Este trabalho foi apoiado financeiramente pelo Conselho de pesquisa da Noruega, da Universidade de Oslo, o Anders Jahre Foundation, Fundação Nansen e o legado na memória do Henrik Homan. Agradecemos o Dr. Noboru Mizushima para o ATG5 + / + MEFs e ATG5-/-MEFs, Dr. Masaaki Komatsu para o ATG7 + / + MEFs e ATG7-/-MEFs e Dr. Shizuo Akira para o ATG9A + / + MEFs e ATG9A-/-MEFs. Agradecemos Frank Sætre para assistência técnica e Dr. Per O. Seglen discussões construtivas metodológicas.

1. célula semeadura e tratamento
<ol><li>
Células aderentes de cultura em frascos de cultura de tecidos de2 75 cm numa incubadora umidificado com 5% CO2 a 37 ° C, usando o meio de cultura preferido para o tipo de célula em questão. Permitir que as células a crescer até atingir uma camada de célula perto confluente. Nota: Use RPMI 1640 suplementado com 10% soro bovino fetal (FBS) para LNCaP, HEK293, rato embrionários fibroblastos (MEFs), BJ, MCF-7 e as células de RPE-1.<ol>
<li>Lave as células com 3ml 37 ° C fosfato salino (PBS), pH 7,4. Substitua a PBS 3 mL 0,25% (p/v) tripsina-etilenodiaminotetracético (EDTA) e incubar o frasco numa incubadora umidificado com 5% CO2 a 37 ° C, até que as células desanexar (2 – 5 min).</li>
		<li>Ressuspender as células isoladas com 7 mL de meio de cultura contendo 10% FBS. Misture uma alíquota de suspensão de células de 10 µ l com 10 µ l 0.4% Trypan azul em um tubo de microcentrifugadora, usando a ponta da pipeta 0,5 – 20 µ l. Use a ponta da pipeta mesmo para encher imediatamente um slide de câmara a contagem e contar as células em um contador automatizado de células.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparar um adequado (ver nota abaixo) diluição da suspensão de célula de etapa 1.1.2 usando cultura médio contendo 10% FBS, sementes e 1 mL da suspensão celular diluídos em cada poço de uma placa (área de superfície ~3.8 cm2) de cultura de tecidos de 12-poços de asséptico técnica. Permita o crescimento em uma incubadora umidificada com 5% CO2 a 37 ° C até a densidade da célula desejada tenha sido atingida, por exemplo, 60 – 90% confluência na colheita. Nota: A diluição adequada da suspensão celular que dará a confluência da célula desejada na colheita pode variar do tipo de célula para o tipo de célula, bem como de acordo com a duração e o tipo de tratamentos experimentais. Assim, isto deve ser avaliado empiricamente em cada caso.<ol>
<li>Para experiências que devem ser ambos trataram e colhidas 2 dias após a semeadura, semente 2,5 x 105 LNCaP, HEK293, ou MCF-7 células, 5 x 104 MEFs, 4 x 105 BJ ou 1,5 x 105 RPE-1 células em cada poço da placa 12-bem.</li>
		<li>Para as células que aderem frouxamente, revesti as placas com o tipo de revestimento recomendado para o tipo de célula em questão. Para células LNCaP (e HEK293) usar placas revestidas com poli-D-lisina (PDL).</li>
		<li>Para o efeito, adicionar 500 µ l PDL em 2,5 µ g/mL em estéril H2O para cada poço e incubar as placas em um ambiente estéril por 30 min à temperatura ambiente (20-25 ° C). Remover o PDL por sucção e lavar cada um bem brevemente com 1ml estéril H2O. Nota: Geralmente, passo 1.2.1 é feito sem quaisquer tratamentos experimentais. No entanto, se executar RNAi, pode ser conveniente iniciar uma transfecção inversa com a semeadura9.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Realize tratamentos experimentais em duplicado ou triplicados poços por condição.
	<ol>
<li>Por exemplo, tratar as células com 50 nM do inibidor de mTOR Torin1, que geralmente é um eficiente indutor de sequestro de autophagic, ou submeter as células a inanição aguda do soro - e ácido aminado lavando as células com 1 mL de aminoácidos livres Earle é equilibrado Sal médio de solução (EBSS) e posteriormente, incubar as células em 1 mL de EBSS numa incubadora umidificado com 5% CO2 a 37 ° C.</li>
		<li>Deixe um conjunto de poços não for tratada, a fim de definir níveis de sedimentáveis LDH.</li>
		<li>Adicionar uma quantidade saturante do pós-sequestro inibidor bafilomycin A1 (Baf)3,13,16,18 na ausência ou presença dos tratamentos experimentais, 3 – 4 h antes de célula colheita. Incubar as células em uma incubadora umidificada com 5% CO2 a 37 ° C.<ol>
<li>Uso 100 nM Baf para LNCaP, HEK293, BJ, MCF-7 e células RPE-1 e 10 nM Baf para MEFs.</li>
			<li>Para tratamentos experimentais que têm uma duração de apenas 3-4 h (como aqueles passo exemplificado em 1.3.1 normalmente tem), adicione o Baf simultaneamente com os tratamentos. Para mais tratamentos experimentais, esperar até 3-4 h antes da colheita e adicionar 2 µ l de uma 500 x concentrado Baf estoque diretamente para o meio.</li>
			<li>Misture agitando a placa imediatamente após a adição do Baf. Neste momento também é aconselhável adicionar macroautophagic inibidores de sequestro como controles, por exemplo, 10 mM da pan-phosphoinositide 3-quinase (PI3K) inibidor 3-metil adenina (3MA)19ou 10 µM de PI3K selectivo classe III inibidor de SAR-40520.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. celular colheita e preparação para Electrodisruption
<ol><li>No final do período de tratamento, Aspire o meio com sucção e adicionar 200 solução de desprendimento de célula µ l (pre-aquecido a 37 ° C) para cada poço. Incube a 37 ° C até que as células desanexar (tipicamente em torno de 5 min). Nota: Considerando que 0,25% (p/v) do Trypsin-EDTA pode ser usado em vez da solução de desprendimento de células, este último contém DNase, que ajuda a reduzir a viscosidade das células desanexadas. Enquanto o meio é completamente aspirado, não é necessário lavar as células antes da adição da solução de desprendimento do Trypsin-EDTA ou célula.</li>
	<li>Adicionar 500 µ l da temperatura ambiente (20-25 ° C) PBS pH 7,4, contendo 2% (p/v) albumina de soro bovino (BSA) em cada poço e ressuspender com a pipeta até sem tufos de célula são visíveis. Transferi imediatamente a suspensão de eritrócitos para tubos de 1,5 mL microcentrifuga no gelo. Nota: A menos que indicado o contrário, execute todas as etapas subsequentes no gelo.</li>
	<li>Sedimento das células por centrifugação a 400 x g por 5 min a 4 ° C.</li>
	<li>Aspire cuidadosamente o sobrenadante (por sucção) para deixar as pelotas de célula seca como possível.</li>
	<li>Adicione 400 µ l 10% (p/v) de sacarose (em ultrapura H2O) para cada tubo.</li>
</ol>3. membrana plasmática Electrodisruption e separação de frações Total e sedimentáveis --célula
<ol><li>Ressuspender as células com uma pipeta para obter uma suspensão de célula única perto e transferi-lo para uma cubeta de eletroporação de 4 mm. Nota: Pipetagem inconstante ~ 10 a 15 vezes, usando a ponta da pipeta 100 – 1.000 µ l, normalmente é suficiente.</li>
	<li>Colocar a cubeta em um electroporator de onda de decaimento exponencial e descarga de um único pulso elétrico em 800 V, 25 µF e 400 Ω; essas configurações produzem um pulso de duração ~ 8 ms.</li>
	<li>
Use uma ponta de pipeta nova para transferir o disruptate de célula para um tubo de microcentrifugadora de 1,5 mL contendo 400 µ l solução gelada sacarose tampão fosfato (monofosfato de sódio de 100 mM, 2mm ditiotreitol (DTT), EDTA 2 mM e 1,75% de sacarose, pH 7,5) e misture brevemente por pipetagem.
