The authors acknowledge Liyi Xu for providing MDA reagents and protocols. We also thank David Feldman and Navpreet Ranu for discussions relating to this work. This work was supported in part by a Burroughs Wellcome Career Award at the Scientific Interface to PCB.

Nota: Fabrico do Dispositivo de microfluidos não é necessário para este ensaio, como gotas para este protocolo pode ser formado com os fabricantes de gotículas comerciais existentes 23,29. 1. Verifique o dispositivo micro-gota de formação <ol><li> Prepare molde mestre para os canais com o protocolo de Fabricação Mestre SU-8 delineado anteriormente 31, mas com um padrão de máscara gerador de gota 32. </li><li> Fabricar dispositivos em PDMS utilizando as técnicas de litografia macia 32,33. </li></ol> 2. Prepare mistura de reacção para massa Gota Leitura Nota: O protocolo pode ser utilizado para quantificar os ácidos nucleicos, utilizando vários tipos de reacções de amplificação. Como um exemplo, os reagentes necessários para MDA de várias concentrações de DNA de lambda são dadas. Detalhes reagentes estão listadas na Tabela de reagentes específicos. A distribuição de molde dentro das gotas depende sufficienT de mistura da amostra. <ol><li> Obter ou polimerase de ADN Purificar phi29. <ol><li> Purificar phi29 como descrito anteriormente 7, ou compra de fornecedor. O phi29 usado para as experiências mostradas foi purificado. </li></ol></li><li> Preparar 10 ml de tampão consistindo de desnaturação de KOH 65 mM, EDTA 1,65 mM e DTT 14 mM. </li><li> Preparar 10 ml de tampão consistindo de Neutralização de 65 mM de HCl, 0,21 M de Tris-Cl pH 7,0, e Tris-Cl 9 mM, pH 8,0. </li><li> Prepare dois padrões, um nenhum controle modelo (NTC), tais como água livre de nuclease, e uma alta concentração de modelo (em torno de 4 pg / l DNA Lambda). Desnaturar 3,3 mL de cada padrão com 3,3 ul de tampão de desnaturação em um tubo de qPCR. Incubar à temperatura ambiente durante 3 min. Extingue-se cada um com 3,3 mL de tampão de neutralização. </li><li> Desnaturar 3,3 ul do modelo de interesse com 3,3 ul de tampão de desnaturação em um tubo de qPCR. Incubar à temperatura ambiente durante 3 min. Extingue-se com 3,3 mLTampão de neutralização. </li><li> Prepare 11 mL de mistura de mestre por amostra em gelo. A mistura mestre reação 2x MDA consiste de DNA de cadeia dupla 2x (dsDNA) corante vinculativo, corante de referência 2x qPCR, 50 mM oligo randomizados, 2 mg / ml BSA, 2x phi29 DNA polimerase Reaction Buffer, dNTPs 4,8 mM, água livre de nuclease , e 40 ug de polimerase / mL de ADN de phi29. Adicionar polimerase ADN phi29 último para garantir a polimerase não encontrar níveis de pH muito mais elevado ou mais baixo que 7.5.Mix bem. </li><li> Opcional: Para menos falsos positivos, expor mistura principal com luz UV antes de formar gotículas 34. <ol><li> Prepare 10 ml de pré-mistura por amostra em um 0,5 ml ou 1,5 ml tubo transparente no gelo. A pré-mistura é composta de 55 ï¿½M oligo randomizado, 2,2 mg / ml BSA, 1.1x phi29 DNA polimerase Reaction Buffer, 5,3 mM dNTPs, e de água livre de nuclease. </li><li> Colocar o tubo em água em gelo tal como descrito 34 e expor à luz UV (254 nm) para um acumuladormulado de dose de 5,7 J / cm 2. </li><li> Adicionar corante dsDNA de ligação a 1x, corante de referência para 1x, phi29 e a 40 ug / ml na pré-mistura. Misture bem. </li></ol></li><li> Combine 10 ul de modelo ou padrão desnaturado e 10 ul de mistura de mestre. Misture bem. </li></ol> 3. Gota Formação Nota: Gotas pode ser muito sensível à eletricidade estática e tensão de cisalhamento. Remover as roupas que podem causar eletricidade estática, e aterre-se antes de formar gotas. Manipular tubos de emulsão a partir do topo do tubo, na medida do possível emulsão. Emulsões de pipetas muito lentamente, de preferência com uma grande ponta furo pipeta. Quando a distribuição a partir de uma ponta de pipeta, assistir a emulsão no lado da ponta para determinar a velocidade de pipetagem. <ol><li> Gotículas de formulário. Para as experiências apresentadas, o dispositivo de microfluidos tem uma entrada de óleo e aquosas com duas entradas de fluxo de uma junção de focagem para a geração de gotículas. Use duas syriESL bombas para controlar as taxas de fluxo de 55 ul de óleo e um agente tensioactivo com 20 ul de mistura de reacção através do chip de microfluidos para gerar gotículas 20000 1 nl. </li><li> Nota: É possível a produção de gotículas, com muitos tipos de óleo com agente tensioactivo, mas a composição irá afectar grandemente a estabilidade a altas temperaturas gota e ao longo do tempo. Uma combinação possível é HFE óleo fluorado 7500 com um surfactante aniónico 19,35. </li><li> Produzir gotas em qualquer tamanho, com qualquer método de 13,36, mas a variabilidade do tamanho da população de gotículas irá afectar a fluorescência grandes quantidades, e, portanto, a exactidão do ensaio. Para as experiências apresentadas, as gotas foram monodisperso com um volume de 1 nl. </li><li> Recolha todas as gotas de óleo e em tubos de PCR. Para cada amostra, alíquota de 30 ul de óleo em tubos de PCR fresco com tampas ópticos, e transferir 20 ul de gotas na parte superior do óleo. Os volumes consistentes assegurar o ensaio é como se accuradoria possível. </li><li> Fechar tubo de tampões com força, como tampas soltas permitirá que o óleo evapore. </li></ol> 4. A amplificação isotérmica <ol><li> Usando um termociclador de PCR, qPCR termociclador, ou placa quente, incubar as amostras a 30 ° C durante 7 h, e inactivar durante 1 min a 75 ° C. Os tubos de gotículas pode ser deixado em frigorífico coberto com folha durante algumas horas a este ponto. </li></ol> 5. Aquisição de Dados e Análise <ol><li> Imediatamente após inactivação reação, medir os níveis de fluorescência de corante para todas as amostras utilizando o termociclador qPCR. Configurações de filtro ideais dependerá excitação corante e espectros de emissão. Para este exemplo, utilizar o filtro 516 nm-492 nm para o corante definido dsDNA de ligação, e o filtro 585 nm 610 nm-definido para o corante de referência. Outras técnicas de medição de fluorescência pode ser utilizado para quantificar a fluorescência. </li><li> Para cada amostra, dividir a intensidade de fluorescência do corante por ligação de ADNcd-a intensidade de fluorescência do corante de referência. Subtrair a fluorescência de fundo, ou a fluorescência do controlo normalizado nenhum modelo, a partir de todas as amostras. </li><li> Criar uma curva padrão linear utilizando as medições de fluorescência corrigida dos padrões. A norma NTC representa a fluorescência de uma amostra com 0% de gotas fluorescentes (&quot;todos negativos&quot;), e a medição de fluorescência de concentração alta é a fluorescência de modelo esperado para uma amostra com 100% gotas fluorescentes (&quot;todos positivos&quot;). Usando a curva padrão correspondente, prever as proporções intermédias de gotículas positivos e negativos com base na sua fluorescência grandes quantidades. </li></ol> 6. produzem gotas do princípio de prova de Medidas <ol><li> Adicione fluorescentes gotículas (positivo): Prepara-se uma mistura de reacção de PCR que consiste em 0,1 ng de ADN lambda, corantes 1x dsDNA de ligação de corante de referência, 1x, 1,5 unidades de ADN-polimerase Taq, 10 mM de Tris-HCl, 50 mM de KCl, 1,5 mM de MgCl2, 0,2 mM de dNTP, 0,5 uM e iniciadores. Thermocycle a mistura 30 vezes (95 ° C durante 20 seg, 55 ° C durante 20 seg, 72 ° C durante 1 min), em seguida, formar gotículas tal como descrito acima. </li><li> Adicione não fluorescentes gotículas (negativo): Prepara-se uma mistura reaccional de PCR consistindo de corante 1x dsDNA de ligação, corante de referência 1x, 1,5 unidades de DNA-polimerase Taq, 10 mM de Tris-HCl, 50 mM de KCl, 1,5 mM de MgCl2, dNTP 0,2 mM, e 0,5 uM iniciadores. Thermocycle a mistura 30 vezes (95 ° C durante 20 seg, 55 ° C durante 20 seg, 72 ° C durante 1 min), em seguida, formar gotículas. </li><li> Formando rácios de gotículas pré-misturados <ol><li> Distribuir 20 l de óleo fluorado em tubos de qPCR, cubra com uma tampa óptica para evitar a evaporação. </li><li> Suavemente Pipetar 10 ul de gotas bem misturadas em proporções desejadas positivas: negativas no topo do óleo. Nos resultados mostrados, positivas: negativas foram rácios de gotículas 1 (todas positivas), 0,8, 0,5, 0,2, 0,1, 0,01, 0,001, 0,0001, e 0 (todos Negative). </li></ol></li><li> Medir os níveis de corante de fluorescência para todas as amostras utilizando o termociclador qPCR. Para este protocolo, utilize o nm-516 filtro 492 nm definido para o corante dsDNA vinculativo, eo filtro nm 585 nm-610 definido para o corante de referência. <ol><li> Normalizar ligação dsDNA fluorescência corante utilizando corante de referência de fluorescência. Além disso por normalizar a fluorescência da &quot;todos positivos&quot; amostra. </li></ol></li><li> Criar uma curva padrão linear utilizando as medições de fluorescência normalizados a partir de todos os &quot;positivos&quot; e &quot;negativos&quot; todas as amostras. Usando a curva padrão correspondente, prever as proporções intermédias de gotículas positivos e negativos com base na sua fluorescência grandes quantidades. </li><li> Repita a experiência para cada relação (n = 3) com a formação de gotículas e de mistura independente para cada replicado. </li></ol> 7. A prova de princípio MDA Experiment <ol><li> Medir a concentração da solução de DNA de lambda com uma especificaçãotrophotometer. <ol><li> Calcula-se a concentração necessária para molde média 10 moléculas de molde por gota. Para este protocolo, assumir volumes de gotículas são 1 nl e 1 ng de DNA Lambda contém aproximadamente 1,9 x 10 7 cópias. Portanto, 10 modelos por gotícula será de 10 cópias por nl, ou 526 fg de DNA Lambda per il. O modelo será diluída ~ 6x quando gotículas são formadas, portanto, a concentração inicial mais elevada molde será de 3,2 pg / ul. </li></ol></li><li> Em série diluir o DNA Lambda para 3,2 pg / mL com tampão de desnaturação e volume igual Neutralização Buffer. Para um factor de diluição de 0,1, 10 ul de amostra combinar com 45 ul de tampão de desnaturação e incubar à TA durante 3 min. Adicionar 45 LL de Neutralização de buffer para saciar. </li><li> Diluir a amostra, tal como descrito no passo 7.2 para fazer o resto das amostras para o experimento. As concentrações iniciais do modelo nas reações apresentadas foram de 3,2 pg, 320 fg,160 fg, 32 fg, 16 fg, 3,2 fg e 1,6 fg por microlitro. Nota: As concentrações de modelo finais depois disso mastermix foram 526 fg, 52,6 fg, 26,3 fg, 5,26 fg, 2,63 fg, ag 526 e 263 ag por microlitro. 10, 1, 0,5, 0,1, 0,05, 0,01, 0,005 e Lambda esperados cópias por gota, respectivamente. </li><li> Gerar e analisar gotículas a partir de cada amostra, tal como descrito nos passos 2.5-5.3. </li><li> Adquirir as imagens fluorescentes mostrados (Figura 2,3), utilizando uma câmera digital acoplada a um microscópio epi-fluorescência com um objetivo 10x em RT. Adquirir doze campos de visão para cada amostra. Imagens de fluorescência corretas por uma imagem de fundo obtido com um slide fluorescente. </li><li> Use uma câmara continha 37 para geração de imagens como o óleo de emulsão irá evaporar rapidamente. </li><li> Analisar intensidades de gotículas individuais usando uma macro ImageJ (arquivo de código Suplementar). <ol><li> Escolha uma intensidade de limiar de fluorescência que melhor separa gotículas não fluorescentes no NImagens de CT das gotículas fluorescentes nas imagens de alta concentração de modelo. Para cada amostra desconhecida, calcular a fracção de gotículas com uma intensidade de fluorescência acima do limiar. </li></ol></li></ol> 8. PCR e reacções de MDA a granel <ol><li> Prepare a reacção de PCR. <ol><li> Serialmente diluídas ADN molde com um factor de diluição de 0,1. Para cada diluição, combinar 10 ul de molde com 45 ul de tampão de desnaturação e incubar à TA durante 3 min. Combinar a diluição com 45 ul de tampão de neutralização. </li><li> Prepare 20 l de PCR mastermix por amostra. A mistura de reacção 1,1x mestre de PCR consiste em 60 unidades / ul de ADN de Taq, polimerase 11 mM de Tris-HCl, 55 mm de KCl, 1,65 mM de MgCl2, dNTP 0,22 mM, corante, corante de referência 1,1x e 550 nM de ligação de ADNcd 1,1x cada iniciador. </li><li> Combinar 2 ul de modelo diluído e 20 l de mastermix. Nota: As concentrações finais no molde tele reacções PCR foram mostrados 50 pg, 5 pg, 500 fg, 50 fg, 5 fg, AG 500, 0 g e DNA de lambda por microlitro, e foram realizadas em triplicado. </li><li> Thermocycle reação de PCR em máquina qPCR com o seguinte programa. Executar 40 ciclos de 95 ° C durante 30 seg, 57 ° C durante 20 seg, 72 ° C durante 30 segundos antes de 2 min a 72 ° C durante 2 minutos e manutenção a 4 ° C. </li><li> Normalizar ligação dsDNA corante fluorescente usando referência corante fluorescente antes de uma análise mais aprofundada. </li></ol></li><li> Prepare reação MDA. <ol><li> Diluir as amostras tal como descrito no passo 8.1.1. </li><li> Prepare 11 mL de mistura de mestre por amostra em gelo. A mistura mestre de reacção 2x MDA consiste de corante 2x dsDNA de ligação, corante de referência 2x, 50 | iM de oligo randomizado, 2 mg / ml de BSA, 2x phi29 ADN Polimerase Tampão de Reacção, 4,8 mM dNTPs, água livre de nuclease, e 40 ug / ml phi29 ADN polimerase. </li><li> Adicionar a polimerase de ADN de phi29 a 40 ug / ml de duração para assegurar a polimerase dOES não encontrar níveis de pH muito mais elevado ou mais baixo do que 7,5. Misture bem. </li><li> Desnaturar 3,3 mL de modelo diluída com 3,3 mL de tampão de desnaturação em um tubo de qPCR. Incubar à temperatura ambiente durante 3 min. Adicionar 3,3 uL de tampão de neutralização. </li><li> Combinar 10 mL de modelo desnaturado e 10 ul de mistura mestre. Misture bem. </li><li> Execute reação MDA na máquina qPCR com o seguinte programa. </li><li> Segure a 30 ° C durante 4 horas, medir a fluorescência a cada 7,5 minutos. </li><li> Inactivar a 75 ° C durante 1 min. </li><li> Normalizar ligação dsDNA fluorescência corante utilizando corante de referência de fluorescência. Além disso normalizar a fluorescência máxima por para cada amostra. </li></ol></li></ol>

