Agradecemos Dr. Claire Davis y el Dr. Veronique Miron (de la reina Instituto de investigación médica, Edimburgo, Reino Unido) ayuda inicial y debates sobre el enfoque experimental y la citometría de flujo de QMRI y facilidad de clasificación celular. Este trabajo fue apoyado por un cáncer Research UK carrera establecimiento Premio a Dr. Dirk Sieger.

1. la muestra y la preparación de los medios de comunicación
<ol><li>Preparar medio embrión (E3) disolviendo 6,4 mM KCl, NaCl de 0,22 mM, 0,33 mM CaCl2 2 H2O, 0,33 mM MgSO4 7 H2O H2O.</li>
	<li>Recolectar embriones de pez cebra inmediatamente después de la fertilización (PD 0).<ol>
<li>Embriones de pez cebra se dividió en 50 por plato de petri de 90 mm. Crear embriones a 28,5 ° C en 50 mL de medio de embrión (E3) tratado con 200 μm 1-fenil 2-tiourea (PTU), desde el final del primer día de desarrollo (PD 0) para la duración del experimento para inhibir pigmentación.</li>
		<li>Cambio el E3 + PTU mediana diariamente para la duración del experimento.</li>
		<li>Pantalla mpeg1:eGFP y NBT:DsRed larvas en 2 PD con un estereomicroscopio fluorescente para la expresión de transgenes positivo, GFP+ los macrófagos/microglía y DsRed+ las neuronas.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparar todos los medios el día antes del experimento bajo una campana de cultivo de tejidos para evitar la contaminación, a continuación, almacenar a 4 ° C.<ol>
<li>Preparar los medios de comunicación A disolviendo 15 mM Hepes y 25 mM D-glucosa en HBSS 1 x.</li>
		<li>Preparar medio de gradiente de densidad (100%) mediante la mezcla de 9 volúmenes de medio de gradiente de densidad en 1 volumen de HBSS 10 x.</li>
		<li>Preparar el medio de gradiente de densidad (22%) diluyendo 22 mL de medio de gradiente de densidad (100%) de 88 mL de DPBS 1 x.</li>
		<li>Preparar DPBS 1 x.</li>
		<li>Preparar medio de E3 + Tricaine mezclando medio E3 con 450 μM Tricaine.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. homogeneización
Nota: Todos los pasos están realizados 4 ° C.
<ol><li>Añadir 1.5 mL Metanosulfonato (15 mM) a platos de Petri de 90 mm que contienen larvas de 50 en 50 mL de medio de embrión de E3 tratado con 200 μm de PTU para anestesiar terminal les.<ol>
<li>Chupar hasta 10 larvas anestesiadas de los platos de petri con una pipeta de plástico a granel Pasteur de 3 mL.</li>
		<li>Transferencia anestesiado larvas 10 por 10 en un plato de petri de 55 mm llenan de helado medio embrión de E3 + Tricaine.</li>
		<li>Bajo un estereomicroscopio, alinear 10 larvas en el centro de la caja Petri. Entonces transecto cabezas larvas sobre el saco vitelino mediante micro-tijeras quirúrgicas (excluir vejiga natatoria para evitar flotación cabezas).</li>
		<li>Chupar cabezas de los platos de petri con una pipeta de plástico a granel Pasteur de 3 mL. Espere hasta que todas las cabezas se reúnen en la punta de la pipeta y luego transfieren en un homogeneizador de vidrio que contengan 1 mL A helada de los medios de comunicación (transferencia de un volumen mínimo para reducir los medios de comunicación una dilución por E3 + Metanosulfonato). Mantenga el homogenizador de vidrio en el hielo. Uso de un homogeneizador por condición experimental.</li>
		<li>Reemplazar cada pequeño placa de Petri que contiene hielo frío E3 + Metanosulfonato con uno nuevo cada 30 minutos para asegurar que corte transversal se realiza en frío E3 + Tricaine medio.</li>
		<li>Vuelva a colocar la helada A los medios de comunicación en el homogenizador de vidrio cuando el color se descolora. Nota: Dilución de A los medios de comunicación puede alterar el tejido de la cabeza debido a los cambios de temperatura.</li>
		<li>Una vez que se han recogido todas las cabezas (600 cabezas/condición), retire el volumen máximo de la multimedia al homogeneizador de vidrio y sustituirla por 1 mL fresca helada a los medios de comunicación.</li>
		<li>Afectar el tejido cerebral con un homogeneizador de vidrio firmemente en el hielo. Realizar 40 rondas de trituración y vueltas para 3-5 larvas de PD y 50 para las larvas de dpf 7 y 8.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Añadir 2 mL del medio A suspensión de la célula (1 mL A los medios de comunicación / 200 cabezas), que se diluya las células y reducir su aglomeración con mielina para facilitar su separación durante la centrifugación en gradiente medio de densidad.<ol>