	<ol>
<li>Opcional: Para verificar se a membrana de plasma eficiente electrodisruption17, misture 10 µ l do disruptate célula diluídos da etapa 3.3 com 10 µ l 0.4% Trypan azul em um tubo de microcentrifugadora de 1,5 mL. Transferir para uma câmara de contagem e verifique se a porcentagem de células positivas azul Trypan é > 99%.<ol>
<li>Deixe a amostra na câmara de contagem por 30 min à temperatura ambiente (20-25 ° C) e verifique se que a porcentagem de células positivas Trypan azul manteve-se > 99%.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Opcional: Para verificar se o electrodisruption não tem sido muito dura, ou seja, não tem não interrompida organelas intracelulares, execute etapas 1.1 – 3.3 conforme descrito acima, mas use a maior matéria-prima (um poco de uma placa com uma camada de célula confluente de ~ 80% 6), e usar 150 µ l 10% de sacarose em solução de tampão fosfato sacarose µ l etapa 2.5 e 150 sem TDT na etapa 3.3.<ol>
<li>Usar uma pipeta para cuidadosamente camada 200 µ l da solução diluída de célula disruptate em cima de uma almofada de densidade de 1,2 mL de meio de gradiente de densidade de 8% (p/v) de tampão de fosfato (por exemplo, 8% Nycodenz, fosfato de sódio 50 mM, 2,2% de sacarose, 1 mM EDTA) em uma centrífuga de 2 mL tubo. Centrifugar a 20.000 x g durante 45 min a 4 ° C, numa microcentrifuga com função de modo suave (para suave aceleração e desaceleração) e com cuidado, coloque os tubos no gelo.</li>
			<li>Remova cuidadosamente a 60 µ l da fração superior ~ 200 µ l, certificando-se não pegar qualquer solução médio gradiente de densidade e transfira para um tubo de microcentrifugadora fresco. Nota: Isto deve conter citosol de pureza excepcional, denominada "célula sap"21.</li>
			<li>Teste a pureza da fração obtida na etapa acima, através da realização de análises de borrão ocidental de proteínas organela-contido, utilizando as técnicas convencionais e de géis gradiente de 4 – 20%16.</li>
			<li>Executar, por exemplo, immunoblotting para catepsina B21, citocromo c e isomerase de dissulfureto de proteína, para verificar que o choque elétrico em passo 3.2 não desestruturou lisossomos, mitocôndrias ou retículo endoplasmático, respectivamente e immunoblot para LDH para verificar a presença de uma proteína citosólica na seiva do celular.</li>
			<li>Em paralelo, execute immunoblotting em extratos de proteína feitos a partir de solução de disruptate a célula total16 para confirmar que os anticorpos usados podem detectar as proteínas contidas por organela que estão sendo avaliadas.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Repita as etapas de 3.1-3.3 para cada amostra.</li>
	<li>Retire 550 µ l da solução de disruptate cada célula diluído (obtida na etapa 3.3) para tubos de microcentrifuga de 2 mL contendo 900 µ l gelada ressuspensão buffer (monofosfato de sódio 50 mM, 1 mM DTT, 1 mM EDTA e 5,9% de sacarose, pH 7,5) suplementado com 0,5% de BSA e 0,01% Tween-20 e misture brevemente por pipetagem.</li>
	<li>Centrifugar a 18.000 x g por 45 min a 4 ° C para produzir pelotas contendo "LDH sedimentada". Aspire cuidadosamente o sobrenadante (por sucção) para deixar as bolinhas tão seco quanto possível. Coloca as amostras em um freezer-80 ° C.</li>
	<li>Transferência de 150 µ l de cada solução de disruptate de célula diluído (obtida na etapa 3.3) para tubos novos e colocar as amostras em um freezer-80 ° C. Use estas amostras para determinar os níveis de "total de LDH" nas células. Nota: Neste momento o experimento pode ser pausado para contanto que desejado.</li>
</ol>4. LDH extração e avaliação da actividade enzimática de LDH
<ol><li>Descongele o "LDH sedimentada" (da etapa 3.6) e "total de LDH" amostras (da etapa 3.7) no gelo.</li>
	<li>Adicione 300 µ l de tampão de ressuspensão gelada contendo 1,5% Triton X-405 para "LDH total" amostras (produzindo uma concentração final de Triton X-405 de 1%). Gire as amostras em um rolo em uma sala fria (4 – 8 ° C) por 30 min.</li>
	<li>Adicione 750 µ l de tampão de ressuspensão gelada com 1% Triton X-405 para "LDH sedimentada" amostras e ressuspender as pelotas com uma pipeta até que seja alcançada uma solução homogénea.</li>
	<li>Centrifugar as amostras da etapa 4.2 e 4.3 a 18.000 x g por 5 min a 4 ° C para restos celulares de sedimentos não dissolvido.</li>
	<li>Mix 4 peças do imidazol frio 65mm (piruvato de mM pH 7.5)/0.75 com uma parte do imidazole frio 65 mM (pH 7,5) / 1,8 mM NADH para obter uma solução de trabalho que é estável pelo menos três semanas a 4 ° C.</li>
	<li>Misture 3 – 30 µ l dos sobrenadantes da etapa 4.4 com 200 µ l da solução de trabalho passo 4.5.</li>
	<li>Determinar a quantidade de LDH, medindo a atividade enzimática de LDH como o declínio da nicotinamida adenina dinucleótido (forma reduzida) absorbância (NADH) 340 nm a 37 ° C, em comparação com um padrão com uma concentração conhecida de LDH. Executar medidas de absorvância até a reação se aproximou de conclusão, ou seja, até a absorbância em 340 nm já não muda com o tempo. Nota: Este é o clássico método bioquímico para medir a atividade da LDH. Embora o atual protocolo realiza a reação a 37 ° C, ele também pode ser realizado à temperatura ambiente (20-25 ° C), que é aconselhável se fazer espectrofotometria manual. O protocolo atual usa um instrumento multianalyzer robótico, que, em uma forma automatizada, mistura de amostras com solução de trabalho em uma placa de 96 poços e mede a absorbância em 340 nm a 37 ° C cada 20 s por 3 min. Depois disso, o software de instrumento calcula a concentração de LDH, expressado como unidades (U) / L, comparando-se a inclinação das medições absorvância ao longo do tempo, em comparação com uma curva padrão obtida através de calibração com um padrão de LDH conhecido concentração. O intervalo linear de detecção por esta abordagem é 30 – 1.500 U/L. Como alternativa, existe uma grande variedade de kits comercialmente disponíveis para medir a LDH. Alguns deles são baseados na reação enzimática para a geração de produtos colorimétricos ou fluorescentes, permitindo a deteção por outros meios de espectrofotometria UV e com outras escalas lineares de deteção de acoplamento.</li>
</ol>5. cálculo do sequestro de LDH
<ol><li>Calcule a percentagem de LDH sedimentada a LDH total para cada amostra, tomando as diluições e amostragem em conta: LDH sedimentada (%) =<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/57971/57971eq1.jpg"> Nota: Durante as etapas 3.1 – 3.3 aproximadamente 50 µ l é perdida devido à transferência para dentro e fora da cubeta de eletroporação. Assim, calcule de ter um total de 750 µ l (em vez de 800 µ l) de disruptate de célula diluídos na etapa 3.3.</li>
	<li>Subtrair a porcentagem de LDH sedimentada obtido nas amostras de células não tratadas (etapa 1.3.2) da porcentagem de LDH sedimentada, obtida em amostras de células tratadas experimentalmente e dividir pelo tempo de tratamento com Baf para obter a percentagem de LDH sequestrado por hora durante o período de amostragem: Isolado de LDH (% / h) =<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/57971/57971eq2.jpg">
</li>
</ol>

