Agradecemos o Dr. Claire Davis e Dr. Miron Veronique (a rainha Instituto de investigação médica, Edimburgo, Kingdome Unidos) pela ajuda inicial e discussões sobre a abordagem experimental, a estrutura de classificação de células e a citometria de fluxo QMRI. Este trabalho foi apoiado por um Cancer Research UK carreira estabelecimento Award para Dr. Dirk Sieger.

1. amostra e preparação de meios de comunicação
<ol><li>Prepare o suporte de embrião (E3) pela dissolução de 6,4 mM KCl, 0,22 mM NaCl, 0,33 mM CaCl2 2 H2O, 0,33 mM MgSO4 7 H2O em H2O.</li>
	<li>Colete embriões zebrafish imediatamente após a fertilização (0 dpf).<ol>
<li>Dividi o zebrafish embriões em 50 por prato de petri de 90 mm. Criar embriões a 28,5 ° C em 50 mL de meio de embrião (E3) tratado com 200 µM 1-fenil-2-tioureia (PTU), do final do primeiro dia do desenvolvimento (0 dpf) para a duração do experimento para inibir a pigmentação.</li>
		<li>Muda o E3 + médio PTU diariamente para a duração do experimento.</li>
		<li>Tela mpeg1:eGFP e larvas de NBT:DsRed no dpf 2 usando um microscópio fluorescente para a expressão do transgene positivo, macrófagos GFP+ /microglia e DsRed+ neurônios.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparem-se todos os meios no dia anterior o experimento sob uma capa de cultura de tecidos para evitar a contaminação e, em seguida, armazene-os em 4 ° C.<ol>
<li>Preparar a mídia A dissolvendo Hepes de 15 mM e 25 mM D-glicose em HBSS 1 x.</li>
		<li>Prepare o médio gradiente de densidade (100%) misturando 9 volumes do meio de gradiente de densidade de 1 volume de HBSS 10 x.</li>
		<li>Prepare o suporte de gradiente de densidade (22%) diluindo 22 mL de meio de gradiente de densidade (100%) em 88 mL de DPBS 1 x.</li>
		<li>Preparar DPBS 1 x.</li>
		<li>Prepare E3 médio + tricaina misturando E3 médio com 450 μM tricaina.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. homogeneização
Nota: Todas as etapas são realizadas 4 ° C.
<ol><li>Adicione 1,5 mL metanosulfonato (15 mM) de 90 mm placas de Petri contendo 50 larvas em 50 mL de meio de embrião E3 tratado com 200 µM PTU para anestesia terminal.<ol>
<li>Puxa-saco 10 larvas anestesiadas desde os pratos de petri com uma mL 3 pipetas de plástico grosso.</li>
		<li>Larvas de transferência anestesiada 10 por 10 em uma placa de Petri 55mm repleto de gelada médio de embrião de E3 + tricaina.</li>
		<li>Sob um estereomicroscópio, alinhe 10 larvas no centro da caixa de Petri. Então transecto larvas cabeças acima o saco vitelino-usando microtesoura cirúrgica (excluir a bexiga natatória para evitar flutuação cabeças).</li>
		<li>Puxa-saco cabeças desde os pratos de petri com uma mL 3 pipetas de plástico grosso. Espere até que todas as cabeças se reúnem dentro a ponta da pipeta e em seguida, transferi-los para um homogeneizador de vidro contendo 1 mL gelada Media A (transferência em um volume mínimo para reduzir a mídia uma diluição por E3 + tricaina). Manter o homogenizador de vidro no gelo. Use um homogeneizador por condição experimental.</li>
		<li>Substituir cada pequeno prato de petri contendo gelo frio E3 + tricaina com um novo cada 30 min para assegurar essa transecção é executada no frio E3 + tricaina médio.</li>
		<li>Substitua o gelado A mídia no homogenizador de vidro quando a cor começa a desvanecer-se. Nota: Diluição de A mídia pode alterar o tecido cabeça devido a mudanças de temperatura.</li>
		<li>Uma vez que todos os chefes foram coletados (600 cabeças/condição), remover o volume máximo da mídia A partir do homogenizador de vidro e substituí-lo com 1 mL da gelada fresco Media.</li>
		<li>Perturbar o tecido do cérebro com um homogeneizador de vidro apertado no gelo. Execute 40 rodadas de esmagamento e voltas para larvas de dpf de 3-5 e 50 para larvas de dpf 7 e 8.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Adicionar 2 mL da mídia à suspensão de células (1 mL A de mídia / 200 cabeças), que irá diluir as células e reduzir sua aglomeração com mielina para facilitar sua separação durante a centrifugação em gradiente médio de densidade.<ol>
<li>Para eliminar a aglomeração de célula, execute a suspensão de células através de um filtro de célula de 40 µm colocado em cima de um tubo de Falcão frio 50ml mantido no gelo. Repita esta operação 3 vezes.</li>
		<li>Transferir 1 mL da suspensão de células para tubos de frio 1,5 mL e girá-los a 300 g por 10 min a 4 ° C.</li>
		<li>Remover o sobrenadante utilizando uma seringa de 10 mL + agulha 23 x 1 '.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ressuspender o centrifugado com 1 mL de meio de gradiente gelada 22% densidade levemente sobreposto por 0,5 mL de DPBS gelada 1 x (do não mistura-los, uma interfase entre ambas as soluções serão vistos).<ol>
<li>Girar os tubos em 950 g sem freio e aceleração lenta por 30 min a 4 ° C. Nota: Este passo separa a mielina de outras células pelo sequestro de no período do intérfase de DPBS 1 x e 22% médio gradiente de densidade, Considerando que células serão sedimento no fundo do tubo. Remoção de mielina é mais eficiente quando a concentração de célula não é muito alta.</li>
		<li>Usando uma seringa de 10 mL + agulha 23 x 1 ' descartar o máximo de DPBS, médio gradiente de densidade e mielina preso na sua interfase.</li>
		<li>Lavam-se células com 0,5 mL da mídia A + 2% de soro de cabra normal (NGS) e, em seguida, girar tubos a 300 g por 10 min a 4 ° C.</li>
		<li>Descartar o máximo do líquido sobrenadante e, em seguida, juntar todos os chumbos de célula da mesma condição experimental junto em 1 mL de mídia A + 2% NGS.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Se as células de interesse expressam uma proteína fluorescente como macrófagos/microglia de mpeg1:eGFP ou neurônios de NBT:DsRed peixe transgénicos (screening de peixe transgénicos ver 1.1.3), executar a suspensão de células através de um filtro de célula de 35 µm cap e transferi-los para uma tubos de frio 5 mL FACS no gelo, protegidos da luz. Nota: Alternativamente, a imuno-coloração da microglia pode ser executada.</li>
</ol>3. Microglia Immuno-coloração
Nota: Todas as etapas são executadas a 4 ° C.
<ol><li>Ressuspender o centrifugado com 0,3 mL de mídia A + 2% NGS. Dividi-los em tubos de 3 x 1.5 mL: um para células imaculadas medir a autofluorescência de células de interesse, em segundo lugar para o anticorpo secundário (1/200) medir a ligação não-específica do anticorpo secundário para microglia e, terceiro, como um teste (4 4 mouse monoclonal anticorpo (microglia específico) (1/20) + (1/200) de anticorpo secundário).<ol>
<li>Adicione baixa endotoxina, livre de azida sódica (folha) em 1% para as células (todos os tubos) para bloquear CD16/CD32 interações com o domínio do Fc de imunoglobulinas. Incube as células por 10 min com agitação suave cada 5 min.</li>
		<li>Adicionar 4 a 4 anticorpo (1/20) para as células (tubo 3) e incube por 30 min com agitação suave a cada 10 min.</li>
		<li>Girar os tubos a 300 g por 10 min a 4 ° C e, em seguida, descartar o sobrenadante.</li>
		<li>Lave uma vez com 0,5 mL da mídia A + 2% NGS, então girar tubos a 300 g por 10 min a 4 ° C.</li>
		<li>Ressuspender o centrifugado com 0,5 ml de mídia A + 2% NGS e incubar as células com folha em 1% por 10 min com agitação suave cada 5 min.</li>