<li>Para eliminar la aglomeración de células, ejecutar la suspensión de células a través de 40 μm células colador colocado encima de un tubo de frío 50 mL falcon mantenido en hielo. Repetir esta operación 3 veces.</li>
		<li>Transfiera 1 mL de la suspensión celular en tubos de 1,5 mL frío y centrifugado a 300 g durante 10 min a 4 ° C.</li>
		<li>Eliminar el sobrenadante utilizando una jeringa de 10 mL + aguja 23 x 1''.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Resuspenda el sedimento celular con 1 mL de helado 22% densidad gradiente medio suavemente overlaid por 0,5 mL de DPBS helada 1 x (do no mezcla de ellos, una interfase entre ambas soluciones se verá).<ol>
<li>Girar los tubos a 950 g sin freno y aceleración lento durante 30 min a 4 ° C. Nota: Este paso separa del myelin de otras células por secuestrar en la interfase de DPBS 1 x y 22% medio gradiente de densidad, mientras que células se de pellets en la parte inferior del tubo. Eliminación de la mielina es más eficiente cuando la concentración de células no es demasiado alto.</li>
		<li>Utilizando una jeringa de 10 mL + descarte aguja 23 x 1'' el máximo de DPBS, medio de gradiente de densidad y mielina atrapado en su interfase.</li>
		<li>Lavar las células con 0,5 mL del medio A + 2% de suero normal de cabra (NGS), luego gire tubos a 300 g durante 10 min a 4 ° C.</li>
		<li>Deseche el sobrenadante al máximo, entonces todos los pellets de celular de la misma condición experimental en 1 mL de medio A + 2% de la piscina NGS.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Si las células de interés expresan una proteína fluorescente como los macrófagos/microglía de mpeg1:eGFP o las neuronas de NBT:DsRed peces transgénicos (proyección de peces transgénicos ver 1.1.3), ejecutar la suspensión de células a través de un tamiz de 35 μm celular tapón y transfieren a un tubos de 5 mL frío FACS en el hielo, protegidos de la luz. Nota: Alternativamente, se puede realizar inmuno-tinción de microglia.</li>
</ol>3. Microglia inmuno-tinción
Nota: Todas las medidas se realizan a 4 ° C.
<ol><li>Resuspenda el sedimento celular con 0,3 mL de medios de comunicación A + 2% NGS. Dividir en tubos de 3 x 1,5 mL: uno de células sin manchas medir auto fluorescencia de las células de interés, en segundo lugar para que el anticuerpo secundario (1/200) medir la Unión inespecífica del anticuerpo secundario a la microglia y el tercero como prueba (4 de 4 ratón monoclonal anticuerpo (microglia específica) (1/20) + (1/200) de anticuerpo secundario).<ol>
<li>Agregar baja endotoxina, libre de azida (hoja) al 1% a las células (los tubos) para bloquear las interacciones CD16/CD32 con el dominio Fc de las inmunoglobulinas. Incube las células por 10 min con suave agitación cada 5 min.</li>
		<li>Añadir los 4 4 anticuerpos (1/20) a las células (tubo 3) e incubar por 30 min con suave agitación cada 10 minutos.</li>
		<li>Girar los tubos a 300 g durante 10 min a 4 ° C y descarte el sobrenadante.</li>
		<li>Lavar una vez con 0,5 mL del medio A + 2% NGS, luego girar tubos a 300 g durante 10 min a 4 ° C.</li>
		<li>Resuspenda el sedimento celulares con 0,5 ml de medios de comunicación A + 2% NGS e incubar las células con la hoja en el 1% por 10 min con suave agitación cada 5 min.</li>
		<li>Añadir el anticuerpo secundario (1/200) a las células (tubo de 2 y 3). Incube las células por 30 min con suave agitación cada 10 min y la protección de la luz.</li>
		<li>Girar los tubos a 300 g durante 10 min a 4 ° C, luego deseche el sobrenadante.</li>
		<li>Lave dos veces con 0,5 mL de medios de comunicación A + 2% NGS, luego vuelva a suspender el sedimento celulares con 1 mL de medio A + 2% NGS.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ejecutar la suspensión de células a través de una tapa de filtro 35 μm células y transferirlos en tubos de 5 mL frío FACS en el hielo, protegido de la luz.</li>
</ol>4. clasificación (FACS) de la célula
Nota: Realizar todos los pasos a 4 ° C.