Os autores não têm nenhum conflito de interesses.

Em resumo, o protocolo descrito aqui representa um método confiável e amplamente aplicável para monitorar a atividade de autophagic de sequestro em massa em células de mamíferos. Em comparação com o original método de12,16, ter removido um número de etapas desnecessárias, simplificamos várias das etapas restantes e introduziu uma substancial redução de escala. Como resultado, o protocolo é muito melhorado em relação ao custo e tempo-eficiência, e a mesma quantidade de amostras pode agora ser tratada em menos de metade do tempo em comparação com o protocolo original. Para 24 amostras, passos 2-3 (dia 1) requer aproximadamente ½ h de preparação mais 3h de trabalho eficiente, Considerando que o passo 4 (dia 2) pode ser executado em ~ 2 h (tempo estima dado que todos os buffers necessários são preparados previamente). Desde o ensaio no dia 1 geralmente é precedido por tratamentos de célula, incluindo uma incubação de 3-4 h com Baf ou outros inibidores da degradação de LDH autolysosomal, é conveniente dividir o ensaio em dois dias consecutivos. No entanto, também é possível realizar o ensaio todo no mesmo dia. Nesse caso, pouparia tempo para snap-congelar as amostras em nitrogênio líquido na etapa 3.6 e 3.7. Embora não testado com o protocolo atual, é provável que a etapa de congelamento-descongelamento pode ser ignorada por completo, desde os mais elaborado versão do ensaio em hepatócitos primários de rato foi feito sem esta etapa23.
O protocolo apresentado aqui pode ser realizado com relativa facilidade. Digno de nota, é importante ser precisos na pipetagem, desde que o ensaio inclui várias etapas de amostragem e diluição. Além disso, as aspirações de sobrenadante devem ser feitas cuidadosamente, para que quantidades mínimas de íons estão presentes na suspensão de célula de sacarose na etapa 2.5 e assim como pouco LDH citosólica possível contamina o material sedimentado na etapa 3.6. O ensaio conforme descrito aqui é flexível para uma ampla gama de material começar. Por exemplo, nas células LNCaP, nós usaram com sucesso o ensaio com uma gama de diferentes quantidades de células no momento da colheita, abrangendo até uma diferença de 10 vezes (de 2,5 x 105 células de 2.5 x 106 células). O mínimo de material necessário começar é definido por quão sensível a detecção é método de atividade enzimática de LDH. O protocolo muito provavelmente pode ser dimensionado substancialmente mais abaixo, pela redução dos volumes utilizados em etapas 2.5, 3.3, 3.5, 3.7, 4.2 e 4.3.
O fator mais crítico e desafio técnico com o ensaio é o passo de electrodisruption. O choque elétrico forte, mas breve, de células em solução isotônica, íon livre resulta em uma perturbação uniforme e seletiva da membrana plasmática, deixando a estrutura intracelular e organelas (incluindo vacúolos autophagic) intacta12, 29. Ao usar células aderentes, é essencial que eles toleram os tratamentos enzimáticos e mecânicos em passos 2.1 – 3.1 (desprendimento de células, centrifugação e ressuspensão). Etapa 3.1, não é fundamental para obter uma suspensão de célula única perfeitamente. Por exemplo, é muito difícil de alcançar com células LNCaP. No entanto, electrodisruption sucesso em quase 100% das células sempre é obtida, mesmo dentro de grupos de células contendo várias dezenas de células fisicamente anexadas. Ao testar um novo tipo de célula, é aconselhável verificar a eficiência da electrodisruption (consulte a etapa 3.3.1)17. Perto de 100% das células deve ser permanentemente azul Trypan positivo após o electrodisruption passo17. Se isso não for o caso, as configurações de electroporator mais provável devem ser alteradas. Usando o ensaio em 20 tipos de células de mamíferos diferentes, nunca tivemos de alterar as configurações de electroporator. Assim, uma vez que as configurações foram encontradas para uma linhagem de células de mamíferos, é provavelmente a trabalhar para todos os outros tipos de células de mamíferos. Para verificar que as condições de electrodisruption não são muito duras, ou seja,que apenas a membrana plasmática e não as membranas das organelas intracelulares foram interrompidas, siga o passo 3.3.2.
Autofagia em massa é executada pelo autophagosomes que sequestrar co quantidades substanciais de citosol juntamente com outras cargas. Isto pode acontecer através de autofagia puramente não-seletivo de porções do citoplasma, ou de uma maneira que representa uma mistura de autofagia seletiva e não-seletivo. Até à data, não está claro se ou em que grau seletiva e não-seletivo de autofagia coexistir como dois modos diferentes de autofagia, ou se autophagosomes como regra simultaneamente sequestro carga de maneira seletiva e não-seletivo. Importante, no entanto, um estudo recente relatou que ativadores de autofagia seletiva induzem um aumento semelhante no sequestro de carga citosólico em massa como o sequestro da carga específica de30. Os resultados de nosso próprio laboratório estão de acordo com isso (nossos resultados não publicados). Analisando o sequestro de proteínas citosólico solúveis (por exemplo, LDH), portanto, provavelmente tem o potencial para detectar alterações na atividade de sequestro macroautophagic sob muitos, se não todas as condições. No entanto, embora ainda permanece para ser provado, não se pode excluir a possibilidade de que certos tipos de condições excepcionalmente induzem um tipo de autofagia selectiva exclusiva, onde a carga é tão fortemente envolvida pelo phagophore esse citosol até excluído ser sequestrado para o autophagosome. Para investigar se tal condição pode existir, ensaios de autofagia em massa como o ensaio de sequestro de LDH devem ser executados em paralelo com ensaios de autofagia seletiva.
Uma das principais vantagens do ensaio do sequestro de LDH é que mede o sequestro de carga endógena, tornando-se um método amplamente aplicável. Além disso, o ensaio mede a atividade do sequestro de forma altamente quantitativa. O ensaio de sequestro de LDH é uma ferramenta importante para estudar os mecanismos e regulação da formação de autophagosome, desde abrir phagophores não pode sequestrar LDH. É muito complicado e difícil, se não impossível avaliar se autophagosome-como estruturas são entidades fechadas ou não por microscopia electrónica. Outro método que está sendo usado para analisar se autophagosomes estão fechadas é testar a sensibilidade dos marcadores de autofagia (por exemplo, LC3) ou receptores (por exemplo, sequestosome 1 (p62/SQSTM1) ou proteína nuclear ponto 52 (NDP52)) de proteases10 ,31,32. A desvantagem deste teste é que um está estudando a proteção de protease de componentes do carrinho ao invés de carga autophagic. Além disso, desde o ensaio baseia-se na mancha ocidental, é só semi-quantitativa.
Considerando que a capacidade de analisar a autofagia de carga endógena é uma vantagem, uma limitação inerente com o ensaio de sequestro de LDH e qualquer outros ensaios que avaliam o sequestro de carga endógena, é que um inibidor de degradação deve ser incluído para discernir os efeitos específicos no sequestro de autophagic, em vez de efeitos líquidos de sequestro e degradação. Eficientes inibidores da degradação de LDH incluem inibidores da bomba de prótons como agentes Baf ou concanamycin um de16,3,18e lysosomotropic como cloroquina e cloreto de amônio33. O leupeptin de inibidor de protease funciona bem em hepatócitos de rato primária23, mas é geralmente ineficiente em linhas de células de mamíferos, que nós testamos. Rotineiramente usamos Baf13, que age rapidamente e é altamente eficiente nas células benigno e malignas. No entanto, é importante ter em mente que nenhum dos inibidores de degradação da LDH é inteiramente específico, e efeitos putativos dos inibidores na autofagia não podem ser excluídos. Para minimizar o risco de influência não-específica, é recomendável usar concentrações do inibidor que estão apenas em níveis de saturação e incluir o inibidor só para as últimas horas (3-4 h) do experimento. A concentração de impregnação de Baf deve ser determinada para cada tipo de célula. Como um guia, 50 – 100 nM é saturar para a maioria das linhas de células de mamíferos cultivadas que testamos, Considerando que algumas células tipos tais como MEFs requerem apenas 10 nM Baf para um bloco completo na degradação de LDH.
Uma limitação óbvia com o ensaio de sequestro de LDH é que ele só pode ser realizado em células vivas, excluindo assim a sua utilização para análise de autofagia no fixo de células e tecidos. Por outro lado, existem atualmente não há ensaios estabeleceram que pode medir a atividade de autophagic funcional nas células fixas. Embora não testada com o protocolo atual, é possível usar o ensaio de sequestro de LDH para avaliar na vivo atividade autophagic sequestro em organismos experimentais. A limitação seria que o organismo deve tolerar o tratamento com um inibidor da degradação lisossomal de LDH, e que o período de tempo entre esses tratamento e o desempenho do ensaio deve ser relativamente curto, para minimizar potenciais efeitos não-específicos de o inibidor. Curiosamente, um estudo inicial por Kominami et al., indicou que o tratamento de 3 – 6 h de ratos com leupeptin (injeção intraperitoneal de 2 mg/100 g de peso corporal) é adequado para observar a acumulação eficiente de LDH autophagically sequestrado no fígado fracções subcelulares enriquecidas por vacúolos autophagic34.
Expressão ectópica do sequestro fluorescente sensíveis ao pH de sondas como Rosella35 ou Keima36 pode ser usado para visualizar o sequestro de autophagic sem a necessidade de incluir inibidores da degradação. Além disso, ao contrário o ensaio de sequestro de LDH, tais abordagens podem ser usadas para visualizar autophagic sequestro em células únicas. Além disso, a fusão da sonda para sequências organela-direcionamento pode ser utilizado para monitorar o sequestro de organelas específicas. Plataformas microscópicas poderosas podem também permitir análises de rastreio com throughput alto. As desvantagens são que a expressão ectópica sonda, bem como a acumulação da sonda no sistema de depósito lisossômico, pode influenciar o caminho autophagic. Além disso, ao contrário o ensaio de sequestro de LDH, uma é dependente de células que podem ser eficientemente transfectadas. Finalmente, Considerando que o ensaio de sequestro de LDH fornece uma saída direta quantitativa do citosol percentual isolado, os métodos baseados em imagem geralmente não podem fornecer este tipo de saída quantitativo absoluto. Seria aconselhável fazer uso de ambos os tipos de abordagens de modo complementar. Outro método excelente para estudar autophagic sequestro sem a necessidade dos inibidores da degradação é introduzir radiolabeled rafinose em células por electro-permeabilização reversível3,23,37, 38. Rafinose é um açúcar de membrana-impermeant e metabolicamente inerte que é resistente às enzimas lisossomais. Portanto, sua autophagic sequestro pode ser seguido por separação de citosólica sedimentáveis célula frações3,23,37,38. Esta abordagem é, no entanto, mais demorado do que o ensaio de sequestro de LDH e exige precauções de segurança adicionais devido ao uso de radioatividade. Finalmente, o resultado final do sequestro de autophagic em massa e fluxo de carga autophagic desobstruída, a degradação das proteínas de vida longa, pode ser medido com precisão por uma proteína bem-estabelecida método baseado na rotulagem39,40 ,41,42,43. No entanto, ao contrário o ensaio de sequestro de LDH, esse método não fornece uma leitura específica para a atividade autophagic, desde long-lived proteínas são degradadas também por outros mecanismos que autofagia, mais notavelmente pelo sistema proteasomal (Considerando que LDH sequestro só ocorre como resultado da autofagia). Portanto, um número de controle tratamentos precisam ser rotineiramente incluídos, por exemplo, químicos inibidores de autophagic-lisossomal ou degradação proteasomal e interferência genética com autofagia3,16.
O ensaio de sequestro de LDH pode ser comparado com os ensaios de fluxo LC3 comumente usados, que medem os níveis LC3-II pela mancha ocidental ou formação de partitura LC3 por imagens de fluorescência na ausência ou presença de inibidores de depósito lisossômico LC3 degradação (Baf é mais frequentemente usado), ou a transição de fluorescente etiquetado LC3 variantes para ambientes ácidos22. Embora estes ensaios LC3-based podem fornecer informações úteis, eles podem ser difíceis de interpretar, em particular porque a relação entre o grau de fluxo LC3 e a quantidade e o tipo de fluxo de carga é desconhecida. Como mencionado na introdução, autofagia em massa e mitophagy Pereira Barbosa-dependente não requer LC3 família proteínas9,10,11,44. Além disso, em hepatócitos de rato esfomeado, sequestro de LDH e degradação prossegue ininterrupto durante períodos de tempo onde há não autophagic-lisossomal LC3 flux9. Assim, neste caso, fluxo de carga pode ser completamente separado do fluxo LC3. É necessária mais investigação comparando LC3 flux com diferentes tipos de fluxo de carga para melhor interpretar os resultados obtidos com ensaios de fluxo LC3.
Na sua forma actual, o ensaio de sequestro de LDH é comparável a mancha ocidental em termos de tempo exigido hands-on e custos. Em termos de medição autofagia em massa, é pelo menos tão eficiente quanto o ensaio baseado em rafinose sequestro ou o ensaio de degradação de proteína longa vida descrito acima. Para medição específica da atividade de autophagic de sequestro em massa e formação de autophagosomes fechado, é muito mais eficiente e direta do que LC3 flux ensaios ou ensaios da proteção protease de receptores LC3 ou autofagia, desde os últimos ensaios medir os componentes do carrinho ao invés de carga real. Mesmo que nós melhoraram substancialmente a taxa de transferência do ensaio do sequestro de LDH, está longe de ser um ensaio de alta produtividade, e não pode competir com a eficiência dos ensaios baseados em imagem descrita acima. No entanto, ambos os ensaios baseados em imagem e o ensaio de sequestro de LDH têm suas vantagens e desvantagens, e assim os dois tipos de ensaios têm seus próprios valores. É provável possível através de ajustes futuros para fazer o sequestro LDH ensaio semi elevado-throughput. Por exemplo, deve ser possível realizar o electrodisruption em um formato de 96 poços, e é concebível que LDH citosólica podendo ser separado do LDH sequestrado por filtração em vez de centrifugação, ou que a etapa de centrifugação pode ser executada em um 96- bem o formato. Além disso, os ensaios para medir a atividade da LDH que são muito mais sensíveis do que o utilizado no protocolo atual foram desenvolvidos e estão disponíveis comercialmente. Outros potenciais futuros interessantes do ensaio são seu uso putativo em outros tipos de células de células de mamíferos, por exemplo em leveduras ou outros organismos unicelulares, ou até mesmo planta células, bem como seu uso para medições em vivo de autophagic atividades de sequestro em tecidos de organismos experimentais.
Em conclusão, acreditamos que o ensaio de sequestro de LDH na sua forma melhorada e reviveu será uma ferramenta importante em futuras pesquisas relacionadas a autofagia.