		<li>Adicione o anticorpo secundário (1/200) para as células (tubo 2 e 3). Incube as células por 30 min com agitação suave cada 10 min e protecção leve.</li>
		<li>Girar os tubos a 300 g por 10 min a 4 ° C e, em seguida, descartar o sobrenadante.</li>
		<li>Lave duas vezes com 0,5 mL de mídia A + 2% NGS, então a re-suspender centrifugado com 1 mL de mídia A + 2% NGS.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Executar a suspensão de células através de uma tampa de filtro de célula µm 35 e transferi-los para tubos de 5ml frio FACS no gelo, protegido da luz.</li>
</ol>4. célula de triagem (FACS)
Nota: Executar todas as etapas, a 4 ° C.
<ol><li>Classificar os neurônios, macrófagos/microglia e microglia usando um FACS. Nota: Esta etapa é geralmente realizada por um membro do pessoal da instalação de FACS e configurações dependem do tipo de equipamento utilizado.<ol>
<li>Adicione DAPI em uma concentração de 1 µ g/mL em cada tubo de FACS para rotular as células mortas.</li>
		<li>Configurar o FACS e tipo de neurônios, macrófagos/microglia ou microglia de todas as células do cérebro. Separar células de detritos em função do seu tamanho e granulosidade e, em seguida, single-células por dispersão para a frente e dispersão do lado da porta. Exclua células mortas por DAPI rotulagem de células vivas. Identifica os neurônios, macrófagos/microglia ou microglia por seus respectivos coloração positiva.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Recolher pilhas em tubos de 1,5 mL contendo 1 mL de gelado A mídia + 2% NGS em gelo. Use tubos diferentes para cada tipo de célula.<ol>
<li>Girar os tubos a 300 g por 10 min a 4 ° C e em seguida, descartar o sobrenadante.</li>
		<li>Lave uma vez com 0,5 mL de mídia A então descartar o sobrenadante no máximo.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. extração do RNA
<ol><li>Extraia o RNA dos diferentes tipos de células separados por FACS. Para a extração de RNA usar um kit específico e siga as orientações do fabricante. Certifique-se para trabalhar em um ambiente livre de RNase por pipetas com um produto de descontaminação de RNase e limpeza do espaço de trabalho e usar filtro dicas.<ol>
<li>Recentemente Prepare-se 1 mL de tampão de Lise suplementado com 50 µM β-Mercaptoetanol. Nota: Aqui, β-Mercaptoetanol é adicionado para reduzir a degradação de RNA.</li>
		<li>Prepare a solução de etanol 70% e 80% usando RNase água livre.</li>
		<li>Lyse pilhas com 75 µ l de tampão de Lise suplementado com 50 µM β-Mercaptoetanol. Em seguida, use uma máquina trituradora para melhorar o rompimento da pilha.</li>
		<li>Continue manual de extração de RNA de acordo com o fabricante.</li>
		<li>No final do protocolo, Eluir o RNA com 14 µ l de água livre de RNase para obter uma concentração suficiente de RNA.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Chrast, R., Scott, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Mouse+Brain+Transcriptome+by+SAGE:+Differences+in+Gene+Expression+between+P30+Brains+of+the+Partial+Trisomy+16+Mouse+Model+of+Down+Syndrome+(Ts65Dn)+and+Normals.">The Mouse Brain Transcriptome by SAGE: Differences in Gene Expression between P30 Brains of the Partial Trisomy 16 Mouse Model of Down Syndrome (Ts65Dn) and Normals.</a> Genome Research. 10 (12), 2006-2021 (2000).</li><li>Beis, D., Stainier, D. Y. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+cell+biology:+following+the+zebrafish+trend.">In vivo cell biology: following the zebrafish trend.</a> Trends in Cell Biology. 16 (2), 105-112 (2006).</li><li>Shiau, C. E., Kaufman, Z., Meireles, A. M., Talbot, W. 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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mpeg1+promoter+transgenes+direct+macrophage-lineage+expression+in+zebrafish.">mpeg1 promoter transgenes direct macrophage-lineage expression in zebrafish.</a> Blood. 117 (4), 49-56 (2011).</li><li>Peri, F., N&#252;sslein-Volhard, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+Imaging+of+Neuronal+Degradation+by+Microglia+Reveals+a+Role+for+v0-ATPase+a1+in+Phagosomal+Fusion+In+Vivo.">Live Imaging of Neuronal Degradation by Microglia Reveals a Role for v0-ATPase a1 in Phagosomal Fusion In Vivo.</a> Cell. 133 (5), 916-927 (2008).</li><li>Sieger, D., Moritz, C., Ziegenhals, T., Prykhozhij, S., Peri, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-range+Ca2++waves+transmit+brain-damage+signals+to+microglia.">Long-range Ca2+ waves transmit brain-damage signals to microglia.</a> Developmental cell. 22 (6), 1138-1148 (2012).</li><li>Becker, T., Becker, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regenerating+descending+axons+preferentially+reroute+to+the+gray+matter+in+the+presence+of+a+general+macrophage/microglial+reaction+caudal+to+a+spinal+transection+in+adult+zebrafish.">Regenerating descending axons preferentially reroute to the gray matter in the presence of a general macrophage/microglial reaction caudal to a spinal transection in adult zebrafish.</a> The Journal of comparative neurology. 433 (1), 131-147 (2001).</li><li>Ohnmacht, J., Yang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spinal+motor+neurons+are+regenerated+after+mechanical+lesion+and+genetic+ablation+in+larval+zebrafish.">Spinal motor neurons are regenerated after mechanical lesion and genetic ablation in larval zebrafish.</a> Development. 143 (9), 1464-1474 (2016).</li><li>Roy-Carson, S., Natukunda, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+the+transcriptomic+landscape+of+the+developing+enteric+nervous+system+and+its+cellular+environment.">Defining the transcriptomic landscape of the developing enteric nervous system and its cellular environment.</a> BMC Genomics. 18 (1), 1-24 (2017).</li><li>Khuansuwan, S., Gamse, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+differentially+expressed+genes+during+development+of+the+zebrafish+pineal+complex+using+RNA+sequencing.">Identification of differentially expressed genes during development of the zebrafish pineal complex using RNA sequencing.</a> Developmental biology. 395 (1), 144-153 (2014).</li><li>Schmid, C. D., Melchior, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+gene+expression+in+LPS/IFN&#947;+activated+microglia+and+macrophages:+in+vitroversus+in+vivo.">Differential gene expression in LPS/IFN&#947; activated microglia and macrophages: in vitroversus in vivo.</a> Journal of Neurochemistry. 109, 117-125 (2009).</li><li>Bohlen, C. J., Bennett, F. C., Tucker, A. F., Collins, H. Y., Mulinyawe, S. B., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+Requirements+for+Microglial+Survival,+Specification,+and+Function+Revealed+by+Defined-+Medium+Cultures.">Diverse Requirements for Microglial Survival, Specification, and Function Revealed by Defined- Medium Cultures.</a> Neuron. 94 (4), 759-773 (2017).</li><li>Khan, A., Ju, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptomic+analysis+reveals+differential+activation+of+microglial+genes+after+ischemic+stroke+in+mice.">Transcriptomic analysis reveals differential activation of microglial genes after ischemic stroke in mice.</a> Neuroscience. 348, 212-227 (2017).</li></ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

