1200 dpiのカメラまたはスキャナを使用して光学画像を撮影します。この実験では、オーブン内のスライドを注意深く監視することが不可欠であり、最適な乾燥ITOスライドを確保するために、アガロースの表面全体にシワを最小限に抑えた平らな乾燥したサンプルを生じる。
この図は、避けるべきしわを示しています。シワは高さにわずかに影響を与える可能性があり、したがって、イメージング質量分析信号の質量精度。わずかなしわはデータの品質に影響しません。
最適に配置された組織は、可能な限り中心に近いはずです。使用される組織は、それが分割されていない場合はウェルの中心に、またはIMSデータの取得がエッジ効果で汚染されないように分割されている場合は半分の三角形の中心にあるべきです。不地に位置した組織は、画像化されると、エッジ効果から偽の質量信号を生じる可能性があります。
乾燥したスライド画像は、どの領域を画像にするかをMALDI-TOF質量分析計に教えるために使用されます。卵巣組織の周りの小さな領域は、50マイクロメートルでIMSのために選択された。m-over z信号の代表的な画像は、分割されていない共培養だけでなく、分割されたチャンバーのセットアップのために示されています。
最も重要なことは、結果のデータはサンプル調製と同じだけであるということです。乾燥プロセスに特に注意してください。最もエキサイティングな側面は、侵略アッセイやコロニー形成アッセイなどの他の実験を用いて、この方法で発見された小分子を検証して、有効な濃度を知らせ、ヒト生物学に翻訳することです。
これは、卵巣癌の原発性転移の過程をよりよく理解することによって、卵巣癌の潜在的な治療標的の新しい経路を発見する扉を開くことを期待する。