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W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G.M.+Softlithographie.">G.M. Softlithographie.</a> Angew Chem. 110 (5), 26 (1998).</li><li>Woyke, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decontamination+of+MDA+reagents+for+single+cell+whole+genome+amplification.">Decontamination of MDA reagents for single cell whole genome amplification.</a> PLoS One. 6 (10), e26161 (2011).</li><li>Hindson, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=System+for+hot-start+amplification+via+a+multiple+emulsion.">System for hot-start amplification via a multiple emulsion.</a> US patent. , (2014).</li><li>Utada, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monodisperse+double+emulsions+generated+from+a+microcapillary+device.">Monodisperse double emulsions generated from a microcapillary device.</a> Science. 308 (5721), 537-541 (2005).</li><li>Eastburn, D. J., Sciambi, A., Abate, A. 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Chem. Soc. 133 (44), 17705-17712 (2011).</li><li>Link, D. R., Anna, S. L., Weitz, D. A., Stone, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Geometrically+mediated+breakup+of+drops+in+microfluidic+devices.">Geometrically mediated breakup of drops in microfluidic devices.</a> Phys. Rev. Lett. 92 (5), 054503 (2004).</li><li>Nisisako, T., Torii, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+large-scale+integration+on+a+chip+for+mass+production+of+monodisperse+droplets+and+particles.">Microfluidic large-scale integration on a chip for mass production of monodisperse droplets and particles.</a> Lab Chip. 8 (2), 287-293 (2008).</li><li>Romanowsky, M. B., Abate, A. R., Rotem, A., Holtze, C., Weitz, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+throughput+production+of+single+core+double+emulsions+in+a+parallelized+microfluidic+device.">High throughput production of single core double emulsions in a parallelized microfluidic device.</a> Lab Chip. 12 (4), 802-807 (2012).</li></ol>

The Broad Institute may move to file a patent application that includes aspects of this work.

Ensaios digitais são poderosos métodos que permitem a detecção de células raras e de contagem individual das moléculas de ácido nucleico. No entanto, ensaios digitais são ainda não rotineiramente aplicados em laboratórios de análises, em parte devido ao custo de equipamento especializado associada com métodos comercialmente disponíveis. Descrevemos aqui um ensaio de ponto final para quantificar digital de ácidos nucleicos com uma leitura analógica simplificado utilizando uma máquina de PCR quantitativa em tempo real padrão. Este método é rápido de configurar, e leitura é muito mais simples do que os métodos de contagem de gotas. Nosso ensaio perde a sensibilidade única molécula (single-gota) das medições de gotículas individuais para a simplicidade de massa endpoint medição usando instrumentação padrão. Em nosso experimento MDA digitais, não foi possível distinguir menos de 1 gota positiva por 200 gotas negativos de fundo, apesar da confirmação por microscopia de fluorescência que a fra realcção de gotículas positivas foi como esperado (Figura 4). A sensibilidade e de fundo no limite de medição de fluorescência maior a sensibilidade do ensaio de medição de massa para as frações de baixa positivos gota. Se uma sensibilidade mais elevada é necessária, recomenda-se uma leitura digital. As diferenças nos níveis de óleo ou volumes de gotículas granel podem afetar significativamente os dados de amostra de fluorescência. Mesmo normalização com um corante de referência não pode compensar as diferenças volumes de petróleo fazem da fluorescência lê. É possível que a optimização do volume de ensaio, os parâmetros de aquisição de instrumentos, geometria de micropoços, ou filtros ópticos pode melhorar o desempenho do ensaio. A sensibilidade e a gama dinâmica de ensaios digitais granel também pode ser melhorada através da optimização do tamanho da partição. Gotas maiores produzir uma maior quantidade de produtos fluorescentes de cada molécula modelo, o que pode ajudar a superar fundo instrumental e melhorar a sensibilidade para baixas concentrações de entrada. LigarPor outro lado, pequenas gotículas permitem o isolamento de moléculas por mais de volume ensaiado. Se a concentração de molde é altamente variável entre as amostras, ambas as pequenas e grandes reacções de gotículas pode ser levada a cabo em paralelo para expandir a gama dinâmica do ensaio 39. Volumes de gotículas consistentes são também necessários para a medição precisa. Existem muitas soluções personalizadas microfluídicos para formar rapidamente gotas monodispersas partir de uma amostra, tanto em série e em paralelo 19,40 41,42. Enquanto alguns permitir a geração de gotículas a partir de várias amostras independentes em paralelo, simples modificações aos modelos existentes, que permitem a geração de gotículas simultânea de qualquer número de amostras. Por exemplo, o sistema Bio-Rad ddPCR 23 aplica uma pressão uniforme para as entradas de uma série de fabricantes de gotículas independentes, permitindo a formação de gotículas a partir de múltiplas amostras em simultâneo. Nossa metodologia granel leitura acessa chavevantagens de ensaios digitais particionadas sem a necessidade de uma instrumentação e leitura especializado é bem adequada para WGA quantitativa. Aqui, nós nos concentramos em WGA quantitativa, que é altamente suscetível a contaminantes fundo, devido à sua falta de especificidade da sequência 7. Além disso, a distribuição do peso molecular desconhecido e potencialmente vasto de produtos a partir de ensaios em tempo real quantitativos WGA tornar difícil interpretação em aplicações em que o número de modelos originais é de interesse. Endereços de formatação ensaio digitais ambos os problemas. Os contaminantes são contidos divisórias individuais de reacção, impedindo a dominância de analitos de baixo peso molecular, por contaminantes de alto peso molecular, como ocorreria num ensaio em tempo real convencional. Nas Figuras 2B e 4B, possíveis contaminantes, vista como pontos brilhantes dentro das gotículas, são segregados e não amplificar ou contribuir substancialmente para a fluorescência total. Além disso, osinal gerado em ensaios digitais é proporcional ao número de moldes, e não o tamanho dos moldes ou a sua taxa de amplificação. Embora o método se baseia em padrões para calibrar a medição digital de grandes quantidades, o requisito para combinar com a amostra e características padrão pode ser significativamente relaxada. Quantitativa WGA é comumente utilizada para quantificar contaminantes em reacções WGA 7,34, e é o método mais sensível conhecido para quantificar a presença de ADN de sequência desconhecida, dando ao método uma grande promessa em áreas de aplicação tão diversas como o controlo de qualidade farmacêutica, forense, e astrobiologia. Leitura digital em massa pode beneficiar outros protocolos de ensaio digitais, tais como digitais PCR, através da aceleração, paralelização, e simplificando ensaio de leitura.