O protocolo experimental descrito aqui representa um método robusto e eficiente para isolar as células do cérebro de zebrafish larvas de 3 a 8 dpf. Importante, este é o primeiro protocolo que permite o isolamento específico da microglia do zebrafish larval cérebros. O protocolo é projetado para preservar a integridade da membrana celular e para minimizar possíveis modificações da expressão genética ocorrem durante o processamento. Este último ponto é crucial para a relevância dos resultados com base na análise desses perfis genômicos celulares isolados. Com efeito, polarização microglia e macrófagos são fortemente influenciados pelo seu microambiente. A 37 ° C, estas células teria mudado seu perfil de expressão de gene em resposta a condições experimentais (resposta de lesão (transecção)). Portanto, foi crucial para realizar este experimento a 4 ° C antes da extração de RNA, para retardar processos celulares e atividades metabólicas. Além disso, a homogeneização do tecido de cérebro mecânico a 4 ° C foi escolhida em vez de digestão enzimática do tecido a 37 ° C para evitar qualquer impacto sobre perfis de expressão de gene.
É importante salientar que este método é muito rápido; dentro de um dia de várias populações de células do cérebro podem ser isoladas de pelo menos duas diferentes condições experimentais e seu RNA extraído. O comprimento total do protocolo depende do número de larvas usados para cada condição como a transecção de cabeças larvas é o passo limitante (∼ 350 cabeças/h). Em geral, para trabalhar com microglia de 3, 5 e 7 dpf é aconselhável transecto 600 cabeças ∼ por teste para obter suficiente RNA para extrair (tabela 1). Como micróglia representam o tipo de célula com o menor rendimento (aproximadamente 112 células per capita no dpf 7), o número de cabeças pode ser reduzido para outros tipos de células, incluindo os macrófagos (aproximadamente 170 células per capita em 7 dpf).
Outra vantagem deste protocolo é que, uma vez que se estabeleceram as configurações no classificador de FACS, as mesmas configurações podem ser usadas para diferentes experiências. Tem sido observado que populações de células se encaixam perfeitamente de um experimento para outro com portões previamente concebidos, mostrando a reprodutibilidade de experimentos usando esse método.
Uma ligeira desvantagem desse método é a relativamente baixa quantidade de RNA que é colhido. No entanto, esta limitação é mais uma questão biológica do que um problema técnico, como o número de micróglia é muito baixo em estágios iniciais de desenvolvimento do cérebro (tabela 1). Por causa desta baixa quantidade de RNA coletado, etapas de amplificação precisam ser considerados para executar análise de expressão de gene ampla do genoma. Felizmente, estas etapas de amplificação produzem quantidades suficientes de cDNA de alta qualidade. Assim, mudanças globais nos perfis de expressão do gene de células isoladas podem ser estudadas.
Em conclusão, este protocolo fornece um método robusto para isolar e estudar vários tipos de células do CNS de cérebros de zebrafish larval. Isto pode ser aplicado para ganhar uma compreensão mais profunda dessas células durante o desenvolvimento, bem como para estudar o seu papel na doença.

