Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave no campo reprodutivo, como como determinar o aparecimento pubertal em camundongos e ratos através de separação pré-putial, abertura vaginal e estabelecer primeiros estrus antes de realizar um estudo de fertilidade. A principal vantagem dessa técnica é que, ao estabelecer o início pubertal utilizando a abordagem não invasiva demonstrada, é possível acompanhar e realizar um estudo de fertilidade em animais sexualmente maduros. As implicações dessa técnica se estendem ao diagnóstico de déficits na reprodução, causados por mutações genéticas ou tratamentos suscetíveis à competência reprodutiva de impacto, como produtos químicos endócrinos.
Embora este método possa fornecer uma visão da competência reprodutiva em camundongos, ele também pode ser aplicado a outros sistemas de modelo, como ratos e hamsters. A demonstração visual deste método é fundamental, pois requer boas e delicadas habilidades de manejo animal. É particularmente importante segurar os camundongos corretamente para a seguinte identificação visual de separação pré-putial e abertura vaginal.
Para preparar a área de trabalho, coloque um bloco sobre a mesa. Em seguida, coloque uma parte superior limpa da gaiola do mouse com a grade voltada para cima, na almofada. Em seguida, montar uma escala na área de trabalho.
Coloque um béquer limpo de 500 a 1000 mililitros na balança e o coloque. Em seguida, coloque uma folha ao lado da área de trabalho para registrar os dados. Depois disso, coloque a gaiola do rato na área de trabalho.
Abra a gaiola e remova a tampa, a garrafa de água e o suporte de alimentos para a mesa. Enquanto segura o mouse pela cauda, coloque-o na parte superior limpa da gaiola do mouse. Mantendo o controle da cauda, permita que o mouse explore a grade do topo da gaiola.
Puxe suavemente a cauda para trás e aproxime-se da outra mão para a pele perto do pescoço e orelhas. Segure a pele solta entre os ombros e o pescoço com o polegar e o dedo indicador. Em seguida, pegue a pele nas costas com os dedos restantes e segure o mouse pressionando-o suavemente contra a mão.
Com a mão livre, empurre suavemente a pele ao redor do pênis para trás. Na separação pré-putial, a pele pré-putial desliza para trás, expondo o pênis glande. Após o exame, regise a presença ou ausência de separação pré-putial.
Depois disso, pese o mouse e regisse seu peso. Em seguida, reintroduzir o rato na gaiola de habitação segurando o béquer sobre o chão da gaiola e permitindo que o rato saia por conta própria. Coloque uma bola de algodão, um grande béquer, e uma garrafa de água estéril na área de trabalho.
Despeje água estéril no béquer. Em seguida, umidificar a bola de algodão com a água estéril no béquer, e colocá-la ao lado do topo da gaiola limpa. Coloque a gaiola do rato na área de trabalho.
Em seguida, transfira o mouse para o topo da gaiola segurando-o pela base de sua cauda. Puxe suavemente a cauda do mouse para encorajar um movimento para a frente pelo mouse. Depois disso, levante a cauda enquanto apoia os quadris com três dedos.
Limpe suavemente a vulva com a bola de algodão umidificada, em seguida, examine a vulva para determinar se a vagina está completamente aberta. Regisso se ocorreu abertura vaginal. Em seguida, pese o rato e devolva-o para a gaiola.
Prepare uma gaiola de rato limpa com tampa, água, comida, roupa de cama e material de aninhamento para cada par de camundongos. Em seguida, preencha os cartões da gaiola com as informações necessárias. Coloque a gaiola de cama preparada sobre uma mesa limpa, em seguida, introduza lentamente uma mão enluvada na gaiola do rato e deixe-a na gaiola por um curto período de tempo.
Aproxime-se lentamente dos ratos com a mão enluvada. Quando os ratos passarem por cima da mão, pegue a cauda de um rato entre o polegar e o dedo indicador, em seguida, levante o mouse pela cauda. O mouse pode ser segurado pela cauda sem suporte do corpo por até dois a três segundos.
Coloque o rato na gaiola de reprodução preparada e feche a gaiola depois de garantir que os camundongos machos e fêmeas tenham alimentos, água e material de aninhamento. Utilizando o método apresentado, foram estudados dois modelos diferentes de camundongos transgênicos. Abertura vaginal e separação pré-putial ocorreram na mesma idade e peso tanto nos camundongos heterozigosos quanto nos camundongos de controle.
Por outro lado, a abertura vaginal e a separação pré-putial foram significativamente em fêmeas e machos nocaute condicional, e associadas ao aumento do peso corporal. Com 4,5 semanas de idade, os controles femininos e os ratos eliminatórios condicionales tinham peso corporal comparável, enquanto os machos de nocaute condicional eram ligeiramente mais pesados que os controles. Isso indica que o atraso na abertura vaginal e a separação pré-putial dos camundongos eliminatórios condicional não foram associados a um atraso no ganho de peso.
Após a conclusão do início pubertal, o estudo de fertilidade foi iniciado aos 10 a 16 semanas. Ambos os camundongos heterozigotos machos e fêmeas eram subfértil. As fêmeas heterozigotos geraram menos ninhadas no estudo de três meses, e tanto os camundongos heterozigotos masculinos quanto as fêmeas geraram ninhadas menores.
Para ilustrar a importância de confirmar o início pubertal antes da criação de um ensaio de fertilidade, a competência reprodutiva foi avaliada em camundongos eliminatórios condicionais. Durante o estudo de fertilidade de 70 dias, nem machos ou fêmeas condicionales geraram lixo. Ao tentar esse procedimento, é importante lembrar de manusear os camundongos com cuidado e manter a calma enquanto se aproxima e manuseia os animais.
Após este procedimento, outros métodos como medir os níveis de hormônio sexual circulante podem ser realizados para responder a perguntas adicionais, como se a infertilidade ou outra subfertilidade foi causada por testosterona anormal, estrogênio, hormônio estimulante folículo e níveis hormonais luteínos. Não se esqueça que trabalhar com camundongos pode ser perigoso devido ao risco de morder e desenvolvimento de alergias. Para reduzir a exposição, precauções como o uso de luvas e um jaleco, e o manuseio cuidadoso dos ratos, devem ser sempre tomadas durante a realização deste procedimento.