<ol><li>Clasificar las neuronas, los macrófagos/microglía y microglia usando un FACS. Nota: Este paso generalmente se realiza por un miembro del personal de la instalación del FACS y ajustes dependen del tipo de equipo utilizado.<ol>
<li>Añadir DAPI en una concentración de 1 μg/mL en cada tubo de FACS para etiquetar las células muertas.</li>
		<li>Configurar las neuronas FACS y tipo, los macrófagos/microglía o microglia de todas las células del cerebro. Separar las células de residuos en función de su tamaño y granularidad, a continuación solo las células por dispersión hacia delante y la dispersión lateral de la puerta. Excluir las células muertas, DAPI etiquetado de células vivas. Identificar las neuronas, los macrófagos/microglía o microglía por su respectiva coloración positiva.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Recoger las células en tubos de 1,5 mL que contiene 1 mL de helado A Media + 2% NGS en hielo. Utilizar tubos diferentes para cada tipo de célula.<ol>
<li>Girar los tubos a 300 g durante 10 min a 4 ° C y luego descartar el sobrenadante.</li>
		<li>Lavar una vez con 0,5 mL de medios de comunicación un entonces deseche el máximo de sobrenadante.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. extracción RNA
<ol><li>Extraiga el RNA de los diferentes tipos de células separados por FACS. Para la extracción de RNA utiliza un kit específico y siga las instrucciones del fabricante. Asegúrese de trabajar en un ambiente libre de Rnasa por espacio de trabajo de limpieza y pipetas con un producto de descontaminación de RNasa y utilizar las puntas de filtro.<ol>
<li>Recién preparar 1 mL de tampón de lisis suplementado con 50 μm β-mercaptoetanol. Nota: Aquí, β-mercaptoetanol es añadido para reducir la degradación del RNA.</li>
		<li>Preparar solución de etanol 70% y 80% usando Rnasa agua libre.</li>
		<li>Lyse las células con 75 μl de tampón de lisis suplementado con 50 μm β-mercaptoetanol. Utilizar una trituradora para mejorar la interrupción de la célula.</li>
		<li>Seguir el manual de extracción de RNA según fabricante.</li>
		<li>Al final del Protocolo, eluir el RNA con 14 μl de agua libre de ARNasa para obtener una concentración suficiente de RNA.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

El protocolo experimental descrito aquí representa un método robusto y eficiente para aislar las células del cerebro de las larvas de pez cebra de 3 a 8 PD. Lo importante, este es el primer protocolo que permite el aislamiento específico de microglía del cerebro larvas de pez cebra. El protocolo está diseñado para preservar la integridad de la membrana de la célula y para minimizar posibles modificaciones de la expresión génica que ocurren durante el proceso. Este último punto es crucial para la relevancia de los resultados basados en el análisis de los perfiles genómicas celulares aisladas. De hecho, la polarización microglia y macrófagos están fuertemente influenciadas por su microambiente. A 37 ° C, estas células habrían cambiado su perfil de expresión génica en respuesta a las condiciones experimentales (respuesta de la lesión (corte transversal)). Por lo tanto, era crucial para llevar a cabo este experimento a 4 ° C antes de la extracción de RNA, frenar actividades metabólicas y procesos celulares. Además, la homogeneización del tejido de cerebro mecánico a 4 ° C fue elegida en lugar de digestión enzimática del tejido a 37 ° C para evitar cualquier impacto en los perfiles de expresión génica.
