Este método puede ayudar a abordar preguntas clave en biología, como cómo se generan y organizan diversos tipos de células en estructuras de orden superior con funciones específicas. La principal ventaja de esta técnica es que facilita la purificación eficiente de las células presentes en una baja abundancia en el sistema visual Drosophila para el análisis transcriptómico y genómico. El martes de la semana seis del protocolo, 45 minutos antes de las disecciones, recuperar un vial de polvo de papaína de cuatro grados celsius e incubarlo a temperatura ambiente.
A continuación, reserve el medio de Complete Schneider, o CSM, en un tubo de Eppendorf a temperatura ambiente para añadirlo al polvo de papaína más tarde. Cinco a diez minutos antes de las disecciones, utilice una jeringa para añadir la temperatura ambiente del CSM al vial de papaína directamente a través de la tapa a una concentración de 100 unidades por mililitro. Para mezclar, primero invierta el vial para capturar cualquier polvo atascado en el interior de la tapa y luego pipetee el contenido hacia arriba y hacia abajo.
Después de mezclar los reactivos, lleve el agua hasta 37 grados celsius en un vaso de precipitados en un baño de agua. A continuación, coloque el vial en el vaso de precipitados durante 30 minutos para activar la papaína y asegúrese de que el vial no esté flotando. Mientras la papaína está incubando, recupera una alícuota de mezcla de enzimas proteolíticas del congelador e incuba a temperatura ambiente.
Después de 30 minutos de activación, incubar la papaína a temperatura ambiente. El martes de la semana seis, disecciona los cerebros de las pupilas escenificadas en SM frío con fórceps limpios. Disecciona tantos cerebros como sea posible en 10 minutos y agrupa los cerebros en una nueva gota de CSM frío.
Corte los lóbulos ópticos pellizcando la unión del lóbulo óptico y el cerebro central. A continuación, agregue los lóbulos a la parte inferior de un microtubo que contenga 500 microlitros de 1x RS. Un microtubo para el tejido experimental y otro para el tejido de control negativo. Mantenga los tubos en hielo.
Disecciona tantos lóbulos como sea posible en una hora. Acomoda los lóbulos ópticos diseccionados en un solo microtubo para eliminar la pérdida de tejido durante la transferencia entre microtubos. Retire cuidadosamente el 1x RS del microtubo con los lóbulos ópticos diseccionados utilizando una pipeta P200, dejando suficiente solución para cubrir los lóbulos.
Agregue cuidadosamente 500 microlitros de 1x RS al lado del tubo. Deje que los lóbulos se asienten en la parte inferior del tubo, luego pipetee hasta 200 microlitros. Expulsar la mezcla, observar los lóbulos en movimiento y dejar que los lóbulos se asienten de nuevo.
Para las dos muestras, aliquot 600 microlitros de papaína activada a temperatura ambiente en un microtubo. A continuación, cree la solución de disociación. Añadir 4,2 microlitros de mezcla de enzima proteolítica a temperatura ambiente en 600 microlitros de solución de papaína para obtener una concentración final de 0,18 WU por mililitro y mezclar la solución pipeteándola hacia arriba y hacia abajo.
A continuación, retire cuidadosamente el 1x RS de cada muestra y agregue 300 microlitros de solución de disociación a los lóbulos. Incubar las muestras a 25 grados centígrados. 1.000 RPM durante 15 minutos en un microtubo ThermoMixer.
En los puntos de tiempo de 5 y 10 minutos, detenga el ThermoMixer y deje que los lóbulos se hundan hasta el fondo del microtubo. Pipetear hasta 200 microlitros de la solución y mezclar. Después de la incubación de 15 minutos, espere a que los lóbulos se asienten en el fondo y retire cuidadosamente la solución de disociación de los lóbulos sin alterar los lóbulos.
Lave los lóbulos dos veces con 1x RS. Añadir cuidadosamente 500 microlitros de 1x RS sin molestar los lóbulos. A continuación, pipetee cuidadosamente 200 microlitros y expulse suavemente la solución. Deje que los lóbulos se hundan hasta el fondo y repitan.
A continuación, lave cada muestra dos veces con 500 microlitros de CSM. Retire con cuidado el CSM y agregue otros 200 microlitros de CSM al tubo. Con una pipeta P200, interrumpa el tejido pipeteando hacia arriba y hacia abajo sin espuma hasta que la solución sea homogénea.
Con una pipeta P200, filtre la suspensión de la celda a través de una tapa de malla de 30 micrómetros en un tubo de fax de 5 mililitros sobre hielo. Y asegúrate de que toda la suspensión pase. Añadir 500 microlitros de CSM para enjuagar el microtubo de disociación.
Y filtre la solución en el tubo de fax. Por último, quite cuidadosamente la tapa del tubo de fax. Recoja la solución debajo del filtro de malla con un P200 y agréguela al resto de la suspensión en el tubo de fax.
La microscopía confocal de lóbulos inmuno manchados con anticuerpos específicos contra DsRed y GFP, así como el anticuerpo 24B10 como referencia para las neuropilas Lamina y Medulla confirmaron que L3 es el único tipo de célula etiquetado por DsRed y GFP en el lóbulo óptico. Se registraron datos de hechos de 100.000 eventos, de los cuales el 29,9% de todos los eventos son posibles singletes. Después de que los dobletes en células con diferentes tamaños fueron cerrados en función de la granularidad y el tamaño, las células individuales restantes, las neuronas L3, aparecieron como grupos apretados en P1, que estaba bien separado de las células de fondo.
Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como el ARN-seq o el ATAC-seq para abordar las preguntas biológicas a través del análisis de la expresión génica o la organización de la cromatina, respectivamente. Esta técnica avanza considerablemente la capacidad de los investigadores para explorar los mecanismos genéticos subyacentes al desarrollo y la función de tejidos complejos utilizando el sistema visual Drosophila como modelo.
