שיטה זו יכולה לסייע לענות על שאלות מפתח בביולוגיה, כגון כיצד סוגי תאים מגוונים נוצרים ומאורגנים במבנים מסדר גבוה יותר עם פונקציות ספציפיות. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת טיהור יעיל של תאים הקיימים בשפע נמוך במערכת הראייה Drosophila לניתוח תעתיק וגנומי. ביום שלישי בשבוע השישי של הפרוטוקול, 45 דקות לפני הניתוחים, לאחזר בקבוקון אחד של אבקת פפאין מארבע מעלות צלזיוס ו דגירה אותו בטמפרטורת החדר.
לאחר מכן, הניחו בצד את המדיום של שניידר, או CSM, בצינור אפנדורף בטמפרטורת החדר כדי להוסיף לאבקת הפפאין מאוחר יותר. חמש עד עשר דקות לפני הניתוחים, השתמש במזרק כדי להוסיף את טמפרטורת החדר CSM לבקבוקון של פפאין ישירות דרך הכובע לריכוז של 100 יחידות למיליליטר. כדי לערבב, תחילה להפוך את הבקבוקון כדי ללכוד כל אבקה תקועה בחלק הפנימי של הכובע ולאחר מכן pipette את התוכן למעלה ולמטה.
לאחר ערבוב reagents, להביא את המים עד 37 מעלות צלזיוס בסק במזנון באמבט מים. לאחר מכן מניחים את הבקבוקון בתוך הבקבוק במשך 30 דקות כדי להפעיל את papain ולוודא כי הבקבוקון אינו צף. בזמן שהפאפאין דגירה, יש לאחזר מהמקפיא תערובת של אנזימים פרוטאוליטיים ולטגירה בטמפרטורת החדר.
לאחר 30 דקות של הפעלה, הדגירה פפאין בטמפרטורת החדר. ביום שלישי בשבוע השישי, לנתח את המוחות התלמידים מבוים ב CSM קר עם מדפים נקיים. לנתח מוחות רבים ככל האפשר בתוך 10 דקות ולאסוף את המוח טיפה טרייה של CSM קר.
חותכים את האונות האופטיות על ידי צביטה בצומת של האונה האופטית והמוח המרכזי. לאחר מכן, להוסיף את האונות לתחתית של microtube המכיל 500 microliters של RS 1x. מיקרו-צינור אחד לרקמה הניסיונית ואחד לרקמת הבקרה השלילית. תשאיר את הצינורות על הקרח.
לנתח כמו אונות רבות ככל האפשר בשעה אחת. בריכת האונות האופטיות נותח ב microtube יחיד כדי למנוע אובדן רקמות במהלך העברה בין microtubes. בזהירות להסיר את RS 1x מן המיקרובה עם האונות האופטיות נותח באמצעות פיפטה P200, משאיר מספיק פתרון כדי לכסות את האונות.
בזהירות להוסיף 500 microliters של RS 1x לצד של הצינור. תן לאונות להתיישב לתחתית הצינור, ואז פיפטה עד 200 מיקרוליטר. לגרש את התערובת, להתבונן האונות נעות ולאפשר את האונות להתיישב שוב.
עבור שתי הדגימות, aliquot 600 microliters של מופעל, פפאין טמפרטורת החדר לתוך microtube. לאחר מכן, צור את פתרון הדיסוציאציה. הוסיפו 4.2 מיקרוליטרים של תערובת אנזימים פרוטאוליטיים בטמפרטורת החדר ל-600 מיקרוליטרים של תותב פפאין כדי להשיג ריכוז סופי של 0.18 WU למיליליטר ולערבב את הפתרון על ידי צינורות למעלה ולמטה.
לאחר מכן להסיר בזהירות את RS 1x מכל מדגם ולהוסיף 300 microliters של פתרון דיסוציאציה לאונות. דגירה הדגימות ב 25 מעלות צלזיוס. 1,000 סל"ד למשך 15 דקות במיקרו-טיוב תרמומיקסר.
בנקודות הזמן של 5 ו -10 דקות, עצרו את ThermoMixer ותנו לאונות לשקוע לתחתית המיקרו-צינור. פיפטה עד 200 microliters של הפתרון ולערבב. לאחר הדגירה של 15 דקות, המתינו לאונות להתיישב בתחתית ולהסיר בזהירות את ת פתרון הדיסוציאציה מהאונות מבלי להפריע לאונות.
לשטוף את האונות פעמיים עם RS 1x. בזהירות להוסיף 500 microliters של RS 1x מבלי להפריע האונות. ואז בזהירות pipette עד 200 microliters בעדינות לגרש את הפתרון. אפשר לאונות לשקוע לתחתית ולחזור.
לאחר מכן, לשטוף כל מדגם פעמיים עם 500 microliters של CSM. בזהירות להסיר את CSM ולהוסיף עוד 200 microliters של CSM לצינור. באמצעות פיפטה P200, לשבש את הרקמה על ידי צינור למעלה ולמטה ללא קצף עד הפתרון הוא הומוגני.
באמצעות פיפטה P200, לסנן את ההשעיה התא דרך כובע רשת 30 מיקרומטר לתוך צינור פקס 5 מיליליטר על קרח. ותוודא שכל ההשעיה עוברת. הוסף 500 מיקרוליטרים של CSM כדי לשטוף את מיקרו-צינור הדיסוציאציה.
ולסנן את הפתרון לתוך צינור הפקס. לבסוף, בזהירות להסיר את הכובע של צינור הפקס. לאסוף את הפתרון מתחת למסנן רשת עם P200 ולהוסיף אותו לשאר ההשעיה בצינור הפקס.
מיקרוסקופיה קונפוקלית של אונות מוכתמות אימונו עם נוגדנים ספציפיים נגד DsRed ו- GFP, כמו גם את הנוגדן 24B10 כהתייחסות נוירופילים Lamina ו Medulla אישר כי L3 הוא סוג התא היחיד שכותרתו על ידי הן DsRed ו GFP באונה האופטית. נתוני עובדות מ-100,000 אירועים נרשמו, מהם 29.9% מכלל האירועים הם סינגלים פוטנציאליים. לאחר כפילויות בתאים בגדלים שונים היו מגודרים על בסיס צפיפות וגודל, התאים הבודדים הנותרים, נוירונים L3, הופיעו כמו אשכולות הדוקים P1, אשר היה מופרד היטב מתאי הרקע.
בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו RNA-seq או ATAC-seq כדי לענות על שאלות ביולוגיות באמצעות ניתוח של ביטוי גנים או ארגון כרומטין, בהתאמה. טכניקה זו מקדמת במידה ניכרת את היכולת של החוקרים לחקור את המנגנונים הגנטיים שבבסיס הפיתוח והתפקוד של רקמות מורכבות באמצעות מערכת הראייה Drosophila כמודל.