Autofagia (do grego para "Self comendo") é um processo evolutivo e conservado pela degradação vacuolar/lysosomal do material intracelular. Após a descoberta de genes relacionados com autofagia ("ATG"), que são importantes para a autofagia no fermento e seres humanos, e a realização que autofagia desempenha um papel significativo na saúde e na doença (reconhecido por 2016 Prêmio Nobel de medicina ou fisiologia de Yoshinori Ohsumi), autofagia rapidamente se tornou um dos processos mais intensamente estudados na célula biologia1,2.
Macroautophagy (doravante referida como "autofagia") é caracterizada pela expansão e dobramento de pequenos membrana intracelular ("phagophores") em estruturas seladas, double ou multi membrane ("autophagosomes") que efetivamente sequestram o enwrapped material do resto do citoplasma. Mediante a fusão de autophagosomes com lisossomos, membrana interna autophagosomal e a carga sequestrada é degradado e reciclados. Autophagosomes pode requisitar material citoplasmático em aleatória (não-seletivo autofagia) e modos seletiva (autofagia seletiva). Granel autofagia provavelmente representa uma mistura de autofagia não-seletivos e seletiva.
Nos anos 60 e 70 ("a morfológica era" da pesquisa de autofagia), sequestro de autophagic principalmente foi avaliado através de análises ultraestrutural. Na década de 1980 e início dos anos 90 ("a era bioquímico") por Seglen e colegas de trabalho — quem estudou autofagia em hepatócitos primários de rato — desenvolveu os primeiro métodos para medir quantitativamente o sequestro autophagic atividade3. Usando estes ensaios, Seglen definidos e caracterizados diferentes etapas da via lisossomal-autophagic4,5, descoberto e cunhou o amphisome6 (o produto da fusão endossomo-autophagosome) e foi o primeiro a Descreva o papel da fosforilação de proteínas em autofagia Regulamento7. No entanto, após a descoberta dos ATGs de 1990 ("a era molecular") e a primeira caracterização de uma proteína ATG8 mamíferos, proteína microtubule-associada 1A/1B-luz corrente 3 (LC3) em 20008, a utilização de proteínas ATG como marcadores para o autophagic processo rapidamente ganhou popularidade, e os mais velhos e mais trabalhosos métodos bioquímicos foram deixados para trás. Na verdade, durante os últimos 18 anos, borrão ocidental e análises de microscopia de fluorescência de LC3 tornaram-se de longe mais populares (e em muitos casos, o único) meio de estudar autofagia em células de mamíferos. A vantagem é a relativa facilidade pelo qual estes métodos podem ser realizados. A desvantagem é que um está estudando um componente de carrinho (LC3) ao invés de carga autophagic real. Esta é uma desvantagem bastante séria, porque a relação entre os Estados-Membros e/ou fluxo de LC3 através da via contra o sequestro e o fluxo de carga é altamente incerto. Na verdade, mostramos que o fluxo de carga em massa pode ser mantido em níveis elevados em condições onde não há nenhum fluxo LC3, apesar da presença de conjugados LC3 na9células. Além disso, temos demonstrado que autofagia em massa não é afetada pela depleção de LC3 eficiente e assim provavelmente é LC3-independente9. Este achado mais tarde foi confirmado por LC3 nocaute estudos10,11, que também indicam que mitophagy Parkin-dependente (a seletiva autofagia mitocondrial) é independente dos LC310,11 .
Em resumo, há uma clara necessidade ensaios baseados em carga monitorar a atividade do autophagic. Otimamente desses ensaios devem ser amplamente aplicável, bem definido e fácil de executar. Ao longo dos últimos anos, demos um interesse particular no ensaio de sequestro de LDH, que foi desenvolvido por Per Seglen na década de 198012e baseia-se na medição da transferência de LDH citosólico para sedimentáveis, célula vacúolo contendo autophagic frações. LDH é uma proteína citosólica estável, solúvel que prontamente co é sequestrada quando phagophores Wrap carga citoplasmática. Sequestro de LDH é, portanto, uma medida geral de sequestro autophagic. LDH é exclusivamente degradado pela via lisossomal-autophagic12. Assim, na presença de inibidores da degradação dos lisossomos, por exemplo, bafilomycin A1 (Baf)13, efeitos do tratamento experimental diretamente refletir alterações na atividade de sequestro autophagic. Na ausência de inibidores da degradação, o efeito líquido de alterações no sequestro de LDH e degradação pode ser medido.
O ensaio de sequestro de LDH é amplamente aplicável, desde que a LDH é altamente e ubiquitously expressa em todos os tipos de células, e os níveis LDH podem ser quantificados com precisão por um ensaio enzimático de14,15. No entanto, o original do protocolo12 — estabelecido em hepatócitos primários de rato — foi bastante demorado e exigiu uma alta quantidade de começar o material, bem como um capacitor feito por descarga elétrica. De uma forma faseada, nós transformaram gradualmente o ensaio em um método fácil e versátil. Em primeiro lugar, o protocolo original foi adaptado para uso em linhas de células de mamíferos16. Em segundo lugar, o método foi substancialmente downscaled3,9. Terceiro, várias etapas no protocolo foram eliminadas, incluindo uma almofada de densidade laborioso passo17. Isto permitiu simultaneamente uma regionalização ainda mais do método, do ponto de partida original do uso de uma placa de 10cm por exemplo16 usando um único poço de uma placa de 12 por amostra (ou seja, aproximadamente 15-fold menos começando material)17. Em quarto lugar, nós identificamos uma aparelho de eletroporação comercial que poderia substituir o capacitor de descarga elétrica sob medida17.
Aqui nosso protocolo mais atualizado do ensaio do sequestro de LDH, que inclui algumas simplificações adicionais do método em comparação com o anteriormente publicado17 é apresentado. Além disso, é mostrado um conjunto de resultados típicos obtidos em um número de diferentes tipos de células, e importante, várias linhas de validações experimentais do método usando o knockdown farmacológica, bem como genética e nocaute abordagens são fornecidas. Um regime global de fluxo do protocolo inteiro, veja a Figura 1.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1569px;" width="1567">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">1.5 ml and 2 ml microcentrifuge tubes&#160;</td>
			<td style="width:221px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:159px;">211-2130 and 211-2120</td>
			<td style="width:703px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">12-well plates&#160;</td>
			<td style="width:221px;">Falcon</td>
			<td style="width:159px;">353043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Accumax&#160; cell detachment solution</td>
			<td style="width:221px;">Innovative Cell Technologies</td>
			<td style="width:159px;">A7089</td>
			<td>Keep aliquots at -20 &#176;C for years, and in fridge for a few months</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Bafilomycin A1</td>
			<td style="width:221px;">Enzo</td>
			<td style="width:159px;">BML-CM110-0100</td>
			<td>Dissolve in DMSO</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">BJ cells</td>
			<td style="width:221px;">ATCC</td>
			<td style="width:159px;">CRL-2522</td>
			<td>use at passage &#60;30</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td style="width:221px;">VWR</td>
			<td style="width:159px;">422361V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Burker counting chamber</td>
			<td style="width:221px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:159px;">139-658585</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Countess Cell Counting Chamber Slides</td>
			<td style="width:221px;">ThermoFisher Scientfic</td>
			<td style="width:159px;">C10228</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Countess II Automated Cell Counter</td>
			<td style="width:221px;">ThermoFisher Scientfic</td>
			<td style="width:159px;">AMQAX1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Cover glass for the Burker counting chamber</td>
			<td style="width:221px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:159px;">139-658586</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Criterion Tris-HCl Gel, 4&#8211;20%, 26-well, 15 &#181;l, 13.3 x 8.7 cm (W x L)&#160;</td>
			<td style="width:221px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:159px;">3450034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">DTT</td>
			<td style="width:221px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:159px;">D0632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Earle&#39;s balanced salt solution (EBSS)</td>
			<td style="width:221px;">Gibco</td>
			<td style="width:159px;">24010-043</td>
			<td>conatains 0.1% glucose</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">EDTA</td>
			<td style="width:221px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:159px;">E7889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Electroporation cuvette (4 mm)</td>
			<td style="width:221px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:159px;">1652088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Exponential decay wave electroporator</td>
			<td style="width:221px;">BTX Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:159px;">&#160;EMC 630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td style="width:221px;">Sigma</td>
			<td style="width:159px;">F7524</td>
			<td style="width:703px;">10% final concentration in RPMI 1640 medium</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">HEK293 cells</td>
			<td style="width:221px;">ATCC</td>
			<td style="width:159px;">CRL-1573</td>
			<td style="width:703px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Imidazole</td>
			<td style="width:221px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:159px;">56750</td>
			<td>Autoclave a 65 mM solution and keep in fridge for months</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Incubator; Autoflow IR Direct Heat CO2 incubator</td>
			<td style="width:221px;">NuAire</td>
			<td style="width:159px;">NU-5510E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent</td>
			<td style="width:221px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:159px;">13778150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">LNCaP cells</td>
			<td style="width:221px;">ATCC</td>
			<td style="width:159px;">CRL-1740</td>
			<td>use at passage &#60;30</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">3-Methyl Adenine (3MA)</td>
			<td style="width:221px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:159px;">M9281</td>
			<td>Stock 100 mM in RPMI in -20 &#176;C.&#160; Heat stock to 65 &#176;C for 10 minutes, and use at 10 mM final concentration</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Refridgerated Microcentrifuge</td>
			<td style="width:221px;">Beckman Coulter Life Sciences</td>
			<td style="width:159px;">368831</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Refridgerated Microcentrifuge with soft-mode function</td>
			<td style="width:221px;">Eppendorf&#160;</td>
			<td>Eppendorf 5417R&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">MRT67307 hydrochloride (ULKi)</td>
			<td style="width:221px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:159px;">SML0702</td>
			<td>Inhibits ULK kinase activity. Dissolve in DMSO.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">MaxMat Multianalyzer instrument</td>
			<td style="width:221px;">Erba Diagnostics</td>
			<td style="width:159px;">PL-II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">MCF7 cells</td>
			<td style="width:221px;">ATCC</td>
			<td style="width:159px;">HTB-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">NADH</td>
			<td style="width:221px;">Merck-Millipore</td>
			<td style="width:159px;">1.24644.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Nycodenz</td>
			<td style="width:221px;">Axis-Shield</td>
			<td style="width:159px;">1002424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Opti-MEM Reduced Serum Medium</td>
			<td style="width:221px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:159px;">31985062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td style="width:221px;">Gibco</td>
			<td style="width:159px;">20012-019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Pipette tips 3 (0.5-20 &#181;l)</td>
			<td style="width:221px;">VWR</td>
			<td style="width:159px;">732-2223</td>
			<td>Thermo Fischer ART Barrier tips</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Pipette tips (1-200 &#181;l)</td>
			<td style="width:221px;">VWR</td>
			<td style="width:159px;">732-2207&#160;</td>
			<td>Thermo Fischer ART Barrier tips</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Pipette tips (100-1000&#181;l)</td>
			<td style="width:221px;">VWR</td>
			<td style="width:159px;">732-2355&#160;</td>
			<td>Thermo Fischer ART Barrier tips</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Pipettes</td>
			<td style="width:221px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:159px;">4701070</td>
			<td>Finnpipette F2 GLP Kit</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Poly-D-lysine</td>
			<td style="width:221px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:159px;">P6407-10X5MG</td>
			<td>Make a 1 mg/ml stock solution in sterile H2O. This solution is stable at -20 &#176;C for at least 1 year.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Pyruvate</td>
			<td>Merck-Millipore</td>
			<td>1066190050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">RPE-1 cells (hTERT RPE-1)</td>
			<td style="width:221px;">ATCC</td>
			<td style="width:159px;">CRL-4000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">RPMI 1640</td>
			<td style="width:221px;">Gibco</td>
			<td style="width:159px;">21875-037</td>
			<td style="width:703px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">SAR-405</td>
			<td style="width:221px;">ApexBio&#160;</td>
			<td style="width:159px;">A8883</td>
			<td style="width:703px;">Inhibits phosphoinositide 3-kinase class III (PIK3C3). Dissolve in DMSO.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Silencer Select Negative Control #1 (siCtrl)</td>
			<td style="width:221px;">ThermoFisher/Ambion</td>
			<td style="width:159px;">4390843</td>
			<td style="width:703px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Silencer Select ATG9-targeting siRNA (siATG9A)</td>
			<td style="width:221px;">ThermoFisher/Ambion</td>
			<td style="width:159px;">s35504</td>
			<td style="width:703px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Silencer Select FIP200-targeting siRNA (siFIP200)</td>
			<td style="width:221px;">ThermoFisher/Ambion</td>
			<td style="width:159px;">s18995</td>
			<td style="width:703px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Silencer Select ULK1-targeting siRNA (siULK1)</td>
			<td style="width:221px;">ThermoFisher/Ambion</td>
			<td style="width:159px;">s15964</td>
			<td style="width:703px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Silencer Select ULK2-targeting siRNA (siULK2)</td>
			<td style="width:221px;">ThermoFisher/Ambion</td>
			<td style="width:159px;">s18705</td>
			<td style="width:703px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Silencer Select GABARAP-targeting siRNA (siGABARAP)</td>
			<td style="width:221px;">ThermoFisher/Ambion</td>
			<td style="width:159px;">s22362</td>
			<td style="width:703px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Silencer Select GABARAPL1-targeting siRNA (siGABARAPL1)</td>
			<td style="width:221px;">ThermoFisher/Ambion</td>
			<td style="width:159px;">s24333</td>
			<td style="width:703px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Silencer Select GABARAPL2-targeting siRNA (siGABARAPL2)</td>
			<td style="width:221px;">ThermoFisher/Ambion</td>
			<td style="width:159px;">s22387</td>
			<td style="width:703px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Sodium phosphate monobasic dihydrate (NaH2PO4 &#8226; 2H2O)&#160;</td>
			<td style="width:221px;">Merck-Millipore</td>
			<td style="width:159px;">1.06580.1000</td>
			<td style="width:703px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Sodium phosphate dibasic dihydrate (Na2HPO4 &#8226; 2H2O )&#160;</td>
			<td style="width:221px;">Prolabo</td>
			<td style="width:159px;">28014.291</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Sucrose</td>
			<td style="width:221px;">VWR</td>
			<td style="width:159px;">443816T</td>
			<td>10% final concentration in water; filter through 0.45 &#181;m filter and keep in fridge for months</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Thapsigargin</td>
			<td style="width:221px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:159px;">T9033</td>
			<td>Inhibits the SERCA ER Ca2+ pump. Dissolve in DMSO.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Triton X-405&#160;</td>
			<td style="width:221px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:159px;">X405</td>
			<td style="width:703px;">1% final</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Trypan Blue stain 0.4%</td>
			<td style="width:221px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:159px;">T10282</td>
			<td style="width:703px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Trypsin-EDTA (0.25% w/v Trypsin)</td>
			<td style="width:221px;">Gibco</td>
			<td style="width:159px;">25200-056</td>
			<td style="width:703px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Tween-20</td>
			<td style="width:221px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:159px;">P2287</td>
			<td>0.01% final</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the lactate dehydrogenase sequestration assay &#8212; a simple and reliable method to determine bulk autophagic sequestration activity in mammalian cells