Conhecimento sobre o desenvolvimento do cérebro e doenças cerebrais melhorou significativamente na última década desde a primeira quantificação de cérebro de rato transcriptomes1. Com efeito, análise de expressão de gene ampla do genoma nos dá acesso para detalhadas informações genéticas no tecido cerebral e as células que podem complementar e melhorar as observações feitas com outras técnicas e ferramentas.
O peixe-zebra é um potente modelo biológico, fáceis de criar e modificar geneticamente; sua transparência óptica em estágios larvas permite de observações de imagens ao vivo2. Infelizmente, em comparação ao humano e mouse, o número de anticorpos disponíveis para executar imuno-coloração é um pouco baixa. Para corrigir isso, linhas de peixe zebrafish transgênicos são feitas facilmente modificando geneticamente o peixe para expressar proteínas fluorescentes sob os promotores específicos de tipo de célula. Linhas de zebrafish transgênicos têm sido utilizadas no passado para estudar o papel de macrófagos e microglia durante o desenvolvimento do sistema nervoso central (SNC) e doença3,4,5,6. No entanto, para obter uma compreensão detalhada destes processos, precisamos entender mudanças na expressão gênica nos tipos de célula respectivos. Para esse fim, nós desenvolvemos um método experimental para isolar especificamente células como os neurônios, macrófagos e microglia de 3 a 8 dias cérebros de zebrafish larval pós fertilização (dpf). Para o estabelecimento do protocolo, trabalhamos com linhas de peixe transgênico que expressam a proteína verde fluorescente (GFP) em macrófagos/microglia sob o macrófago-expressa o gene promotor (mpeg1:eGFP) e DsRed nos neurônios sob a ß-tubulina neural promotor (NBT:DsRed)7,8,9. Além disso, realizamos imuno-coloração de micróglia usando 4 4, um anticorpo monoclonal de rato que especificamente manchas zebrafish microglia10,11. Depois, ácido ribonucleico (RNA) é extraído dessas células para mais quantitativas cadeia da polimerase (qPCR) ou análises de transcriptoma. Este protocolo foi projetado para homogeneizar eficientemente o tecido cerebral de zebrafish larvas; coletar os neurônios, macrófagos/microglia e microglia sem alteração de sua integridade de membrana plasmática e finalmente extrair RNA destas células em alta qualidade (RIN > 7) e a quantidade para executar análise genômica. Ao contrário de estudos anteriormente publicados que usam o tratamento de tripsina a 37 ° C para digerir o cérebro tecido12,13, este protocolo promove o trabalho em 4 ° C até a etapa de extração de RNA para reduzir as modificações do perfil de expressão do gene. Esta etapa é crucial como microglia e os macrófagos são células altamente sensíveis que respondem às mudanças em seu microambiente imediatamente, alterando seu gene expressão perfil e polarização14,15, 16.
O protocolo, aqui descrito em detalhe, mostra que o isolamento de neurônios, macrófagos e microglia do zebrafish larval cérebros, mas virtualmente, pode ser adaptado a qualquer outra célula presentes dentro do cérebro - usando linhas de peixe transgénicos ou rotulados com anticorpos específicos. Este método irá permitir uma melhor caracterização das células CNS através de suas análises de expressão de gene ampla de genoma e ajudará a compreender o seu papel durante o desenvolvimento e doenças cerebrais.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:840px;" width="840">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">1-phenyl 2-thiourea (PTU)</td>
			<td style="width:319px;">Sigma</td>
			<td style="width:103px;">P7629</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">Hepes</td>
			<td style="width:319px;">Gibco</td>
			<td style="width:103px;">15630-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">D-Glucose</td>
			<td style="width:319px;">Sigma</td>
			<td style="width:103px;">G8644-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">HBSS 1X</td>
			<td style="width:319px;">Gibco</td>
			<td style="width:103px;">14170-088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">Percoll</td>
			<td style="width:319px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:103px;">17-0891-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">HBSS 10X</td>
			<td style="width:319px;">Gibco</td>
			<td style="width:103px;">14180-046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DPBS 1X</td>
			<td style="width:319px;">Gibco</td>
			<td style="width:103px;">14190-094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tricaine (MS222)</td>
			<td style="width:319px;">Sigma</td>
			<td style="width:103px;">A5040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">Sterilin standard 90mm petri dishes</td>
			<td style="width:319px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:103px;">101VIRR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">Surgical micro-scissors</td>
			<td style="width:319px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:103px;">15000-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">3 mL Pasteur plastic bulk pipette</td>
			<td style="width:319px;">SLS</td>
			<td style="width:103px;">PIP4206</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">Glass homogenizer</td>
			<td style="width:319px;">Wheaton</td>
			<td style="width:103px;">357538</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">Sterilin standard 55mm petri dishes</td>
			<td style="width:319px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:103px;">P55V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">Percoll</td>
			<td style="width:319px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:103px;">17-0891-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">40 &#181;m cell strainer</td>
			<td style="width:319px;">Falcon</td>
			<td style="width:103px;">352340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">50 ml polypropylen conical tube</td>
			<td style="width:319px;">Falcon</td>
			<td style="width:103px;">352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:319px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:103px;">5804 R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">10 mL syringe</td>
			<td style="width:319px;">BD</td>
			<td style="width:103px;">302188</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">Needle 23G x 1&#39;&#39;</td>
			<td style="width:319px;">BD</td>
			<td style="width:103px;">300800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">Normal goat serum (NGS)</td>
			<td style="width:319px;">Cell Signalling</td>
			<td style="width:103px;">5425S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">35 &#956;m cell strainer cap</td>
			<td style="width:319px;">BD</td>
			<td style="width:103px;">352235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">FACS tubes</td>
			<td style="width:319px;">BD</td>
			<td style="width:103px;">352063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">Low Endotoxin, Azide-Free (LEAF)</td>
			<td style="width:319px;">Biolegend</td>
			<td style="width:103px;">101321</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Alexa Fluor 647 Goat Anti-Mouse IgG (H+L)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A11008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-4C4</td>
			<td colspan="2">Courtesy of Catherina Becker (University of Edinburgh)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">FACS sorter FACSAria II</td>
			<td style="width:319px;">BD</td>
			<td colspan="2">QMRI, FACS facility</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RNeasy Plus Micro Kit</td>
			<td style="width:319px;">QIAGEN</td>
			<td style="width:103px;">74034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td style="width:319px;">Gibco</td>
			<td style="width:103px;">&#160;31350-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">QIAshredder</td>
			<td style="width:319px;">QIAGEN</td>
			<td style="width:103px;">79654</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:252px;">SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix</td>
			<td style="width:319px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:103px;">1725271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:252px;">SuperScript III First-Strand Synthesis System</td>
			<td style="width:319px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:103px;">18080-051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:252px;">LightCycler 96 Real-Time PCR System&#160;</td>
			<td style="width:319px;">Roche</td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">Ovation RNA-Seq System V2</td>
			<td style="width:319px;">NuGEN</td>
			<td style="width:103px;">7102-32</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">Agilent RNA 6000 Pico reagents</td>
			<td style="width:319px;">Agilent</td>
			<td style="width:103px;">5067-1513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">2100 Bioanalyzer</td>
			<td style="width:319px;">Agilent</td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RNaseZap</td>
			<td style="width:319px;">Ambion</td>
			<td style="width:103px;">AM9780</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and rna extraction of neurons, macrophages and microglia from larval zebrafish brains

Para obter uma compreensão detalhada do papel de células diferentes do CNS durante o desenvolvimento ou o estabelecimento e progressão do patologias do cérebro, é importante isolar essas células sem alterar seu perfil de expressão do gene. O modelo de zebrafish fornece um grande número de linhas de peixe transgênico em que tipos de células específicas são rotulados; por exemplo, neurônios na linha de NBT:DsRed ou macrófagos/microglia na linha de mpeg1:eGFP. Além disso, os anticorpos têm sido desenvolvidos para manchar a células específicas, tais como microglia com o 4-4 anticorpo.
Aqui, descrevemos o isolamento de neurônios, macrófagos e microglia do zebrafish larval cérebros. Central para este protocolo é evitar uma digestão enzimática do tecido a 37 ° C, o que poderia modificar perfis celulares. Em vez disso, é usado um sistema mecânico de homogeneização do tecido a 4 ° C. Este protocolo envolve homogeneização dos cérebros em suspensão de células, sua imuno-coloração e o isolamento de neurônios, macrófagos e microglia por FACS. Depois, extraído do RNA essas células e avaliada a sua qualidade/quantidade. Conseguimos obter RNA de alta qualidade (número de integridade do RNA (RIN) > 7) para realizar qPCR em análise macrófagos/microglia e neurônios e transcriptomic na microglia. Essa abordagem permite uma melhor caracterização destas células, bem como uma compreensão mais clara sobre o seu papel no desenvolvimento e patologias.