Ensaios digitais para quantificação de ácidos nucleicos (PCR digital) 1-4 e com base em ordem (sequência) estão impactando fortemente as ciências da vida e medicina. Ensaios digitais fornecem quantificação de contagens moleculares numa escala absoluta (não relativamente a um controlo), fornecimento de alta sensibilidade, permitindo comparações entre experiências fáceis, e crucialmente, permitindo a construção de grandes bases de dados contendo dados comparáveis ​​5 (Tabela 1). Ao longo dos últimos 15 anos, a amplificação do genoma inteiro (WGA) surgiram ao lado de PCR como uma ferramenta geral para a amplificação de ácido nucleico. Como PCR, o WGA é útil para aplicações analíticas e preparativas por amplificar elementos da amostra minuto até um nível que pode ser facilmente detectado ou utilizados para análises posteriores, como a sequenciação base. Ao contrário de PCR, WGA não é específico para um locus de ADN particular, em vez permitindo a amplificação de todas as sequências da amostra, incluindo seqüências desconhecidas.Esta diferença fundamental entre PCR e WGA torna os métodos complementares um ao outro e dá origem a diferentes desafios na sua aplicação. O alto rendimento das reações WGA 6 permite amplificação rotina de DNA genômico a partir de moléculas individuais 7, 8 células individuais e outras amostras de baixa biomassa 9 para a quantificação ou análise posterior. Os principais desafios associados com a WGA química são a sua extrema sensibilidade à contaminantes e a amplificação desigual entre moléculas do molde 6 individuais. No entanto, WGA está ganhando popularidade como sequenciamento de uma única célula emergiu como o &quot;aplicativo matador&quot; da tecnologia WGA 10, e modelo de quantificação por WGA é importante em muitos campos de aplicação 7. Instrumentação para a quantificação de ácido nucleico digital foi anteriormente descrito em uma variedade de valvulado e valveless forma de microfluidosTS 11-14, incluindo ensaios baseados em gotículas 15,16 (Tabela 2). No entanto, os sistemas microfluídicos comerciais para análise digital exige equipamento especializado para a configuração de reação e detecção do produto 17. Microfluídica costume valvulados são flexíveis, mas requerem microfabricação de precisão e sistemas de controle pneumático 18. Embora seja relativamente simples de fazer micro-gotas monodispersas para sistemas baseados em emulsão ensaios digitais 19,20, leitura digital é tecnicamente onerosa, exigindo tanto em larga escala em todo o campo de imagem (similar às tecnologias de sequenciamento de próxima geração populares) ou 21,22 alta velocidade de fluxo baseado em detecção de gotículas 23-25. Idealmente, um ensaio digitais seria simples de ajustar-se a leitura, reduzindo a necessidade de instrumentação complexa e permite que um grande número de amostras a ser lida rapidamente. Aqui nós descrevemos um método simplificado para a leitura de ensaios de gotículas digitais que usa um real-time PCR convencional iINSTRUMENTO para medir a fluorescência de grandes quantidades de ensaios digitais baseados em gotículas. Enquanto a nova abordagem pode ser aplicada para ensaios de PCR digitais, é particularmente vantajoso para os ensaios de WGA digitais para analógico que os ensaios de amplificação em tempo real (que dão excelentes resultados para PCR) são problemáticos. WGA é comumente aplicado a amostras com moléculas do molde que são heterogêneos em sequência, comprimento e conteúdo base. Estas moléculas do molde diferentes são amplificados em diferentes taxas de 6, necessitando da utilização de uma referência (&quot;standard&quot;) de uma amostra com características correspondentes. Muitas vezes, há tal padrão é disponível, ou as características das amostras de entrada são desconhecidos. A heterogeneidade do material de entrada e da propriedade dependente do comprimento de químicas de WGA 26 também complicar a interpretação dos resultados, criando ambiguidade em que está a ser quantificado - a massa de entrada, o número de moléculas de entrada, de uma combinação dos dois, ou nenhum deles. Finalmente, a sequência não-especificidade torna amplificação por deslocamento de múltiplos quantitativa (MDA) mais sensíveis à contaminação de PCR quantitativa uma vez que as moléculas de contaminantes de qualquer sequência tem um potencial de interferir. Ensaios digitais microfluídicos abordar a contaminação por segregar moléculas do molde e reduzindo volumes de reacção tais que menos contaminantes são amostrados. Aqui usamos um método WGA isotérmico popular, MDA 27. De nota, várias outras químicas WGA incluindo PicoPlex e MALBAC 28 dependem crucialmente passos iniciais de deslocamento isotérmico Strand. Etapas isotérmicas exacerbar o desafio de aplicar ensaios em tempo real analógicos para WGA quantitativa. WGA não pode nem ser totalmente impedida durante a instalação, levando a pré-amplificação variável indesejada, nem discretizado (&quot;ciclo&quot;) de uma forma em que a replicação de moléculas heterogêneas pode ser conduzido até a conclusão e parou antes do próximo ciclo como PCR 11 </sup&gt; (Figura 1). Um formato de ensaio digital para WGA acolhe procedimentos de configuração típica reação devido à segregação de cada molécula para enumeração no ponto final do ensaio (para pré-amplificação não afeta os resultados) leitura inicial significa precisão seria largamente independente da variação na eficiência de amplificação. O ensaio depende de gotículas produzidas em óleo com volumes uniformes, como o nível do sinal por gota no ponto final do ensaio vai depender do volume de gotículas, e nós não queremos que a consistência dos resultados que depender de média através de uma distribuição de tamanhos de gotas. Fazendo gotas monodispersas agora é um procedimento padrão (cerca de 3.500 documentos de gotas monodispersas foram publicados desde 2013), mas requer instrumentação microfluídico 25. Na verdade, mais de seis empresas desenvolveram produtos comerciais independentes, que dependem da produção de tais gotas, e chips microfluídicos de tomada de gotículas sãocomercialmente disponível 23,29. Para este estudo, foram utilizados dispositivos microfluídicos personalizados produzidos internamente (veja Protocol). Bombas de Seringa para dirigir escoamento através dos dispositivos estão também disponíveis comercialmente, mas em alternativa, podem ser substituídos com uma única seringa descartável para o fluxo orientado a vácuo para reduzir os custos de 30.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Evagreen Dye</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>31000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>New England Biotechnologies</td>
			<td>B9000S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phi29 DNA Polymerase Reaction Buffer</td>
			<td>New England Biotechnologies</td>
			<td>B0269S</td>
			<td>Vortex periodically until aggregate dissolves</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lambda DNA</td>
			<td>New England Biotechnologies</td>
			<td>N3011S</td>
			<td>Heated to 50C and quenched on ice prior to dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Randomized MDA oligos</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td></td>
			<td>5&#39;-NNNNN*N-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR primers</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td></td>
			<td>5&#8217;-CGGCAAACGGGAATGAAACGCC-3&#8217; and 5&#8217;-TGCGGCAAAGACAGCAACGG-3&#8217;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure Nuclease-free water</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10977-015</td>
			<td>UV-treated for 30m in Stratalinker 2400 before use (optional)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ROX reference dye</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12223-012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR optical strip caps</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>4323032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR tubes</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>401428</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP (25uM each)</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>200415</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermocycler - Mx3000P qPCR system</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>401403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Barrier pipette tips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89003-046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-rad oil for evagreen</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>186-4005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JumpStart Taq ReadyMix</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P2893-100RXN</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