Autofagia em massa caracteriza-se por sequestro de grandes porções do citoplasma nas estruturas de duplo/multi-membrane denominado autophagosomes. Aqui um protocolo simples para monitorar este processo é descrito. Além disso, o típicos resultados e validação experimental do método sob condições indutoras autofagia em vários tipos de células de mamíferos cultivadas são fornecidos. Durante autofagia em massa, autophagosomes sequestrar citosol e desse modo também proteínas citosólica solúveis, juntamente com outras cargas autophagic. LDH é estável e altamente solúvel, abundante enzima citosólica que não seletivamente é sequestrada em autophagosomes. A quantidade de sequestro de LDH, portanto, reflete a quantidade de sequestro de autophagic em massa. Para eficiência e precisão determinar o sequestro de LDH em células, nós empregamos um protocolo baseado em electrodisruption de fracionamento que efetivamente separa sedimentáveis LDH citosólica, seguido de medida da atividade enzimática em sedimentáveis fracções contra amostras de células inteiras. Sequestro de autophagic é determinado subtraindo-se a proporção de sedimentáveis LDH em células não tratadas do que em células tratadas. A vantagem do ensaio do sequestro de LDH é que dá uma medida quantitativa da autophagic embargo da carga endógena, ao contrário de outros métodos que também envolvem expressão ectópica de sondas de sequestro ou semi-quantitativa de protease análises de proteção de marcadores de autofagia ou receptores.