O protocolo descrito é uma abordagem simples para isolar os neurônios, macrófagos e microglia do zebrafish larval cérebros. A partir desses isolados de células, uma quantidade significativa de alta qualidade (RIN > 7) RNA foram extraídos. O objectivo do presente protocolo é isolar diferentes tipos de células do SNC, com mínima modificação do seu perfil de expressão do gene para analisar e caracterizar as funções e propriedades da célula. Portanto, o protocolo inteiro é realizado a 4 ° C, com uma homogeneização do tecido de cérebro mecânico. Este método tem sido utilizado com sucesso para dois estudos realizados em laboratório. No primeiro estudo, os neurônios e macrófagos/microglia foram isoladas de 8 dpf mpeg1:eGFP+/NBT:DsRed+ larva (Figura 1). FACS permitida a separação da pilha de detritos em função do seu tamanho (FSC-A) e granularidade (SSC-A) (Figura 1A). Células únicas foram então separadas de parelhas ou aglomerados de células (Figura 1B). Da população única célula, um portão foi desenhado para eliminar as células mortas (DAPI+). O enredo de ponto correspondente revelou que este protocolo experimental preserva a integridade da membrana plasmática celular, como a taxa de células mortas é apenas 26,7% (Figura 1C). Finalmente, neurônios (DsRed+) e macrófagos/microglia (GFP+) eram facilmente separavam os portões de população de células vivas. A população de neurônio (23,1%) parecia ser mais proeminente do que a população de macrófagos/microglia (1,56%) dentro do cérebro (Figura 1D). Este protocolo permitiu para isolar o RNA dessas células para realizar análises subsequentes qPCR para comparar a expressão de genes específicos entre os neurônios e macrófagos/microglia. A Figura 2 mostra neuronal e os níveis de expressão do gene de macrófagos/microglia do antígeno nuclear de proliferação celular (pcna)contra gene β-actina domésticas, por exemplo.
O segundo estudo este método focado em microglia isolamento de 3, 5 e 7 dpf cérebros larval. Em contraste com o experimento descrito acima, as células foram isoladas por imuno-coloração usando 4 4, um anticorpo que rotula especificamente microglia (Figura 3 A-D). Como descrito anteriormente, microglia (4 4+) foram selecionados a partir de células vivas e coletados (Figura 3-D). Microglia números dentro zebrafish larval cérebros são variáveis (tabela 1) e muito baixa no dpf 3 (∼ 25 por peixes). Qualidade e quantidade de RNA extraído dessas células foram medidos utilizando um sistema de eletroforese capilar micro baseado. Resultados obtidos do RNA extraído de micróglia 5 dpf zebrafish larval cérebros foram fornecidos para ilustrar um exemplo de análise de RNA (tabela 1 (dpf 5; experimento 4)). A Figura 4 mostra o rastreamento de eletroforese e sua representação gráfica obtidos para esta amostra com uma visualização clara do RNA ribossomal (28s e 18s). Estes dados são necessários para calcular a amostra RIN e determinar a concentração de RNA. A tabela 1 resume o número de isolados microglia por peixes, a quantidade de RNA por microglia e o escore de RIN obtido para cada experimento diferente em 3, 5 e 7 dpf. A quantidade e a qualidade do RNA extraído de micróglia isolado usando este método permitiram a amplificar o RNA em cDNA usando um kit. Testes de qualidade e quantidade fornecidos por Edimburgo genómica confirmam que o cDNA amplificado de qualidade suficiente para a preparação de biblioteca e posterior sequenciamento. A Figura 5 mostra a distribuição de tamanho de fragmentos de cDNA e sua quantidade medido utilizando um sistema eletroforético. Neste exemplo, o cDNA tinha um tamanho médio de 299bp em uma concentração de 36100 pmol/l. tabela 2 ilustra, respectivamente, qualidade e quantidade de testes feitos no cDNA amplificado de amostras do RNA (tabela 1 (dpf 5; experimento 4)). O cDNA amplificado tem sido usado com sucesso para o sequenciamento.
Vários estudos realizados em laboratório confirmaram que a qualidade e a quantidade de RNA extraído de neurônios, macrófagos e microglia podem ser usados para qPCR subsequente e as análises de expressão de gene ampla do genoma. Portanto, este protocolo experimental pode ser usado para isolar confiantemente diferentes tipos de células do CNS sem alterar sua integridade de membrana e limitando a modificação do seu perfil de expressão do gene.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57431/57431fig1.jpg"> Figura 1 : FACS 8 dpf zebrafish larvas de classificação para os neurônios e macrófagos/microglia do /NBT:DsRed mpeg1:GFP++ . (A-C) Gating sucessivas mostra seleção sequencial de todo cérebro células (A), dispersão de células únicas por dispersão para a frente e lateral (B). Células (C) mortos foram excluídas pela rotulagem DAPI. (D) os neurônios e macrófagos/microglia foram identificados respectivamente pela coloração positiva DsRed e GFP. <a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57431/57431fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57431/57431fig2.jpg"> Figura 2 : Análise de expressão do Gene para pcna e β-actina nos neurônios e macrófagos/microglia. RNA de neurônios isolados e macrófagos/microglia pode ser transcrito em cDNA para uso em análises quantitativas de PCR. níveis de expressão de RNAm de pcna contra gene β-actina domésticas em neurônios isolados e macrófagos/microglia determinado pelo qPCR (N = 3). Mudança de dobra foi medida utilizando o método comparativo (ΔΔCT). Erro da barra representam média ± SEM. <a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57431/57431fig2large.jpg" target="_blank">clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57431/57431fig3.jpg"> Figura 3 : FACS classificação para microglia de 3 larvas de zebrafish dpf. (A-C) Sucessivas sequencial Mostrar seleção associada do cérebro todas as células (A), dispersão de células únicas por dispersão para a frente e lateral (B). Células (C) mortos foram excluídas pela rotulagem DAPI. (D) Microglia foram identificados por 4 4 coloração positiva. <a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57431/57431fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57431/57431fig4.jpg"> Figura 4 : Resultados de eletroforese capilar-micro do RNA extraído das 5 dpf zebrafish microglia. Os dois picos altos são o RNA ribosomal 18S e 28S. Número de integridade do RNA (RIN) foi calculado automaticamente pelo software bioanalyzer usando a relação gerada da 18S e 28S subunidades ribossomais e a análise do rastreamento eletroforética inteira. Microglia RNA tem um RIN 8,6. <a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57431/57431fig4large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57431/57431fig5.jpg"> Figura 5 : Testes de qualidade e quantidade do cDNA amplificado de amostra de RNA de 5 dpf zebrafish microglia. A imagem mostra a distribuição de tamanho de fragmento do cDNA da amostra analisada com um tamanho médio de 299 BP <a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57431/57431fig5large.jpg" target="_blank">clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>Condição</td>
			<td>Experimento</td>
			<td>Número de peixes</td>
			<td>Número do celular</td>
			<td>Número de células por peixes</td>
			<td>Concentração de RNA (pg/ul)</td>
			<td>RNA total (pg)</td>
			<td>Quantidade de RNA por célula (pg)</td>
			<td>Pontuação de RIN</td>
		</tr>
<tr>
<td>3dpf</td>
			<td>1</td>
			<td>700</td>
			<td>11922</td>
			<td>17,03</td>
			<td>126</td>
			<td>1512</td>
			<td>0.13</td>
			<td>8</td>
		</tr>
<tr>
<td>3dpf</td>
			<td>2</td>
			<td>600</td>
			<td>22527</td>
			<td>37.55</td>
			<td>253</td>
			<td>3036</td>
			<td>0.13</td>
			<td>7,9</td>
		</tr>
<tr>
<td>3dpf</td>
			<td>3</td>
			<td>600</td>
			<td>18688</td>
			<td>31.15</td>
			<td>255</td>
			<td>3060</td>
			<td>0.16</td>
			<td>7.7</td>
		</tr>
<tr>
<td>3dpf</td>
			<td>4</td>
			<td>600</td>
			<td>11121</td>
			<td>18.54</td>
			<td>189</td>
			<td>2268</td>
			<td>0.20</td>
			<td>7,8</td>
		</tr>
<tr>
<td>3dpf</td>
			<td>5</td>
			<td>600</td>
			<td>15581</td>
			<td>25.97</td>
			<td>131</td>
			<td>1572</td>
			<td>0,10</td>
			<td>8.4</td>
		</tr>
<tr>
<td>3dpf</td>
			<td>6</td>
			<td>600</td>
			<td>11965</td>
			<td>19,94</td>
			<td>256</td>
			<td>3072</td>
			<td>0,26</td>
			<td>8.2</td>
		</tr>
<tr>
<td>5dpf</td>
			<td>1</td>
			<td>600</td>
			<td>58629</td>
			<td>97.72</td>
			<td>362</td>
			<td>4344</td>
			<td>0.07</td>
			<td>7.4</td>
		</tr>
<tr>
<td>5dpf</td>
			<td>2</td>
			<td>600</td>
			<td>32510</td>
			<td>54,18</td>
			<td>348</td>
			<td>4176</td>
			<td>0.13</td>
			<td>8.1</td>
		</tr>
<tr>
<td>5dpf</td>
			<td>3</td>
			<td>600</td>
			<td>77884</td>
			<td>129.81</td>
			<td>594</td>
			<td>7128</td>
			<td>0,09</td>
			<td>8.3</td>
		</tr>
<tr>
<td>5dpf</td>
			<td>4</td>
			<td>600</td>
			<td>50755</td>
			<td>84.59</td>
			<td>305</td>
			<td>3660</td>
			<td>0.07</td>
			<td>8.6</td>
		</tr>
<tr>
<td>5dpf</td>
			<td>5</td>
			<td>600</td>
			<td>44967</td>
			<td>74.95</td>
			<td>134</td>
			<td>1608</td>
			<td>0,04</td>
			<td>7.6</td>
		</tr>
<tr>
<td>5dpf</td>
			<td>6</td>
			<td>600</td>
			<td>51031</td>
			<td>85.05</td>
			<td>163</td>
			<td>1956</td>
			<td>0,04</td>
			<td>7,9</td>
		</tr>
<tr>
<td>7dpf</td>
			<td>1</td>
			<td>600</td>
			<td>60496</td>
			<td>100.83</td>
			<td>183</td>
			<td>2196</td>
			<td>0,04</td>
			<td>7.6</td>
		</tr>
<tr>
<td>7dpf</td>
			<td>2</td>
			<td>450</td>
			<td>55517</td>
			<td>123.37</td>
			<td>183</td>
			<td>2196</td>
			<td>0,04</td>
			<td>7,8</td>
		</tr>
<tr>
<td>7dpf</td>
			<td>3</td>
			<td>600</td>
			<td>88897</td>
			<td>148.16</td>
			<td>465</td>
			<td>5580</td>
			<td>0,06</td>
			<td>8.1</td>
		</tr>
<tr>
<td>7dpf</td>
			<td>4</td>
			<td>600</td>
			<td>63008</td>
			<td>105.01</td>
			<td>356</td>
			<td>4272</td>
			<td>0.07</td>
			<td>8.4</td>
		</tr>
<tr>
<td>7dpf</td>
			<td>5</td>
			<td>350</td>
			<td>34956</td>
			<td>99.87</td>
			<td>245</td>
			<td>2940</td>
			<td>0.08</td>
			<td>8.1</td>
		</tr>
<tr>
<td>7dpf</td>
			<td>6</td>
			<td>600</td>
			<td>63887</td>
			<td>106.48</td>
			<td>341</td>
			<td>4092</td>
			<td>0,06</td>
			<td>7,8</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabela 1: Resumo de isolamento microglia e dados de extração de RNA de 3, 5 e 7 dpf zebrafish larvas.
<table fo:font-size="7" fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>ID de amostra interna</td>
			<td>ID de amostra externo</td>
			<td>Qubit (ng/ul)</td>
			<td>Qubit(ng/ul)</td>
			<td>Concentração média (ng/ul)</td>
			<td>Volume (ul)</td>
			<td>UG recebido</td>
			<td>Aprovação/reprovação para concentração mínima</td>
			<td>Aprovação/reprovação para quantidade de minimim</td>
			<td>Aprovação/reprovação para quantidade recomendada</td>
		</tr>
<tr>
<td>10907SD0010</td>
			<td>5 dpf (experimento 4)</td>
			<td>58,8</td>
			<td>58,4</td>
			<td>58,6</td>
			<td>30</td>
			<td>1.76</td>
			<td>Passar</td>
			<td>Passar</td>
			<td>Passar</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="10">Requisitos de amostra para a preparação da biblioteca:</td>
		</tr>
<tr>
<td>Biblioteca Prep</td>
			<td>Quantidade mínima (ng)</td>
			<td>Quantidade recomendada (ng)</td>
			<td>Mínima concentração ng/uL</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>TruSeq Nano gel biblioteca inserção livre bp 350 de cDNA</td>
			<td>600</td>
			<td>1100</td>
			<td>10</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
</tbody></table>Tabela 2: Testes de quantidade de cDNA amplificado de amostra de RNA de 5 dpf zebrafish microglia.