simple bulk readout of digital nucleic acid quantification assays

Ensaios digitais são poderosos métodos que permitem a detecção de células raras e contagem de moléculas de ácido nucleico individuais. No entanto, ensaios digitais ainda não são rotineiramente aplicados, devido ao custo e equipamento específico associado com métodos comercialmente disponíveis. Aqui apresentamos um método simplificado de leitura dos ensaios de gotículas digitais usando um real-time PCR convencional instrumento para medir a fluorescência maior parte dos ensaios digitais baseadas em gotículas. Nós caracterizar o desempenho do ensaio de leitura, utilizando misturas de grandes quantidades de gotículas de síntese e amplificação por deslocamento de um múltiplo (MDA) ensaio digitais gotícula. Quantitativa MDA particular beneficia de uma reação formato digital, mas o nosso novo método se aplica a qualquer ensaio digital. Para estabelecidos protocolos de ensaio digitais, tais como PCR digital, este método serve para acelerar e simplificar ensaio de leitura. Nossa metodologia de grandes quantidades de leitura traz as vantagens de partitioned ensaios sem a necessidade de uma instrumentação especializada leitura. As principais limitações da metodologia de leitura em massa são reduzidos alcance dinâmico em comparação com plataformas de gotículas de contagem e a necessidade de uma amostra padrão, embora os requisitos para este padrão são menos exigentes do que para uma experiência em tempo real convencional. Quantitativa genoma inteiro de amplificação (WGA) é usado para testar contaminantes em reacções WGA e é a forma mais sensível para detectar a presença de fragmentos de ADN com sequências desconhecidas, dando ao método uma grande promessa em diversas áreas de aplicação farmacêutica incluindo o controlo de qualidade e astrobiology.

Embora as leituras granel convencional / em tempo real pode ser utilizado para ambos os ensaios de PCR quantitativa e quantitativa WGA (Figura 1), ensaios quantitativos digitais proporcionam vantagens (Tabela 1). No método descrito, podemos ler a ensaios digitais em formato de micro-gota com uma medição de ponto final a granel simples (Figura 2). Enquanto este método é amplamente aplicável, nos concentramos em WGA quantitativa (MDA), pois este método apresenta desafios especiais para os ensaios em tempo real convencionais. Para verificar se o instrumento em tempo real de PCR pode detectar diferentes fracções de microgotículas fluorescentes dispersas em óleo, que mediu a fluorescência de grandes quantidades de misturas sintéticas de fluorescentes e não fluorescentes gotas (Figura 2). A fluorescência granel e contagens de gotículas positivos (avaliada de forma independente por microscopia de fluorescência) dimensionar linearmente com a fração de entrada de gotículas fluorescentes como esperado (Figura 3A). O experimento foi realizado três vezes, com a formação de gotículas independente e de mistura para cada conjunto. Para avaliar o desempenho quantificação teórico para amostras &quot;desconhecidas&quot;, estabelecemos curvas padrão lineares usando amostras de controlo inteiramente positivos e negativos inteiramente. Com tais curvas padrão gota-específicos do lote, nós calculamos a fração de misturas de gotículas positivos e negativos sintéticos baseados em fluorescência em massa de cada amostra. Os resultados mostram um bom desempenho em relação gota quantificação através de dois registros de faixa dinâmica (R 2 = 0,984; Figura 3B). A concentração do analito de entrada é facilmente calculado a partir da fracção de gotas de 38 positivos ou negativos. Para testar nosso método em um ensaio quantitativo verdadeira WGA, medimos níveis de fluorescência e fração de gotículas positivos de um ensaio MDA gotícula digital com DNA Lambda através de uma wi<html> de gama de concentrações (Figura 4). Na Figura 4B, as imagens fluorescentes representativos de as gotículas são mostrados. Ambos fluorescência granel e fracção positiva das gotículas a partir de amostras digitais de MDA escalar como esperado com o modelo de medio por gota, o que indica que a leitura de grandes quantidades pode capturar fielmente o resultado de um ensaio digitais (R 2 = 0,927). Repetimos o experimento para cada concentração, formando gotas independente e realização WGA para cada repetição. <img alt="tabela 1" src="/files/ftp_upload/52925/52925table1.jpg" /> Tabela 1. Resumo do real-time e ensaios digitais. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52925/52925table1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> able2.jpg &quot;/&gt; Tabela 2. Resumo dos métodos existentes para quantificar os ácidos nucleicos. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52925/52925table2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/52925/52925fig1.jpg" /> Figura 1.-PCR em tempo real quantitativo e MDA de Lambda DNA. MDA não é discretizado através de ciclos de temperatura de PCR, como, e é sujeito a pré-amplificação não se preparado cuidadosamente em gelo. Aqui, PCR quantitativo e MDA foram realizados com concentrações crescentes de DNA Lambda. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52925/52925fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52925/52925fig2.jpg" /> Figure 2. Esquema de leitura analógica de gotículas e imagens representativas. (A) gotículas positivos e negativos foram gerados a partir de reagentes fluorescentes e não fluorescentes em um dispositivo de microfluidos. As gotículas foram pré-misturadas em diferentes positivos: rácios negativo. Níveis de fluorescência foram medidos em massa com um termociclador em tempo real normal, e a fracção de gotas de positivos foi determinada por microscopia de fluorescência. (B) fluorescente Representante sobreposto imagens de aumentar os rácios de gotículas positivos (barra de escala = 200 m). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52925/52925fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52925/52925fig3.jpg" /> Figura 3. massa de fluorescência e fracção fluorescente de combinações de drople positivo e negativo preparado separadamentets. (A) fluorescente (positivo) e não-fluorescente gotículas (negativos) foram pré-misturadas em diferentes proporções. Comparação da fracção de entrada de gotículas de positivos, com a maior parte da fluorescência medido e medido fracção gota positivo (n = 3, barras representam +/- DP). A linha a tracejado representa a fracção fluorescente esperado dado uma relação linear. (B) Comparação de rácios previsto com base em padrões de entrada para a fracção fluorescente esperado. A linha indica o valor esperado dado uma relação linear. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52925/52925fig3large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/52925/52925fig4.jpg" /> Figura 4. massa de fluorescência e fracção fluorescente de um ensaio de MDA digital de gotícula. Digital MDA foi realizada com increasing concentrações de modelo Lambda DNA (n = 3, barras de erro representam DP) e medido como descrito na Figura 2A. A linha indica a fracção fluorescente esperado utilizando a distribuição de Poisson para modelar os dados do nosso experimento. b) fluorescente Representante sobreposto imagens de gotas após a inativação de reação (barra de escala = 200 mm) para aumentar a moléculas de DNA Lambda esperados por gota (NTC, 0,005, 0,05, 0,5 e 10). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52925/52925fig4large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura .</a>