Es importante destacar que este método es muy rápido; en un día varias poblaciones de la célula de cerebro pueden ser aisladas de al menos dos diferentes condiciones experimentales y su ARN extraído. La longitud total del protocolo depende del número de larvas que se utiliza para cada condición como el transection de cabezas larvales es el paso limitante (∼ 350 cabezas por hora). En general, para trabajar con microglia de 3, 5 y 7 PD se recomienda transecto 600 cabezas ∼ por prueba para conseguir suficiente RNA para extraer (tabla 1). Microglía representan el tipo de célula con el más bajo rendimiento (aprox. 112 células por cabeza en dpf 7), puede reducir el número de cabezas para otros tipos de células incluyendo los macrófagos (aprox. 170 células por cabeza en dpf 7).
Otra ventaja de este protocolo es que, una vez que se han establecido parámetros en el clasificador de FACS, la misma configuración puede utilizarse para diversos experimentos. Se ha observado que poblaciones celulares encajan perfectamente de un experimento a otro con puertas previamente diseñados, que muestra la reproducibilidad de los experimentos con este método.
Una leve desventaja de este método es la cantidad relativamente baja de RNA que se cosecha. Sin embargo, esta limitación es más una cuestión biológica que una cuestión técnica, como el número de microglía es muy escaso en las primeras etapas del desarrollo del cerebro (tabla 1). Debido a esta baja cantidad de RNA recogido, pasos de amplificación deben ser considerados para llevar a cabo análisis de genoma amplio gene expresión. Afortunadamente, estos pasos de amplificación producen cantidades suficientes de cDNA de alta calidad. Por lo tanto, pueden estudiarse los cambios globales en los perfiles de expresión génica de células aisladas.
En conclusión, este protocolo proporciona un método robusto para aislar y estudiar varios tipos de la célula de la CNS de cerebros de larvas de pez cebra. Esto se puede aplicar para obtener una comprensión más profunda de estas células durante el desarrollo, así como para estudiar su papel en la enfermedad.

Conocimiento en el desarrollo del cerebro y enfermedades cerebrales ha mejorado significativamente en la última década desde la primera cuantificación de transcriptomas de cerebro de ratón1. De hecho, análisis de expresión génica amplia genoma nos da acceso a toda la información genética en el tejido cerebral y las células que pueden complementar y mejorar observaciones con otras técnicas y herramientas.
El pez cebra es un modelo biológico potente, fácil de criar y de modificar genéticamente; su transparencia óptica en estadios larvarios permite en proyección de imagen de observaciones2. Por desgracia, en comparación al humano y ratón, el número de anticuerpos disponibles para realizar tinción de inmuno es bastante baja. Para remediar esto, líneas de pesca de pez cebra transgénico se hacen fácilmente modificando genéticamente pescado para expresar proteínas fluorescentes bajo promotores específicos de tipo celular. Líneas de pez cebra transgénico se han utilizado en el pasado para estudiar la función de macrófagos y microglia durante el desarrollo del sistema nervioso central (SNC) y enfermedad3,4,5,6. Sin embargo, para obtener una comprensión detallada de estos procesos tenemos que entender los cambios en la expresión génica en los tipos respectivos de la célula. Para ello, hemos desarrollado un método experimental para aislar específicamente células como neuronas, macrófagos y microglia de 3 a 8 días cerebros de larvas de pez cebra de la fertilización (dpf). Para el establecimiento del Protocolo, hemos trabajado con líneas de peces transgénicos que expresan la proteína verde fluorescente (GFP) en los macrófagos/microglía bajo el promotor del gen expresado en macrófagos (mpeg1:eGFP) y DsRed en las neuronas bajo la ß-tubulina neural promotor (NBT:DsRed)7,8,9. Además, se realizó tinción de inmuno de microglia 4 en 4, un anticuerpo monoclonal de ratón que tiñe específicamente el pez cebra microglia10,11. Luego, el ácido ribonucleico (ARN) se extrae de estas células más reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (qPCR) o análisis de transcriptoma. Este protocolo ha sido diseñado eficientemente homogeneizar el tejido de cerebro de larvas de pez cebra; recoger las neuronas, los macrófagos/microglía y microglia sin alteración de su integridad de la membrana plasmática y finalmente extraer RNA de estas células en alta calidad (RIN > 7) y la cantidad para realizar el análisis genómico. A diferencia de los estudios previamente publicados que utilizan tratamiento de tripsina a 37 ° C para digerir tejido de cerebro12,13, este protocolo promueve el trabajo a 4 ° C hasta el paso de extracción de RNA para reducir modificaciones del perfil de expresión génica. Este paso es crucial como microglia y macrófagos son las células sensibles que responden a los cambios en su microambiente inmediato alterando sus genes expresión perfil y polarización14,15, 16.