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Isolation and RNA Extraction of Neurons, Macrophages and Microglia from Larval Zebrafish Brains

Isolamento e extração de RNA de neurônios, macrófagos e Microglia de Zebrafish Larval cérebros

Apresentamos um protocolo para isolar os neurônios, macrófagos e microglia do zebrafish larval cérebros sob condições fisiológicas e patológicas. Após o isolamento, RNA é extraído dessas células para analisar seu perfil de expressão do gene. Este protocolo permite para a coleção de RNA de alta qualidade para a realização de análise a jusante como qPCR e transcriptomics.

To gain a detailed understanding of the role of different CNS cells during development or the establishment and progression of brain pathologies, it is ...

isolation-rna-extraction-neurons-macrophages-microglia-from-larval

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

13.6K visualizações.  University of Edinburgh. Apresentamos um protocolo para isolar os neurônios, macrófagos e microglia do zebrafish larval cérebros sob condições fisiológicas e patológicas. Após o isolamento, RNA é extraído dessas células para analisar seu perfil de expressão do gene. Este protocolo permite para a coleção de RNA de alta qualidade para a realização de análise a jusante como qPCR e transcriptomics.

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Isolation and Culture of Hippocampal Neurons from Prenatal Mice

Primary cultures of rat and murine hippocampal neurons are widely used to reveal cellular mechanisms in neurobiology. By isolating and growing individual neurons, researchers are able to analyze properties related to cellular trafficking, cellular structure and individual protein localization using a variety of biochemical techniques. Results from such experiments are critical for testing theories addressing the neural basis of memory and learning. However, unambiguous results from these forms of experiments are predicated on the ability to grow neuronal cultures with minimum contamination by other brain cell types. In this protocol, we use specific media designed for neuron growth and careful dissection of embryonic hippocampal tissue to optimize growth of healthy neurons while minimizing contaminating cell types (i.e. astrocytes). Embryonic mouse hippocampal tissue can be more difficult to isolate than similar rodent tissue due to the size of the sample for dissection. We show detailed dissection techniques of hippocampus from embryonic day 19 (E19) mouse pups. Once hippocampal tissue is isolated, gentle dissociation of neuronal cells is achieved with a dilute concentration of trypsin and mechanical disruption designed to separate cells from connective tissue while providing minimum damage to individual cells. A detailed description of how to prepare pipettes to be used in the disruption is included. Optimal plating densities are provided for immuno-fluorescence protocols to maximize successful cell culture. The protocol provides a fast (approximately 2 hr) and efficient technique for the culture of neuronal cells from mouse hippocampal tissue.

We provide a protocol for the culture of highly purified hippocampal neurons from prenatal mouse brains without the use of a feeder glial cell layer.

Isolamento e Cultura de neurônios do hipocampo de ratos pré-natal

Primary cultures of rat and murine hippocampal neurons are widely used to reveal cellular mechanisms in neurobiology. By isolating and growing individual ...