Usando o protocolo descrito aqui, a atividade de autophagic de sequestro em massa em um número de linhas de células de mamíferos diferentes, incluindo LAPC4, DU145, Huh7, PNT2A, HeLa, capnografia, H3122, Hec1A, MCF-7 T47D, U2OS, PC3, G361, mouse embrionários fibroblastos (MEFs), RPE-1, Células HEK293, BJ e LNCaP foi medido. Sequestro foi avaliado em condições basais (em médio completo, rico em nutrientes), ou em células agudamente faminta de soro e aminoácidos (uma bona fide indutora de autofagia condição22). Os resultados indicaram que a atividade de sequestro LDH em condições de inanição varia extensamente através das linhas de célula diferente, variando de níveis mal detectáveis em LAPC4, DU145, Huh7 e PNT2 células (dados não mostrados) para ~1.6%/h em células LNCaP (Figura 2 A). A taxa observada em hepatócitos de rato faminto de primário é maior do que na linha celular mencionada acima e normalmente varia de 2.5–4%/h23. Em condições basais, sequestro de LDH foi virtualmente indetectável na metade das linhas celulares testados e variou de ~0.2%/h a ~0.5%/h a outra metade (dados não mostrados). Em linhas celulares que mostram atividade detectável sequestro autophagic basal, inanição aguda do soro e aminoácido tipicamente induz um aumento de 3 – 4 vezes na taxa de sequestro de LDH (ver, por exemplo, o experimento de LNCaP mostrado na Figura 2). Em linhas celulares testados (mencionadas acima), o percentual de fundo de LDH sedimentada Obtido em amostras de células não tratadas (etapa 1.3.2) é normalmente em torno de 2-3%. De 22 experimentos independentes, realizados em várias linhas celulares, o intra experimental coeficiente de variação (CV) entre os valores LDH sedimentadas (% LDH sedimentada) de repetições de tratamento foi de 5,8% ± 1,7% (média % CV ± desvio-padrão), variando de 3.0 – 9,0%. Juntos, esses números dão uma indicação do que esperar ao realizar o ensaio de sequestro de LDH em células de mamíferos.
Uso de inibidores químicos como bem como genéticas knockdown e nocaute aproxima-se, extensivamente, verifica que o ensaio de sequestro de LDH confiantemente mede a atividade de sequestro autophagic. Autophagosome formação requer PI3K ativa classe III (PIK3C3) e Unc-51 como autofagia activação da quinase (ULK)24, bem como do equilíbrio intracelular Ca2 + homeostase.16. Como mostrado na Figura 2A, LDH basal e induzida por inanição sequestro é completamente abolido pelo pan-PI3K inibidor 3MA, a seletiva de SAR-405 inibidor PIK3C320, ou o ER Ca2 + bomba inibidor thapsigargin (TG) 25 em células LNCaP. Sequestro de LDH em condições de inanição (interruptor para meio de solução sal equilibrado (EBSS) do aminoácido livre Earle) é também fortemente reduzido de TG, ou da MRT67307 ULK-inibidor nas células HEK293 (Figura 2B). Além disso, o sequestro de LDH induzida por inanição consistentemente é inibido pela 3MA em MEFs (Figura 2C), BJ (Figura 2D), MCF-7(Figura 2)e RPE-1 (Figura 2-F) células. Geralmente, incubação de células em meio EBSS sozinho (ou seja, na ausência de Baf ou outros inibidores da pós-sequestro) não implica que qualquer acumulação mensurável de LDH sequestrado (ver, por exemplo, o experimento de LNCaP mostrado na Figura 2 A). isto é provável porque fome aguda aminoácido leva ao fluxo autophagic-lisossomal acelerado, resultando em rápida e contínua degradação da LDH sequestrado.
Em seguida, vários genes ATG MEFs nocaute (KO) foram empregadas para testar se o sequestro de LDH requer genes relacionados autofagia relatados para ser essencial para a formação de autophagosome. Com efeito, sequestro de LDH induzida por inanição é abolido em ATG5 KO MEFs26 (Figura 3A), confirmando nossa anteriores conclusões9. Além disso, como mostrado na Figura 3B e 3 C, sequestro de LDH induzida por inanição é arredondado também em ATG7 KO MEFs27 e ATG9A KO MEFs28.
Finalmente, o ensaio de sequestro de LDH foi testado em relação a se mediada por RNAi silenciamento de transcrições de gene chaves ATG iria inibir a atividade de sequestro induzida por inanição. Com efeito, transfecção com um ATG9A-direcionamento siRNA, ou segmentação combinada de ULK1 e ULK2, sequestro de LDH fortemente reduzido em condições de inanição em células LNCaP (Figura 3-D). Além disso, nós confirmou nossa anteriores conclusões3,9 esse direcionamento da família da quinase de adesão focal interagindo proteína de 200 kDa (FIP200) ou combinado direcionamento do tipo ácido γ-aminobutírico (proteína associada do receptor de A (GABAA) Membros da família GABARAP) inibe o sequestro de LDH induzida por inanição (Figura 3-D).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57971/57971fig1v3.jpg"> Figura 1 : Fluxo total regime do protocolo de sequestro de LDH. O protocolo é baseado em um formato de placa de cultura de tecidos de 12-poços, usando os volumes indicados por amostra (a partir de um bem). O protocolo de ensaio convenientemente pode ser dividido em dois dias de trabalho separados, conforme indicado. No entanto, também é possível executar o procedimento inteiro em um dia. Abreviaturas: ABB, após o buffer de explosão (ver passo 3.3 no protocolo para ingredientes); RSB, ressuspensão Reserva (consulte a etapa 3.5 no protocolo para ingredientes). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57971/57971fig1v3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57971/57971fig2v5.jpg"> Figura 2 : Validação do ensaio de sequestro do LDH usando compostos inibindo autofagia. (A) LNCaP células também foram deixadas sem tratamento (com a finalidade de subtração de fundo: ver passo 1.3.2) em meio de cultura completo (CM; RPMI 1640 + 10% fetal de soro bovino (FBS)), ou foram tratados com veículo DMSO (0,1%) ou 100 nM Fab em CM ou em soro - e aminoácido livre médio (EBSS). Além disso, algumas células foram tratadas com 3MA (10 mM), SAR-405 (10 µM), ou Thapsigargin (300 nM), conforme indicado. Após 3 h de tratamento, as células foram colhidas e sequestro de LDH taxas foram determinadas como detalhado no protocolo atual. (B) HEK293 células foram tratadas com veículo DMSO (0,1%) em CM, ou com 100 nM Fab em EBSS, conforme indicado. Além disso, algumas das células receberam 10 µM MRT67307 (um inibidor do ULK) ou 300 nM Thapsigargin. Taxas de sequestro de LDH foram determinadas após 3 h de tratamento. (C-F) Células MEF (C), BJ (D), MCF-7 (E) ou RPE-1 (F) foram tratadas com veículo DMSO (0,1%) em CM, ou com Baf (10 nM em C, 100 nM em D-F) no EBSS com ou sem 3MA 10 mM, conforme indicado. Taxas de sequestro de LDH foram determinadas após 3 h de tratamento. A, B, D, E e F mostram valores médios de três réplicas biológicas (poços triplicadas) de um experimento (n = 1), com barras de erro, que representa o desvio-padrão. C mostra os valores médios de três experimentos independentes (n = 3), com barras de erro, que representam o erro padrão da média. p < 0.05, * * *p < 0,001, repetidas ANOVA One-Way de amostras.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57971/57971fig3v3.jpg"> Figura 3 : Validação do ensaio de sequestro do LDH por nocaute (A-C) ou nocaute (D) abordagens. (A-C) ATG5 tipo selvagem (WT) ou MEFs nocaute (KO) (A), ATG7 WT ou KO MEFs (B), ou ATG9A WT ou KO MEFs (C) foram tratados com veículo DMSO (0,01%) em CM, ou com 10 nM Fab em EBSS, conforme indicado. Taxas de sequestro de LDH foram determinadas após 3 h de tratamento. Valores de quatro médios (A; n = 4) ou três (B e C; n = 3) experimentos independentes, com barras de erro, que representam o erro padrão da média. p < 0.05, repetidas ANOVA de duas vias de amostras. Ns, não significativo. (D) LNCaP estavam reversos células transfectadas com 5 nM de um nontargeting controle siRNA (siCtrl), ou com 5 nM cada de ATG9A-, FIP200-, ULK1-, ULK2-, GABARAP-, GABARAPL1- ou GABARAPL2-direcionamento siRNA oligoes, conforme indicado. Após 48 h, as células também foram tratadas com veículo DMSO (0,1%) em CM, ou com 100 nM Fab em EBSS, conforme indicado. Taxas de sequestro de LDH foram determinadas após 3 h de tratamento. São mostrados os valores médios de três réplicas biológicas (poços triplicadas) de um experimento (n = 1), com barras de erro, que representa o desvio-padrão.