El protocolo, que se describe aquí en detalle, muestra que el aislamiento de las neuronas, macrófagos y microglia del cerebro larvas de pez cebra, que prácticamente, se puede adaptar a cualquier otra célula presente en el cerebro - mediante líneas de peces transgénicos o etiquetados con anticuerpos específicos. Este método permite una mejor caracterización de células del SNC a través de sus análisis de expresión del gen amplia de genoma y ayudará a entender su papel durante el desarrollo y enfermedades cerebrales.

<table><tbody><tr><td>1-phenyl 2-thiourea (PTU)</td><td>Sigma</td><td>P7629</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Gibco</td><td>15630-056</td><td></td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td>Sigma</td><td>G8644-100ML</td><td></td></tr><tr><td>HBSS 1X</td><td>Gibco</td><td>14170-088</td><td></td></tr><tr><td>Percoll</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0891-02</td><td></td></tr><tr><td>HBSS 10X</td><td>Gibco</td><td>14180-046</td><td></td></tr><tr><td>DPBS 1X</td><td>Gibco</td><td>14190-094</td><td></td></tr><tr><td>Tricaine (MS222)</td><td>Sigma</td><td>A5040</td><td></td></tr><tr><td>Sterilin standard 90mm petri dishes</td><td>ThermoFisher</td><td>101VIRR</td><td></td></tr><tr><td>Surgical micro-scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-00</td><td></td></tr><tr><td>3 mL Pasteur plastic bulk pipette</td><td>SLS</td><td>PIP4206</td><td></td></tr><tr><td>Glass homogenizer</td><td>Wheaton</td><td>357538</td><td></td></tr><tr><td>Sterilin standard 55mm petri dishes</td><td>ThermoFisher</td><td>P55V</td><td></td></tr><tr><td>Percoll</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0891-02</td><td></td></tr><tr><td>40 &amp;micro;m cell strainer</td><td>Falcon</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>50 ml polypropylen conical tube</td><td>Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5804 R</td><td></td></tr><tr><td>10 mL syringe</td><td>BD</td><td>302188</td><td></td></tr><tr><td>Needle 23G x 1&#039;&#039;</td><td>BD</td><td>300800</td><td></td></tr><tr><td>Normal goat serum (NGS)</td><td>Cell Signalling</td><td>5425S</td><td></td></tr><tr><td>35 &amp;mu;m cell strainer cap</td><td>BD</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>FACS tubes</td><td>BD</td><td>352063</td><td></td></tr><tr><td>Low Endotoxin, Azide-Free (LEAF)</td><td>Biolegend</td><td>101321</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 Goat Anti-Mouse IgG (H+L)</td><td>Life Technologies</td><td>A11008</td><td></td></tr><tr><td>Anti-4C4</td><td>Courtesy of Catherina Becker (University of Edinburgh)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FACS sorter FACSAria II</td><td>BD</td><td>QMRI, FACS facility</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy Plus Micro Kit</td><td>QIAGEN</td><td>74034</td><td></td></tr><tr><td>&amp;beta;-mercaptoethanol</td><td>Gibco</td><td>&amp;nbsp;31350-010</td><td></td></tr><tr><td>QIAshredder</td><td>QIAGEN</td><td>79654</td><td></td></tr><tr><td>SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix</td><td>Bio-Rad</td><td>1725271</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript III First-Strand Synthesis System</td><td>Invitrogen</td><td>18080-051</td><td></td></tr><tr><td>LightCycler 96 Real-Time PCR System&amp;nbsp;</td><td>Roche</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ovation RNA-Seq System V2</td><td>NuGEN</td><td>7102-32</td><td></td></tr><tr><td>Agilent RNA 6000 Pico reagents</td><td>Agilent</td><td>5067-1513</td><td></td></tr><tr><td>2100 Bioanalyzer</td><td>Agilent</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RNaseZap</td><td>Ambion</td><td>AM9780</td><td></td></tr></tbody></table>

isolation and rna extraction of neurons, macrophages and microglia from larval zebrafish brains

Para obtener una comprensión detallada del papel de diferentes células del SNC durante el desarrollo o el establecimiento y progresión de las patologías del cerebro, es importante aislar estas células sin modificar su perfil de expresión génica. El modelo de pez cebra ofrece un gran número de líneas de peces transgénicos en los que se etiquetan tipos celulares específicos; por ejemplo las neuronas de la línea de NBT:DsRed o los macrófagos/microglía en la línea de mpeg1:eGFP. Además, se han desarrollado anticuerpos para teñir células específicas, tales como la microglia con el 4 4 anticuerpos.