Neurociência

Forebrain Electrophysiological Recording in Larval Zebrafish

Epilepsy affects nearly 3 million people in the United States and up to 50 million people worldwide. Defined as the occurrence of spontaneous unprovoked seizures, epilepsy can be acquired as a result of an insult to the brain or a genetic mutation. Efforts to model seizures in animals have primarily utilized acquired insults (convulsant drugs, stimulation or brain injury) and genetic manipulations (antisense knockdown, homologous recombination or transgenesis) in rodents. Zebrafish are a vertebrate model system1-3 that could provide a valuable alternative to rodent-based epilepsy research. Zebrafish are used extensively in the study of vertebrate genetics or development, exhibit a high degree of genetic similarity to mammals and express homologs for ~85% of known human single-gene epilepsy mutations. Because of their small size (4-6 mm in length), zebrafish larvae can be maintained in fluid volumes as low as 100 &mu;l during early development and arrayed in multi-well plates. Reagents can be added directly to the solution in which embryos develop, simplifying drug administration and enabling rapid in vivo screening of test compounds4. Synthetic oligonucleotides (morpholinos), mutagenesis, zinc finger nuclease and transgenic approaches can be used to rapidly generate gene knockdown or mutation in zebrafish5-7. These properties afford zebrafish studies an unprecedented statistical power analysis advantage over rodents in the study of neurological disorders such as epilepsy. Because the "gold standard" for epilepsy research is to monitor and analyze the abnormal electrical discharges that originate in a central brain structure (i.e., seizures), a method to efficiently record brain activity in larval zebrafish is described here. This method is an adaptation of conventional extracellular recording techniques and allows for stable long-term monitoring of brain activity in intact zebrafish larvae. Sample recordings are shown for acute seizures induced by bath application of convulsant drugs and spontaneous seizures recorded in a genetically modified fish.

A simple method to record extracellular field potentials in the larval zebrafish forebrain is described. The method provides a robust in vivo read-out of seizure-like activity. This technique can be used with genetically modified zebrafish larvae carrying epilepsy-related genes or seizures evoked by administration of convulsant drugs.

Prosencéfalo gravação eletrofisiológico em larval Zebrafish

Epilepsy affects nearly 3 million people in the United States and up to 50 million people worldwide. Defined as the occurrence of spontaneous unprovoked ...

Isolation and Culture of Dissociated Sensory Neurons From Chick Embryos

Neurons are multifaceted cells that carry information essential for a variety of functions including sensation, motor movement, learning, and memory. Studying neurons in vivo can be challenging due to their complexity, their varied and dynamic environments, and technical limitations. For these reasons, studying neurons in vitro can prove beneficial to unravel the complex mysteries of neurons. The well-defined nature of cell culture models provides detailed control over environmental conditions and variables. Here we describe how to isolate, dissociate, and culture primary neurons from chick embryos. This technique is rapid, inexpensive, and generates robustly growing sensory neurons. The procedure consistently produces cultures that are highly enriched for neurons and has very few non-neuronal cells (less than 5%). Primary neurons do not adhere well to untreated glass or tissue culture plastic, therefore detailed procedures to create two distinct, well-defined laminin-containing substrata for neuronal plating are described. Cultured neurons are highly amenable to multiple cellular and molecular techniques, including co-immunoprecipitation, live cell imagining, RNAi, and immunocytochemistry. Procedures for double immunocytochemistry on these cultured neurons have been optimized and described here.

Cell culture models provide detailed control over environmental conditions and thus provide a powerful platform to elucidate numerous aspects of neuronal cell biology. We describe a rapid, inexpensive, and reliable method to isolate, dissociate, and culture sensory neurons from chick embryos. Details of substrata preparation and immunocytochemistry are also provided.

Isolamento e Cultura de Dissociated neurônios sensoriais de Chick Embriões

Neurons are multifaceted cells that carry information essential for a variety of functions including sensation, motor movement, learning, and memory. ...

Isolation, Culture and Long-Term Maintenance of Primary Mesencephalic Dopaminergic Neurons From Embryonic Rodent Brains

Degeneration of mesencephalic dopaminergic (mesDA) neurons is the pathological hallmark of Parkinson&#8217;s diseae. Study of the biological processes involved in physiological functions and vulnerability and death of these neurons is imparative to understanding the underlying causes and unraveling the cure for this common neurodegenerative disorder. Primary cultures of mesDA neurons provide a tool for investigation of the molecular, biochemical and electrophysiological properties, in order to understand the development, long-term survival and degeneration of these neurons during the course of disease. Here we present a detailed method for the isolation, culturing and maintenance of midbrain dopaminergic neurons from E12.5 mouse (or E14.5 rat) embryos. Optimized cell culture conditions in this protocol result in presence of axonal and dendritic projections, synaptic connections and other neuronal morphological properties, which make the cultures suitable for study of the physiological, cell biological and molecular characteristics of this neuronal population.

The causes of degeneration of midbrain dopaminergic neurons during Parkinson&#8217;s disease are not fully understood. Cellular culture systems provide an essential tool for study of the neurophysiological properties of these neurons. Here we present an optimized protocol, which can be utilized for in vitro modeling of neurodegeneration.

Isolamento, cultura e Long-Term Manutenção da Primária mesencefálico Dopaminergic neurônios dos cérebros de roedores Embryonic

Degeneration of mesencephalic dopaminergic (mesDA) neurons is the pathological hallmark of Parkinson&#8217;s diseae. Study of the biological processes ...

Sequential Extraction of Soluble and Insoluble Alpha-Synuclein from Parkinsonian Brains

Alpha-synuclein (&#945;-syn) protein is abundantly expressed mainly within neurons, and exists in a number of different forms - monomers, tetramers, oligomers and fibrils. During disease, &#945;-syn undergoes conformational changes to form oligomers and high molecular weight aggregates that tend to make the protein more insoluble. Abnormally aggregated &#945;-syn is a neuropathological feature of Parkinson&#39;s disease (PD), dementia with Lewy bodies (DLB) and multiple system atrophy (MSA). Biochemical characterization and analysis of insoluble &#945;-syn using buffers with increasing detergent strength and high-speed ultracentrifugation provides a powerful tool to determine the development of &#945;-syn pathology associated with disease progression. This protocol describes the isolation of increasingly insoluble/aggregated &#945;-syn from post-mortem human brain tissue. This methodology can be adapted with modifications to studies of normal and abnormal &#945;-syn biology in transgenic animal models harbouring different &#945;-syn mutations as well as in other neurodegenerative diseases that feature aberrant fibrillar deposits of proteins related to their respective pathologies.

Here, we present a protocol for the isolation of increasingly insoluble/aggregated alpha-synuclein (&#945;-syn) from post-mortem human brain tissue. Through the utilization of buffers with increasing detergent strength and high-speed ultracentrifugation techniques, the variable properties of &#945;-syn aggregation in diseased and non-diseased tissue can be examined.

Extração seqüencial de solúveis e insolúveis alfa-sinucleína de Brains parkinsonianos

Alpha-synuclein (&#945;-syn) protein is abundantly expressed mainly within neurons, and exists in a number of different forms - monomers, tetramers, ...

Removal of Drosophila Muscle Tissue from Larval Fillets for Immunofluorescence Analysis of Sensory Neurons and Epidermal Cells

Drosophila larval dendritic arborization (da) neurons are a popular model for investigating mechanisms of neuronal morphogenesis. Da neurons develop in communication with the epidermal cells they innervate and thus their analysis benefits from in situ visualization of both neuronally and epidermally expressed proteins by immunofluorescence. Traditional methods of preparing larval fillets for immunofluorescence experiments leave intact the muscle tissue that covers most of the body wall, presenting several challenges to imaging neuronal and epidermal proteins. Here we describe a method for removing muscle tissue from Drosophila larval fillets. This protocol enables imaging of proteins that are otherwise obscured by muscle tissue, improves signal to noise ratio, and facilitates the use of super-resolution microscopy to study da neuron development.