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Simple Bulk Readout of Digital Nucleic Acid Quantification Assays

We describe an endpoint digital assay for quantifying nucleic acids with a simplified (analog) readout. We measure bulk fluorescence of droplet-based digital assays using a standard qPCR machine rather than specialized instrumentation and confirm our results by microscopy.

Simples massa de Leitura Digital de Ácido Nucleico Quantificação Assays

Digital assays are powerful methods that enable detection of rare cells and counting of individual nucleic acid molecules. However, digital assays are ...

simple-bulk-readout-of-digital-nucleic-acid-quantification-assays

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

8.2K visualizações.  Broad Institute. We describe an endpoint digital assay for quantifying nucleic acids with a simplified (analog) readout. We measure bulk fluorescence of droplet-based digital assays using a standard qPCR machine rather than specialized instrumentation and confirm our results by microscopy. 

Vídeo: Simple Bulk Readout of Digital Nucleic Acid Quantification Assays

NanoDrop Microvolume Quantitation of Nucleic Acids

Biomolecular assays are continually being developed that use progressively smaller amounts of material, often precluding the use of conventional cuvette-based instruments for nucleic acid quantitation for those that can perform microvolume quantitation.
The NanoDrop microvolume sample retention system (Thermo Scientific NanoDrop Products) functions by combining fiber optic technology and natural surface tension properties to capture and retain minute amounts of sample independent of traditional containment apparatus such as cuvettes or capillaries. Furthermore, the system employs shorter path lengths, which result in a broad range of nucleic acid concentration measurements, essentially eliminating the need to perform dilutions. Reducing the volume of sample required for spectroscopic analysis also facilitates the inclusion of additional quality control steps throughout many molecular workflows, increasing efficiency and ultimately leading to greater confidence in downstream results.
The need for high-sensitivity fluorescent analysis of limited mass has also emerged with recent experimental advances. Using the same microvolume sample retention technology, fluorescent measurements may be performed with 2 &mu;L of material, allowing fluorescent assays volume requirements to be significantly reduced. Such microreactions of 10 &mu;L or less are now possible using a dedicated microvolume fluorospectrometer.
Two microvolume nucleic acid quantitation protocols will be demonstrated that use integrated sample retention systems as practical alternatives to traditional cuvette-based protocols. First, a direct A260 absorbance method using a microvolume spectrophotometer is described. This is followed by a demonstration of a fluorescence-based method that enables reduced-volume fluorescence reactions with a microvolume fluorospectrometer. These novel techniques enable the assessment of nucleic acid concentrations ranging from 1 pg/ &mu;L to 15,000 ng/ &mu;L with minimal consumption of sample.

The use of NanoDrop microvolume systems as practical and efficient alternatives to traditional nucleic acid quantitation methodology is described through the demonstration of two microvolume nucleic acid quantitation protocols.

NanoDrop quantificação Microvolume de Ácidos Nucléicos

Biomolecular assays are continually being developed that use progressively smaller amounts of material, often precluding the use of conventional ...

Biologia

Electricity-Free, Sequential Nucleic Acid and Protein Isolation

Traditional and emerging pathogens such as Enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC), Yersinia pestis, or prion-based diseases are of significant concern for governments, industries and medical professionals worldwide. For example, EHECs, combined with Shigella, are responsible for the deaths of approximately 325,000 children each year and are particularly prevalent in the developing world where laboratory-based identification, common in the United States, is unavailable 1. The development and distribution of low cost, field-based, point-of-care tools to aid in the rapid identification and/or diagnosis of pathogens or disease markers could dramatically alter disease progression and patient prognosis. We have developed a tool to isolate nucleic acids and proteins from a sample by solid-phase extraction (SPE) without electricity or associated laboratory equipment 2. The isolated macromolecules can be used for diagnosis either in a forward lab or using field-based point-of-care platforms. Importantly, this method provides for the direct comparison of nucleic acid and protein data from an un-split sample, offering a confidence through corroboration of genomic and proteomic analysis.
Our isolation tool utilizes the industry standard for solid-phase nucleic acid isolation, the BOOM technology, which isolates nucleic acids from a chaotropic salt solution, usually guanidine isothiocyanate, through binding to silica-based particles or filters 3. CUBRC's proprietary solid-phase extraction chemistry is used to purify protein from chaotropic salt solutions, in this case, from the waste or flow-thru following nucleic acid isolation4.
By packaging well-characterized chemistries into a small, inexpensive and simple platform, we have generated a portable system for nucleic acid and protein extraction that can be performed under a variety of conditions. The isolated nucleic acids are stable and can be transported to a position where power is available for PCR amplification while the protein content can immediately be analyzed by hand held or other immunological-based assays. The rapid identification of disease markers in the field could significantly alter the patient's outcome by directing the proper course of treatment at an earlier stage of disease progression. The tool and method described are suitable for use with virtually any infectious agent and offer the user the redundancy of multi-macromolecule type analyses while simultaneously reducing their logistical burden.

A tool and chemistries are described to sequentially isolate nucleic acids followed by proteins from a sample without the need for electricity. The tool consists of a sorbent held within a transfer pipette while the isolation chemistries are based on solid-phase extraction principles. The isolated macromolecules can be analyzed by immuno-based and PCR-based assays.