Aquí, describimos el aislamiento de las neuronas, macrófagos y microglia del cerebro larvas de pez cebra. Este protocolo es la evitación de una digestión enzimática del tejido a 37 ° C, que podría modificar perfiles celulares. En su lugar se utiliza un sistema mecánico de homogeneización de tejidos a 4 º C. Este protocolo implica homogeneización de cerebros en suspensión de células, su inmuno-tinción y el aislamiento de las neuronas, macrófagos y microglía por FACS. Luego, se extrajeron RNA de esas células y evaluaron su calidad o cantidad. Logramos obtener ARN de alta calidad (número de integridad del RNA (RIN) > 7) para llevar a cabo la qPCR en el análisis de los macrófagos/microglía y neuronas y transcriptómicos de microglia. Este enfoque permite una mejor caracterización de estas células, así como una comprensión más clara sobre su papel en el desarrollo y patologías.

El protocolo descrito es un método sencillo para aislar a las neuronas, macrófagos y microglia del cerebro larvas de pez cebra. De estos aislados células, cantidades significativas de alta calidad (RIN > 7) se obtuvieron RNA. El objetivo de este protocolo es aislar a diferentes tipos de células del SNC, con la mínima modificación de su perfil de expresión génica para analizar y caracterizar las funciones y propiedades de celda. Por lo tanto, el conjunto del Protocolo se lleva a cabo a 4 ° C con una homogeneización del tejido de cerebro mecánico. Este método se ha utilizado con éxito para dos estudios realizados en el laboratorio. En el primer estudio, las neuronas y los macrófagos/microglía fueron aislados de 8 PD mpeg1:eGFP+/NBT:DsRed+ larvas (figura 1). FACS permitida la separación de células de residuos en función de su tamaño (FSC-A) y detalle (SSC-A) (figura 1A). Las células fueron separadas luego de Dobletes o aglomeraciones de células (figura 1B). De la población de la célula, una puerta fue dibujada para eliminar células muertas (DAPI+). La trama de punto correspondiente reveló que este protocolo experimental conserva la integridad de membrana plasmática de la célula, como la tasa de células muertas es sólo el 26.7% (figura 1C). Finalmente, las neuronas (DsRed+) y los macrófagos/microglía (GFP+) fácilmente fueron separados de las puertas de la población de células vivas. La población de neuronas (23,1%) parece ser más prominente que la población de macrófagos/microglía (1.56%) dentro del cerebro (figura 1D). Este protocolo ha permitido para aislar ARN de las células para llevar a cabo análisis de qPCR posteriores para comparar la expresión de genes específicos entre las neuronas y los macrófagos/microglía. Figura 2 se muestra neuronal y niveles de expresión de gene de los macrófagos/microglía del antígeno nuclear de proliferación celular (pcna)contra el gen de mantenimiento de la casa β-actina como ejemplo.