Removal of Drosophila Muscle Tissue from Larval Fillets for Immunofluorescence Analysis of Sensory Neurons and Epidermal Cells

Studies of neuronal morphogenesis using Drosophila larval dendritic arborization (da) neurons benefit from in situ visualization of neuronal and epidermal proteins by immunofluorescence. We describe a procedure that improves immunofluorescence analysis of da neurons and surrounding epidermal cells by removing muscle tissue from the larval body wall.

Remoção de<em&gt; Drosophila</em&gt; Tecido muscular larval Filetes para Análise de imunofluorescência de neurônios sensoriais e células epidérmicas

Drosophila larval dendritic arborization (da) neurons are a popular model for investigating mechanisms of neuronal morphogenesis. Da neurons develop in ...

Spinal Cord Neurons Isolation and Culture from Neonatal Mice

We present a protocol for the isolation and culture of spinal cord neurons. The neurons are obtained from neonatal C57BL/6 mice and are isolated on postnatal day 1-3. A mouse litter, usually 4-10 pups born from one breeding pair, is gathered for one experiment, and spinal cords are collected individually from each mouse after euthanasia with isoflurane. The spinal column is dissected out and then the spinal cord is released from the column. The spinal cords are then minced to increase the surface area of delivery for an enzymatic protease that allows for the neurons and other cells to be released from the tissue. Trituration is then used to release the cells into solution. This solution is subsequently fractionated in a density gradient to separate the various cells in solution, allowing for neurons to be isolated. Approximately 1-2.5 x 106 neurons can be isolated from one litter group. The neurons are then seeded onto wells coated with adhesive factors that allow for proper growth and maturation. The neurons take approximately 7 days to reach maturity in the growth and culture medium and can be used thereafter for treatment and analysis.

This study presents a technique for the isolation of neurons from WT neonatal mice. It requires the careful dissection of the spinal cord from the neonatal mouse, followed by the separation of neurons from the spinal cord tissue through mechanical and enzymatic cleavage.

Isolamento e cultura de neurônios da medula espinhal de ratos neonatais

We present a protocol for the isolation and culture of spinal cord neurons. The neurons are obtained from neonatal C57BL/6 mice and are isolated on ...

Characterization and Isolation of Mouse Primary Microglia by Density Gradient Centrifugation

Microglia, the resident immune cells in the brain, are the first responders to inflammation or injury in the central nervous system. Recent research has revealed microglia to be dynamic, capable of assuming both pro-inflammatory and anti-inflammatory phenotypes. Both M1 (pro-inflammatory) and M2 (pro-reparative) phenotypes play an important role in neuroinflammatory conditions such as perinatal brain injury, and exhibit differing functions in response to certain environmental stimuli. The modulation of microglial activation has been noted to confer neuroprotection thus suggesting microglia may have therapeutic potential in brain injury. However, more research is required to better understand the role of microglia in disease, and this protocol facilitates that. The protocol described below combines a density gradient centrifugation process to reduce cellular debris, with magnetic separation, producing a highly pure sample of primary microglial cells that can be used for in vitro experimentation, without the need for 2-3 weeks culturing. Additionally, the characterization steps yield robust functional data about microglia, aiding studies to better our understanding of the polarization and priming of these cells, which has strong implications in the field of regenerative medicine.

A protocol for the isolation of primary microglia from murine brains is presented. This technique aids in furthering the current understanding of neurological conditions. Density gradient centrifugation and magnetic separation are combined to produce sufficient yield of a highly pure sample. Furthermore, we outline the steps for characterization of microglia.

Caracterização e isolamento de Mouse Microglia primária por centrifugação gradiente de densidade

Microglia, the resident immune cells in the brain, are the first responders to inflammation or injury in the central nervous system. Recent research has ...

Metabolic Analysis of Drosophila melanogaster Larval and Adult Brains

This protocol describes a method for measuring the metabolism in Drosophila melanogaster larval and adult brains. Quantifying metabolism in whole organs provides a tissue-level understanding of energy utilization that cannot be captured when analyzing primary cells and cell lines. While this analysis is ex vivo, it allows for the measurement from a number of specialized cells working together to perform a function in one tissue and more closely models the in vivo organ. Metabolic reprogramming has been observed in many neurological diseases, including neoplasia, and neurodegenerative diseases. This protocol was developed to assist the D. melanogaster community&#39;s investigation of metabolism in neurological disease models using a commercially available metabolic analyzer. Measuring metabolism of whole brains in the metabolic analyzer is challenging due to the geometry of the brain. This analyzer requires samples to remain at the bottom of a 96-well plate. Cell samples and tissue punches can adhere to the surface of the cell plate or utilize spheroid plates, respectively. However, the spherical, three-dimensional shape of D. melanogaster brains prevents the tissue from adhering to the plate. This protocol requires a specially designed and manufactured micro-tissue restraint that circumvents this problem by preventing any movement of the brain while still allowing metabolic measurements from the analyzer&#39;s two solid-state sensor probes. Oxygen consumption and extracellular acidification rates are reproducible and sensitive to a treatment with metabolic inhibitors. With a minor optimization, this protocol can be adapted for use with any whole tissue and/or model system, provided that the sample size does not exceed the chamber generated by the restraint. While basal metabolic measurements and an analysis after a treatment with mitochondrial inhibitors are described within this protocol, countless experimental conditions, such as energy source preference and rearing environment, could be interrogated.

Metabolic Analysis of Drosophila melanogaster Larval and Adult Brains

We present a protocol for measuring oxygen consumption and extracellular acidification in Drosophila melanogaster larval and adult brains. A metabolic analyzer is utilized with an adapted and optimized protocol. Micro-tissue restraints are a critical component of this protocol and were designed and created specifically for their use in this analysis.

Análise metabólica do melanogaster da drosófila Larval e adulto cérebros

This protocol describes a method for measuring the metabolism in Drosophila melanogaster larval and adult brains. Quantifying metabolism in whole organs ...

Rapid Isolation of Dorsal Root Ganglion Macrophages

There are growing interests to study the molecular and cellular interactions among immune cells and sensory neurons in the dorsal root ganglia after peripheral nerve injury. Peripheral monocytic cells, including macrophages, are known to respond to a tissue injury through phagocytosis, antigen presentation, and cytokine release. Emerging evidence has implicated the contribution of dorsal root ganglia macrophages to neuropathic pain development and axonal repair in the context of nerve injury. Rapidly phenotyping (or &#8220;rapid isolation of&#8221;) the response of dorsal root ganglia macrophages in the context of nerve injury is desired to identify the unknown neuroimmune factors. Here we demonstrate how our lab rapidly and effectively isolates macrophages from the dorsal root ganglia using an enzyme-free mechanical dissociation protocol. The samples are kept on ice throughout to limit cellular stress. This protocol is far less time consuming compared to the standard enzymatic protocol and has been routinely used for our Fluorescence-activated Cell Sorting analysis.

Here we present a mechanical dissociation protocol to rapidly isolate macrophages from the dorsal root ganglion for phenotyping and functional analysis.

Isolação rápida de macrófagos dorsal do gânglio da raiz

There are growing interests to study the molecular and cellular interactions among immune cells and sensory neurons in the dorsal root ganglia after ...