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The Lactate Dehydrogenase Sequestration Assay &#8212; A Simple and Reliable Method to Determine Bulk Autophagic Sequestration Activity in Mammalian Cells

Aqui, é descrito um protocolo simples e bem validado para medir a atividade de autophagic de sequestro em massa em células de mamíferos. O método baseia-se em quantificar a proporção de lactato desidrogenase (LDH) em frações de célula sedimentáveis em comparação com os níveis LDH totais do celulares.

O ensaio de sequestro de lactato desidrogenase — Um método simples e confiável para determinar a atividade de Autophagic de sequestro em massa em células de mamíferos

Bulk autophagy is characterized by the sequestration of large portions of cytoplasm into double/multi-membrane structures termed autophagosomes. Here a ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

18.0K visualizações.  University of Oslo. Aqui, é descrito um protocolo simples e bem validado para medir a atividade de autophagic de sequestro em massa em células de mamíferos. O método baseia-se em quantificar a proporção de lactato desidrogenase (LDH) em frações de célula sedimentáveis em comparação com os níveis LDH totais do celulares.

Vídeo: The Lactate Dehydrogenase Sequestration Assay — A Simple and Reliable Method to Determine Bulk Autophagic Sequestration Activity in Mammalian Cells

Pyrosequencing: A Simple Method for Accurate Genotyping

Pharmacogenetic research benefits first-hand from the abundance of information provided by the completion of the Human Genome Project. With such a tremendous amount of data available comes an explosion of genotyping methods. Pyrosequencing(R) is one of the most thorough yet simple methods to date used to analyze polymorphisms. It also has the ability to identify tri-allelic, indels, short-repeat polymorphisms, along with determining allele percentages for methylation or pooled sample assessment. In addition, there is a standardized control sequence that provides internal quality control. This method has led to rapid and efficient single-nucleotide polymorphism evaluation including many clinically relevant polymorphisms. The technique and methodology of Pyrosequencing is explained.


Pyrosequencing(R) is one of the most thorough yet simple methods to date used to analyze polymorphisms. This method has led to rapid and efficient single-nucleotide polymorphism evaluation including many clinically relevant polymorphisms. The technique and methodology of Pyrosequencing is explained.

Pyrosequencing: Um método simples para genotipagem Accurate

Pharmacogenetic research benefits first-hand from the abundance of information provided by the completion of the Human Genome Project. With such a ...

Biologia

Use of the Protease Fluorescent Detection Kit to Determine Protease Activity

The Protease Fluorescent Detection Kit provides ready-to-use reagents for detecting the presence of protease activity. This simple assay to detect protease activity uses casein labeled with fluorescein isothiocyanate (FITC) as the substrate.
Protease activity results in the cleavage of the FITC-labeled casein substrate into smaller fragments, which do not precipitate under acidic conditions. After incubation of the protease sample and substrate, the reaction is acidified with the addition of trichloroacetic acid (TCA). The mixture is then centrifuged with the undigested substrate forming a pellet and the smaller, acid soluble fragments remaining in solution. The supernatant is neutralized and the fluorescence of the FITC-labeled fragments is measured.
The described kit procedure detects the trypsin protease control at a concentration of approximately 0.5 &mu;g/ml (5 ng of trypsin added to the assay). This sensitivity can be increased with a longer incubation time, up to 24 hours. The assay is performed in microcentrifuge tubes and procedures are provided for fluorescence detection using either cuvettes or multiwell plates.

The Protease Fluorescent Detection Kit is designed for the measurement of protease activity using fluorometry. It is also suitable for detection of trace amounts of protease contamination. The method is based on the proteolytic hydroysis of a proprietary formulation of a FITC-labeled casein substrate.

Uso do Kit de Detecção de Protease Fluorescente para determinar a atividade de protease

The Protease Fluorescent Detection Kit provides ready-to-use reagents for detecting the presence of protease activity. This simple assay to detect ...

Clonogenic Assay: Adherent Cells

The clonogenic (or colony forming) assay has been established for more than 50 years; the original paper describing the technique was published in 19561. Apart from documenting the method, the initial landmark study generated the first radiation-dose response curve for X-ray irradiated mammalian (HeLa) cells in culture1. Basically, the clonogenic assay enables an assessment of the differences in reproductive viability (capacity of cells to produce progeny; i.e. a single cell to form a colony of 50 or more cells) between control untreated cells and cells that have undergone various treatments such as exposure to ionising radiation, various chemical compounds (e.g. cytotoxic agents) or in other cases genetic manipulation. The assay has become the most widely accepted technique in radiation biology and has been widely used for evaluating the radiation sensitivity of different cell lines. Further, the clonogenic assay is commonly used for monitoring the efficacy of radiation modifying compounds and for determining the effects of cytotoxic agents and other anti-cancer therapeutics on colony forming ability, in different cell lines. A typical clonogenic survival experiment using adherent cells lines involves three distinct components, 1) treatment of the cell monolayer in tissue culture flasks, 2) preparation of single cell suspensions and plating an appropriate number of cells in petri dishes and 3) fixing and staining colonies following a relevant incubation period, which could range from 1-3 weeks, depending on the cell line. Here we demonstrate the general procedure for performing the clonogenic assay with adherent cell lines with the use of an immortalized human keratinocyte cell line (FEP-1811)2. Also, our aims are to describe common features of clonogenic assays including calculation of the plating efficiency and survival fractions after exposure of cells to radiation, and to exemplify modification of radiation-response with the use of a natural antioxidant formulation.

The applicability of the clonogenic assay for evaluating reproductive viability has been established for more than 50 years. Here we demonstrate the general procedure for performing the clonogenic assay with adherent cells.

Clonogênica Ensaio: células aderentes

The clonogenic (or colony forming) assay has been established for more than 50 years; the original paper describing the technique was published in 19561. ...

A Matrigel-Based Tube Formation Assay to Assess the Vasculogenic Activity of Tumor Cells

Over the past several decades, a tube formation assay using growth factor-reduced Matrigel has been typically employed to demonstrate the angiogenic activity of vascular endothelial cells in vitro1-5. However, recently growing evidence has shown that this assay is not limited to test vascular behavior for endothelial cells. Instead, it also has been used to test the ability of a number of tumor cells to develop a vascular phenotype6-8. This capability was consistent with their vasculogenic behavior identified in xenotransplanted animals, a process known as vasculogenic mimicry (VM)9. There is a multitude of evidence demonstrating that tumor cell-mediated VM plays a vital role in the tumor development, independent of endothelial cell angiogenesis6, 10-13. For example, tumor cells were found to participate in the blood perfused, vascular channel formation in tissue samples from melanoma and glioblastoma patients8, 10, 11. Here, we described this tubular network assay as a useful tool in evaluation of vasculogenic activity of tumor cells. We found that some tumor cell lines such as melanoma B16F1 cells, glioblastoma U87 cells, and breast cancer MDA-MB-435 cells are able to form vascular tubules; but some do not such as colon cancer HCT116 cells. Furthermore, this vascular phenotype is dependent on cell numbers plated on the Matrigel. Therefore, this assay may serve as powerful utility to screen the vascular potential of a variety of cell types including vascular cells, tumor cells as well as other cells.

A tube formation assay is used to evaluate vascular activity of tumor cells.

A Matrigel-Based Assay formação do tubo para avaliar a atividade vasculogênica de células tumorais

Over the past several decades, a tube formation assay using growth factor-reduced Matrigel has been typically employed to demonstrate the angiogenic ...