Electricidade-Free, Ácido Nucleico seqüencial e isolamento de proteínas

Traditional and emerging pathogens such as Enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC), Yersinia pestis, or prion-based diseases are of significant concern ...

Analyzing and Building Nucleic Acid Structures with 3DNA

The 3DNA software package is a popular and versatile bioinformatics tool with capabilities to analyze, construct, and visualize three-dimensional nucleic acid structures. This article presents detailed protocols for a subset of new and popular features available in 3DNA, applicable to both individual structures and ensembles of related structures. Protocol 1 lists the set of instructions needed to download and install the software. This is followed, in Protocol 2, by the analysis of a nucleic acid structure, including the assignment of base pairs and the determination of rigid-body parameters that describe the structure and, in Protocol 3, by a description of the reconstruction of an atomic model of a structure from its rigid-body parameters. The most recent version of 3DNA, version 2.1, has new features for the analysis and manipulation of ensembles of structures, such as those deduced from nuclear magnetic resonance (NMR) measurements and molecular dynamic (MD) simulations; these features are presented in Protocols 4 and 5. In addition to the 3DNA stand-alone software package, the w3DNA web server, located at <a href="http://w3dna.rutgers.edu" target="_blank">http://w3dna.rutgers.edu</a>, provides a user-friendly interface to selected features of the software. Protocol 6 demonstrates a novel feature of the site for building models of long DNA molecules decorated with bound proteins at user-specified locations.

The 3DNA software package is a popular and versatile bioinformatics tool with capabilities to analyze, construct, and visualize three-dimensional nucleic acid structures. This article presents detailed protocols for a subset of new and popular features available in 3DNA, applicable to both individual structures and ensembles of related structures.

Análise e construção de estruturas de Ácido Nucleico com 3DNA

The 3DNA software package is a popular and versatile bioinformatics tool with capabilities to analyze, construct, and visualize three-dimensional nucleic ...

FtsZ Polymerization Assays: Simple Protocols and Considerations

During bacterial cell division, the essential protein FtsZ assembles in the middle of the cell to form the so-called Z-ring. FtsZ polymerizes into long filaments in the presence of GTP in vitro, and polymerization is regulated by several accessory proteins. FtsZ polymerization has been extensively studied in vitro using basic methods including light scattering, sedimentation, GTP hydrolysis assays and electron microscopy. Buffer conditions influence both the polymerization properties of FtsZ, and the ability of FtsZ to interact with regulatory proteins. Here, we describe protocols for FtsZ polymerization studies and validate conditions and controls using Escherichia coli and Bacillus subtilis FtsZ as model proteins. A low speed sedimentation assay is introduced that allows the study of the interaction of FtsZ with proteins that bundle or tubulate FtsZ polymers. An improved GTPase assay protocol is described that allows testing of GTP hydrolysis over time using various conditions in a 96-well plate setup, with standardized incubation times that abolish variation in color development in the phosphate detection reaction. The preparation of samples for light scattering studies and electron microscopy is described. Several buffers are used to establish suitable buffer pH and salt concentration for FtsZ polymerization studies. A high concentration of KCl is the best for most of the experiments. Our methods provide a starting point for the in vitro characterization of FtsZ, not only from E. coli and B. subtilis but from any other bacterium. As such, the methods can be used for studies of the interaction of FtsZ with regulatory proteins or the testing of antibacterial drugs which may affect FtsZ polymerization.

Polymerization of FtsZ is essential for bacterial cell division. In this report, we detail simple protocols to monitor FtsZ polymerization activity and discuss the influence of buffer composition. The protocols can be used to study the interaction of FtsZ with regulatory proteins or antibacterial drugs that affect FtsZ polymerization.

FtsZ Polimerização Ensaios: protocolos simples e Considerações

During bacterial cell division, the essential protein FtsZ assembles in the middle of the cell to form the so-called Z-ring. FtsZ polymerizes into long ...

Preparation, Imaging, and Quantification of Bacterial Surface Motility Assays

Bacterial surface motility, such as swarming, is commonly examined in the laboratory using plate assays that necessitate specific concentrations of agar and sometimes inclusion of specific nutrients in the growth medium. The preparation of such explicit media and surface growth conditions serves to provide the favorable conditions that allow not just bacterial growth but coordinated motility of bacteria over these surfaces within thin liquid films. Reproducibility of swarm plate and other surface motility plate assays can be a major challenge. Especially for more &#8220;temperate swarmers&#8221; that exhibit motility only within agar ranges of 0.4%-0.8% (wt/vol), minor changes in protocol or laboratory environment can greatly influence swarm assay results. &#8220;Wettability&#8221;, or water content at the liquid-solid-air interface of these plate assays, is often a key variable to be controlled. An additional challenge in assessing swarming is how to quantify observed differences between any two (or more) experiments. Here we detail a versatile two-phase protocol to prepare and image swarm assays. We include guidelines to circumvent the challenges commonly associated with swarm assay media preparation and quantification of data from these assays. We specifically demonstrate our method using bacteria that express fluorescent or bioluminescent genetic reporters like green fluorescent protein (GFP), luciferase (lux operon), or cellular stains to enable time-lapse optical imaging. We further demonstrate the ability of our method to track competing swarming species in the same experiment.

Swarming motility is influenced by physical and environmental factors. We describe a two-phase protocol and guidelines to circumvent the challenges commonly associated with swarm assay preparation and data collection. A macroscopic imaging technique is employed to obtain detailed information on swarm behavior that is not provided by current analysis techniques.

Preparação, Imaging, e quantificação de Motilidade Ensaios superfície da bactéria

Bacterial surface motility, such as swarming, is commonly examined in the laboratory using plate assays that necessitate specific concentrations of agar ...

Efficient Nucleic Acid Extraction and 16S rRNA Gene Sequencing for Bacterial Community Characterization

There is a growing appreciation for the role of microbial communities as critical modulators of human health and disease. High throughput sequencing technologies have allowed for the rapid and efficient characterization of bacterial communities using 16S rRNA gene sequencing from a variety of sources. Although readily available tools for 16S rRNA sequence analysis have standardized computational workflows, sample processing for DNA extraction remains a continued source of variability across studies. Here we describe an efficient, robust, and cost effective method for extracting nucleic acid from swabs. We also delineate downstream methods for 16S rRNA gene sequencing, including generation of sequencing libraries, data quality control, and sequence analysis. The workflow can accommodate multiple samples types, including stool and swabs collected from a variety of anatomical locations and host species. Additionally, recovered DNA and RNA can be separated and used for other applications, including whole genome sequencing or RNA-seq. The method described allows for a common processing approach for multiple sample types and accommodates downstream analysis of genomic, metagenomic and transcriptional information.

We describe an efficient, robust, and cost effective method for extracting nucleic acid from swabs for characterization of bacterial communities using 16S rRNA gene amplicon sequencing. The method allows for a common processing approach for multiple sample types and accommodates a number of downstream analytic processes.

Eficiente de Ácido Nucleico Extração e sequenciamento genético 16S rRNA para Bacteriana Comunidade Caracterização

There is a growing appreciation for the role of microbial communities as critical modulators of human health and disease. High throughput sequencing ...

