Esse método pode ajudar a abordar questões-chave na biologia, como como diversos tipos de células são geradas e organizadas em estruturas de ordem superior com funções específicas. A principal vantagem dessa técnica é que ela facilita a purificação eficiente das células presentes em baixa abundância no sistema visual Drosophila para análise transcriômica e genômica. Na terça-feira da sexta semana do protocolo, 45 minutos antes das dissecções, recupere um frasco de pó de papain de quatro graus Celsius e incuba-o em temperatura ambiente.
Em seguida, reserve o Medium completo de Schneider, ou CSM, em um tubo Eppendorf à temperatura ambiente para adicionar ao pó de papain mais tarde. Cinco a dez minutos antes das dissecções, use uma seringa para adicionar a temperatura ambiente CSM ao frasco de papain diretamente através da tampa a uma concentração de 100 unidades por mililitro. Para misturar, primeiro inverta o frasco para capturar qualquer pó preso no interior da tampa e, em seguida, pipeta o conteúdo para cima e para baixo.
Depois de misturar os reagentes, leve a água até 37 graus Celsius em um béquer em um banho de água. Em seguida, coloque o frasco no béquer por 30 minutos para ativar o papain e certifique-se de que o frasco não está flutuando. Enquanto o papain está incubando, recupere uma alíquota de mistura de enzimas proteolíticas do congelador e incuba-a à temperatura ambiente.
Após 30 minutos de ativação, incubar o papain à temperatura ambiente. Na terça-feira da sexta semana, dissequei os cérebros da pupila encenada em CSM frio com fórceps limpos. Disseca o máximo de cérebros possível em 10 minutos e acumule os cérebros em uma nova gota de CSM frio.
Corte os lóbulos ópticos beliscando na junção do lobo óptico e do cérebro central. Em seguida, adicione os lóbulos na parte inferior de um microtubo contendo 500 microliters de 1x RS. Um microtubo para o tecido experimental e outro para o tecido de controle negativo. Mantenha os tubos no gelo.
Dissecar o máximo de lóbulos possível em uma hora. Acumule os lóbulos ópticos dissecados em um único microtubo para eliminar a perda de tecido durante a transferência entre microtubos. Remova cuidadosamente o 1x RS do microtubo com os lóbulos ópticos dissecados usando uma pipeta P200, deixando solução suficiente para cobrir os lóbulos.
Adicione cuidadosamente 500 microliters de 1x RS ao lado do tubo. Deixe os lóbulos se acomodarem no fundo do tubo, depois pipeta até 200 microliters. Expulse a mistura, observe os lóbulos se movendo e deixe os lóbulos se acomodarem novamente.
Para as duas amostras, alíquota de 600 microliters de temperatura ambiente ativada em um microtubo. Em seguida, crie a solução de dissociação. Adicione 4,2 microliters de enzima proteolítica de temperatura ambiente misture-a em 600 microliters de solução papain para obter uma concentração final de 0,18 WU por mililitro e misture a solução pipetando-a para cima e para baixo.
Em seguida, remova cuidadosamente o 1x RS de cada amostra e adicione 300 microliters de solução de dissociação aos lóbulos. Incubar as amostras a 25 graus Celsius. 1.000 RPM por 15 minutos em um microtubo ThermoMixer.
Nos pontos de tempo de 5 e 10 minutos, pare o ThermoMixer e deixe os lóbulos afundarem até o fundo do microtubo. Pipeta até 200 microliters da solução e mistura. Após a incubação de 15 minutos, espere que os lóbulos se acomodem até o fundo e remova cuidadosamente a solução de dissociação dos lóbulos sem perturbar os lóbulos.
Lave os lóbulos duas vezes com 1x RS. Adicione cuidadosamente 500 microliters de 1x RS sem perturbar os lóbulos. Em seguida, pipeta cuidadosamente até 200 microliters e expulse suavemente a solução. Deixe os lóbulos afundarem até o fundo e repita.
Em seguida, lave cada amostra duas vezes com 500 microliters de CSM. Remova cuidadosamente o CSM e adicione mais 200 microliters de CSM ao tubo. Usando uma pipeta P200, interrompa o tecido pipetando para cima e para baixo sem espumar até que a solução seja homogênea.
Usando uma pipeta P200, filtre a suspensão celular através de uma tampa de malha de 30 micrômetros em um tubo de fax de 5 mililitros no gelo. E certifique-se de que toda a suspensão passe. Adicione 500 microliters de CSM para enxaguar o microtubo de dissociação.
E filtrar a solução no tubo de fax. Por fim, tire cuidadosamente a tampa do tubo de fax. Colete a solução por baixo do filtro de malha com um P200 e adicione-a ao resto da suspensão no tubo de fax.
A microscopia confocal de lóbulos imunossurados com anticorpos específicos contra DsRed e GFP, bem como o anticorpo 24B10 como referência para os neuropilos Lamina e Medulla confirmou que L3 é o único tipo de célula rotulado por DsRed e GFP no lobo óptico. Foram registrados dados de fatos de 100.000 eventos, dos quais 29,9% de todos os eventos são potenciais singlets. Depois que os doublets em células com diferentes tamanhos foram fechados com base na granularidade e tamanho, as células únicas restantes, neurônios L3, apareceram como aglomerados apertados em P1, que foi bem separado das células de fundo.
Após esse procedimento, outros métodos como RNA-seq ou ATAC-seq podem ser realizados para abordar questões biológicas através da análise da expressão genética ou organização da cromatina, respectivamente. Essa técnica avança consideravelmente na capacidade dos pesquisadores de explorar os mecanismos genéticos subjacentes ao desenvolvimento e função de tecidos complexos usando o sistema visual Drosophila como modelo.