Analysis of Cell Cycle Position in Mammalian Cells

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of cell proliferation underlies the pathology of diseases like cancer. As such there is great need to be able to investigate cell proliferation and quantitate the proportion of cells in each phase of the cell cycle. It is also of vital importance to indistinguishably identify cells that are replicating their DNA within a larger population. Since a cell&prime;s decision to proliferate is made in the G1 phase immediately before initiating DNA synthesis and progressing through the rest of the cell cycle, detection of DNA synthesis at this stage allows for an unambiguous determination of the status of growth regulation in cell culture experiments.
DNA content in cells can be readily quantitated by flow cytometry of cells stained with propidium iodide, a fluorescent DNA intercalating dye. Similarly, active DNA synthesis can be quantitated by culturing cells in the presence of radioactive thymidine, harvesting the cells, and measuring the incorporation of radioactivity into an acid insoluble fraction. We have considerable expertise with cell cycle analysis and recommend a different approach. We Investigate cell proliferation using bromodeoxyuridine/fluorodeoxyuridine (abbreviated simply as BrdU) staining that detects the incorporation of these thymine analogs into recently synthesized DNA. Labeling and staining cells with BrdU, combined with total DNA staining by propidium iodide and analysis by flow cytometry1 offers the most accurate measure of cells in the various stages of the cell cycle. It is our preferred method because it combines the detection of active DNA synthesis, through antibody based staining of BrdU, with total DNA content from propidium iodide. This allows for the clear separation of cells in G1 from early S phase, or late S phase from G2/M. Furthermore, this approach can be utilized to investigate the effects of many different cell stimuli and pharmacologic agents on the regulation of progression through these different cell cycle phases.
In this report we describe methods for labeling and staining cultured cells, as well as their analysis by flow cytometry. We also include experimental examples of how this method can be used to measure the effects of growth inhibiting signals from cytokines such as TGF-&beta;1, and proliferative inhibitors such as the cyclin dependent kinase inhibitor, p27KIP1. We also include an alternate protocol that allows for the analysis of cell cycle position in a sub-population of cells within a larger culture5. In this case, we demonstrate how to detect a cell cycle arrest in cells transfected with the retinoblastoma gene even when greatly outnumbered by untransfected cells in the same culture. These examples illustrate the many ways that DNA staining and flow cytometry can be utilized and adapted to investigate fundamental questions of mammalian cell cycle control.

Determining the cell cycle position of a population of cells, or understanding how signals affect proliferation, can be readily measured by flow cytometry using this protocol. We report a simple experimental approach to staining cells and quantifying their position in the cell cycle.

Análise da posição do ciclo celular em células de mamíferos

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of ...

Visualization of Endoplasmic Reticulum Localized mRNAs in Mammalian Cells

In eukaryotes, most of the messenger RNAs (mRNAs) that encode secreted and membrane proteins are localized to the surface of the endoplasmic reticulum (ER). However, the visualization of these mRNAs can be challenging. This is especially true when only a fraction of the mRNA is ER-associated and their distribution to this organelle is obstructed by non-targeted (i.e. "free") transcripts. In order to monitor ER-associated mRNAs, we have developed a method in which cells are treated with a short exposure to a digitonin extraction solution that selectively permeabilizes the plasma membrane, and thus removes the cytoplasmic contents, while simultaneously maintaining the integrity of the ER. When this method is coupled with fluorescent in situ hybridization (FISH), one can clearly visualize ER-bound mRNAs by fluorescent microscopy. Using this protocol the degree of ER-association for either bulk poly(A) transcripts or specific mRNAs can be assessed and even quantified. In the process, one can use this assay to investigate the nature of mRNA-ER interactions.

Here we describe a method to visualize endoplasmic reticulum-associated mRNAs in mammalian tissue culture cells. This technique involves the selective permeabilization of the plasma membrane with digitonin to remove cytoplasmic contents followed by fluorescent in situ hybridization to detect either bulk poly(A) mRNA or specific transcripts.

Visualização de mRNAs retículo endoplasmático localizados em células de mamíferos

In eukaryotes, most of the messenger RNAs (mRNAs) that encode secreted and membrane proteins are localized to the surface of the endoplasmic reticulum ...

Autonomously Bioluminescent Mammalian Cells for Continuous and Real-time Monitoring of Cytotoxicity

Mammalian cell-based in vitro assays have been widely employed as alternatives to animal testing for toxicological studies but have been limited due to the high monetary and time costs of parallel sample preparation that are necessitated due to the destructive nature of firefly luciferase-based screening methods. This video describes the utilization of autonomously bioluminescent mammalian cells, which do not require the destructive addition of a luciferin substrate, as an inexpensive and facile method for monitoring the cytotoxic effects of a compound of interest. Mammalian cells stably expressing the full bacterial bioluminescence (luxCDABEfrp) gene cassette autonomously produce an optical signal that peaks at 490 nm without the addition of an expensive and possibly interfering luciferin substrate, excitation by an external energy source, or destruction of the sample that is traditionally performed during optical imaging procedures. This independence from external stimulation places the burden for maintaining the bioluminescent reaction solely on the cell, meaning that the resultant signal is only detected during active metabolism. This characteristic makes the lux-expressing cell line an excellent candidate for use as a biosentinel against cytotoxic effects because changes in bioluminescent production are indicative of adverse effects on cellular growth and metabolism. Similarly, the autonomous nature and lack of required sample destruction permits repeated imaging of the same sample in real-time throughout the period of toxicant exposure and can be performed across multiple samples using existing imaging equipment in an automated fashion.

Mammalian cells expressing the bacterial bioluminescence gene cassette (lux) produce light autonomously. The resulting bioluminescent dynamics upon chemical exposure have been demonstrated to reflect the treatment effects on cellular growth and metabolism, making these cells an inexpensive, continuous, real-time toxicity screening tool that can easily be adapted for high-throughput automation.

Células de mamíferos autonomamente bioluminescentes para monitoramento contínuo e em tempo real de citotoxicidade

Mammalian  cell-based in vitro assays have been  widely employed as alternatives to animal testing for toxicological studies but  have been limited due to ...

Simple Bulk Readout of Digital Nucleic Acid Quantification Assays

Digital assays are powerful methods that enable detection of rare cells and counting of individual nucleic acid molecules. However, digital assays are still not routinely applied, due to the cost and specific equipment associated with commercially available methods. Here we present a simplified method for readout of digital droplet assays using a conventional real-time PCR instrument to measure bulk fluorescence of droplet-based digital assays.
We characterize the performance of the bulk readout assay using synthetic droplet mixtures and a droplet digital multiple displacement amplification (MDA) assay. Quantitative MDA particularly benefits from a digital reaction format, but our new method&#160;applies to any digital assay. For established digital assay protocols such as digital PCR, this method serves to speed up and simplify assay readout.
Our bulk readout methodology brings the advantages of partitioned assays without the need for specialized readout instrumentation. The principal limitations of the bulk readout methodology are reduced dynamic range compared with droplet-counting platforms and the need for a standard sample, although the requirements for this standard are less demanding than for a conventional real-time experiment. Quantitative whole genome amplification (WGA) is used to test for contaminants in WGA reactions and is the most sensitive way to detect the presence of DNA fragments with unknown sequences, giving the method great promise in diverse application areas including pharmaceutical quality control and astrobiology.

We describe an endpoint digital assay for quantifying nucleic acids with a simplified (analog) readout. We measure bulk fluorescence of droplet-based digital assays using a standard qPCR machine rather than specialized instrumentation and confirm our results by microscopy.

Simples massa de Leitura Digital de Ácido Nucleico Quantificação Assays

Digital assays are powerful methods that enable detection of rare cells and counting of individual nucleic acid molecules. However, digital assays are ...

Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid decline in renal function and development of the clinical syndrome known as acute kidney injury (AKI). Pharmacological agents used to treat medical circumstances ranging from bacterial infection to cancer, when administered individually or in combination with other drugs, can initiate AKI. Zebrafish are a useful animal model to study the chemical effects on renal function in vivo, as they form an embryonic kidney comprised of nephron functional units that are conserved with higher vertebrates, including humans. Further, zebrafish can be utilized to perform genetic and chemical screens, which provide opportunities to elucidate the cellular and molecular facets of AKI and develop therapeutic strategies such as the identification of nephroprotective molecules. Here, we demonstrate how microinjection into the zebrafish embryo can be utilized as a paradigm for nephrotoxin studies.

Renal injuries incurred from nephrotoxins, which include drugs ranging from antibiotics to chemotherapeutics, can result in complex disorders whose pathogenesis remains incompletely understood. This protocol demonstrates how zebrafish can be used for disease modeling of these conditions, which can be applied to the identification of renoprotective measures.

Nefrotoxina microinjeção no peixe-zebra ao modelo de lesão renal aguda

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid ...

Filtration Isolation of Nucleic Acids:  A Simple and Rapid DNA Extraction Method

FINA, filtration isolation of nucleic acids, is a novel extraction method which utilizes vertical filtration via a separation membrane and absorbent pad to extract cellular DNA from whole blood in less than 2 min. The blood specimen is treated with detergent, mixed briefly and applied by pipet to the separation membrane. The lysate wicks into the blotting pad due to capillary action, capturing the genomic DNA on the surface of the separation membrane. The extracted DNA is retained on the membrane during a simple wash step wherein PCR inhibitors are wicked into the absorbent blotting pad. The membrane containing the entrapped DNA is then added to the PCR reaction without further purification. This simple method does not require laboratory equipment and can be easily implemented with inexpensive laboratory supplies. Here we describe a protocol for highly sensitive detection and quantitation of HIV-1 proviral DNA from 100 &#181;l whole blood as a model for early infant diagnosis of HIV that could readily be adapted to other genetic targets.

We describe here a simple and rapid paper-based DNA extraction method of HIV proviral DNA from whole blood detected by quantitative PCR. This protocol can be extended for use in detecting other genetic markers or using alternative amplification methods.

Isolamento de filtração de Ácidos Nucleicos: Um Método de extracção de DNA simples e rápido

FINA, filtration isolation of nucleic acids, is a novel extraction method which utilizes vertical filtration via a separation membrane and absorbent pad ...