Filtration Isolation of Nucleic Acids:  A Simple and Rapid DNA Extraction Method

FINA, filtration isolation of nucleic acids, is a novel extraction method which utilizes vertical filtration via a separation membrane and absorbent pad to extract cellular DNA from whole blood in less than 2 min. The blood specimen is treated with detergent, mixed briefly and applied by pipet to the separation membrane. The lysate wicks into the blotting pad due to capillary action, capturing the genomic DNA on the surface of the separation membrane. The extracted DNA is retained on the membrane during a simple wash step wherein PCR inhibitors are wicked into the absorbent blotting pad. The membrane containing the entrapped DNA is then added to the PCR reaction without further purification. This simple method does not require laboratory equipment and can be easily implemented with inexpensive laboratory supplies. Here we describe a protocol for highly sensitive detection and quantitation of HIV-1 proviral DNA from 100 &#181;l whole blood as a model for early infant diagnosis of HIV that could readily be adapted to other genetic targets.

We describe here a simple and rapid paper-based DNA extraction method of HIV proviral DNA from whole blood detected by quantitative PCR. This protocol can be extended for use in detecting other genetic markers or using alternative amplification methods.

Isolamento de filtração de Ácidos Nucleicos: Um Método de extracção de DNA simples e rápido

FINA, filtration isolation of nucleic acids, is a novel extraction method which utilizes vertical filtration via a separation membrane and absorbent pad ...

The Lactate Dehydrogenase Sequestration Assay &#8212; A Simple and Reliable Method to Determine Bulk Autophagic Sequestration Activity in Mammalian Cells

Bulk autophagy is characterized by the sequestration of large portions of cytoplasm into double/multi-membrane structures termed autophagosomes. Here a simple protocol to monitor this process is described. Moreover, typical results and experimental validation of the method under autophagy-inducing conditions in various types of cultured mammalian cells are provided. During bulk autophagy, autophagosomes sequester cytosol, and thereby also soluble cytosolic proteins, alongside other autophagic cargo. LDH is a stable and highly abundant, soluble cytosolic enzyme that is non-selectively sequestered into autophagosomes. The amount of LDH sequestration therefore reflects the amount of bulk autophagic sequestration. To efficiently and accurately determine LDH sequestration in cells, we employ an electrodisruption-based fractionation protocol that effectively separates sedimentable from cytosolic LDH, followed by measurement of enzymatic activity in sedimentable fractions versus whole-cell samples. Autophagic sequestration is determined by subtracting the proportion of sedimentable LDH in untreated cells from that in treated cells. The advantage of the LDH sequestration assay is that it gives a quantitative measure of the autophagic sequestration of endogenous cargo, as opposed to other methods that either involve ectopic expression of sequestration probes or semi-quantitative protease protection analyses of autophagy markers or receptors.

Here a simple and well-validated protocol for measuring bulk autophagic sequestration activity in mammalian cells is described. The method is based on quantifying the proportion of lactate dehydrogenase (LDH) in sedimentable cell fractions compared to total cellular LDH levels.

O ensaio de sequestro de lactato desidrogenase — Um método simples e confiável para determinar a atividade de Autophagic de sequestro em massa em células de mamíferos

Bulk autophagy is characterized by the sequestration of large portions of cytoplasm into double/multi-membrane structures termed autophagosomes. Here a ...

Planarian Scrunching as a Quantitative Behavioral Readout for Noxious Stimuli Sensing

Freshwater planarians normally glide smoothly through ciliary propulsion on their ventral side. Certain environmental conditions, however, can induce musculature-driven forms of locomotion: peristalsis or scrunching. While peristalsis results from a ciliary defect, scrunching is independent of cilia function and is a specific response to certain stimuli, including amputation, noxious temperature, extreme pH, and ethanol. Thus, these two musculature-driven gaits are mechanistically distinct. However, they can be difficult to distinguish qualitatively. Here, we provide a protocol for inducing scrunching using various physical and chemical stimuli. We detail the quantitative characterization of scrunching, which can be used to distinguish it from peristalsis and gliding, using freely available software. Since scrunching is a universal planarian gait, albeit with characteristic species-specific differences, this protocol can be broadly applied to all species of planarians, when using appropriate considerations. To demonstrate this, we compare the response of the two most popular planarian species used in behavioral research, Dugesia japonica and Schmidtea mediterranea, to the same set of physical and chemical stimuli. Furthermore, the specificity of scrunching allows this protocol to be used in conjunction with RNA interference and/or pharmacological exposure to dissect the molecular targets and neuronal circuits involved, potentially providing mechanistic insight into important aspects of nociception and neuromuscular communication.

Freshwater planarians exhibit three gaits (gliding, peristalsis, and scrunching) that are distinguishable by quantitative behavioral analysis. We describe a method to induce scrunching using various noxious stimuli, quantification thereof, and distinction from peristalsis and gliding. Using gene knockdown, we demonstrate the specificity of scrunching as a quantitative phenotypic readout.

Planarian Scrunching como uma leitura comportamental quantitativa para sensoriamento de estímulos nocivos

Freshwater planarians normally glide smoothly through ciliary propulsion on their ventral side. Certain environmental conditions, however, can induce ...

Two-Step Reverse Transcription Droplet Digital PCR Protocols for SARS-CoV-2 Detection and Quantification

Diagnosis of the ongoing SARS-CoV-2 pandemic is a priority for all countries across the globe. Currently, reverse transcription quantitative PCR (RT-qPCR) is the gold standard for SARS-CoV-2 diagnosis as no permanent solution is available. However effective this technique may be, research has emerged showing its limitations in detection and diagnosis especially when it comes to low abundant targets. In contrast, droplet digital PCR (ddPCR), a recent emerging technology with superior advantages over qPCR, has been shown to overcome the challenges of RT-qPCR in diagnosis of SARS-CoV-2 from low abundant target samples. Prospectively, in this article, the capabilities of RT-ddPCR are further expanded by showing steps on how to develop simplex, duplex, triplex probe mix, and quadruplex assays using a two-color detection system. Using primers and probes targeting specific sites of the SARS-CoV-2 genome (N, ORF1ab, RPP30, and RBD2), the development of these assays is shown to be possible. Additionally, step by step detailed protocols, notes, and suggestions on how to improve the assays workflow and analyze data are provided. Adapting this workflow in future works will ensure that the maximum number of targets can be sensitively detected in a small sample significantly improving on cost and sample throughput.

This work summarizes steps on developing different assays for SARS-CoV-2 detection using a two color ddPCR system. The steps are elaborate and notes have been included on how to improve the assays and experiment performance. These assays may be used for multiple SARS-CoV-2 RT-ddPCR applications.

Protocolos digitais de PCR digital de gotícula de transcrição reversa em duas etapas para detecção e quantificação de SARS-CoV-2

Diagnosis of the ongoing SARS-CoV-2 pandemic is a priority for all countries across the globe. Currently, reverse transcription quantitative PCR (RT-qPCR) ...