Para el segundo estudio este método centrado en aislamiento microglia del cerebro larvas de 3, 5 y 7 PD. En contraste con el experimento descrito anteriormente, las células fueron aisladas por inmuno-tinción 4 en 4, un anticuerpo que específicamente etiquetas microglia (figura 3 A-D). Como se describió anteriormente, microglía (4 de 4+) fueron seleccionados de células vivas y recogidas (figura 3D). Números de la microglia en cerebros de larvas de pez cebra son variables (tabla 1) y muy baja en PD 3 (∼ 25 por peces). Calidad y cantidad de ARN extraído de las células se midieron utilizando un sistema de electroforesis capilar en. Resultados obtenidos del ARN extraído de microglía del cerebro de larvas de pez cebra de PD 5 se han proporcionado para ilustrar un ejemplo de análisis de ARN (tabla 1 (PD 5, experimento 4)). La figura 4 muestra el rastro de la electroforesis y su representación gráfica obtenida para esta muestra con una visualización clara del ARN ribosomal (28s y 18s). Este dato es necesario para calcular la muestra de RIN y para determinar la concentración de RNA. La tabla 1 resume el número de microglía aislado por el pescado, la cantidad de RNA por la microglia y la puntuación de RIN obtenida para cada experimento diferentes en PD 3, 5 y 7. La cantidad y la calidad del ARN extraído de microglia aislado usando este método nos permitieron amplificar el RNA en cDNA usando un kit. Pruebas de calidad y la cantidad proporcionadas por genómica de Edimburgo confirman que el cDNA amplificado es de calidad suficiente para la preparación de la biblioteca y posterior secuenciación. La figura 5 muestra la distribución de tamaño de fragmentos de cDNA y su cantidad medida usando un sistema electroforético. En este ejemplo, el cDNA tenía un tamaño medio de 299bp a una concentración de 36100 pmol/l. tabla 2 ilustra respectivamente pruebas de calidad y la cantidad de cDNA amplificado de muestras de RNA (tabla 1 (PD 5, experimento 4)). El cDNA amplificado se ha utilizado con éxito para la secuencia.
Varios estudios realizados en el laboratorio confirmaron que la calidad y la cantidad de ARN extraído de las neuronas, macrófagos y microglia pueden utilizarse para qPCR posteriores y análisis de expresión del gene amplia de genoma. Por lo tanto, este protocolo experimental puede utilizarse para aislar confiablemente diferentes tipos de células del SNC sin alterar su integridad de la membrana y limitar la modificación de su perfil de expresión génica.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57431/57431fig1.jpg"> Figura 1 : FACS clasificación de las neuronas y los macrófagos/microglía de /NBT:DsRed mpeg1:GFP++ 8 larvas de pez cebra PD. (A-C) Gating sucesivas muestra selección secuencial de todo cerebro células (A), dispersión de las células por dispersión hacia delante y lateral (B). Las células c muertos fueron excluidas por DAPI etiquetado. (D) las neuronas y los macrófagos/microglía se identificaron respectivamente por la coloración positiva DsRed y GFP. <a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57431/57431fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57431/57431fig2.jpg"> Figura 2 : Análisis de expresión génica para pcna y β-actina en las neuronas y los macrófagos/microglía. ARN de neuronas aisladas y los macrófagos/microglía se puede transcribir en cDNA para el uso en análisis cuantitativo por PCR. niveles de expresión de mRNA de pcna contra β-actina mantenimiento gene en neuronas aisladas y los macrófagos/microglía determinado por qPCR (N = 3). Doble cambio se midió utilizando el método comparativo (ΔΔCT). Error de la barra representan media ± SEM. <a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57431/57431fig2large.jpg" target="_blank">haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57431/57431fig3.jpg"> Figura 3 : FACS clasificación de microglia de 3 larvas de pez cebra PD. (A-C) Bloquea sucesivas Mostrar selección secuencial del cerebro todas las células (A), dispersión de las células por dispersión hacia delante y lateral (B). Las células c muertos fueron excluidas por DAPI etiquetado. (D) Microglia se identificaron 4 4 tinción positiva. <a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57431/57431fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57431/57431fig4.jpg"> Figura 4 : Resultados de electroforesis capilar de ARN extraído de microglia de pez cebra de PD 5. Los dos altos picos son el ARN ribosomal 18S y 28S. Número de integridad del RNA (RIN) fue calculado automáticamente por el software bioanalyzer usando la relación generada entre el 18S y 28S ribosomal subunidades y el análisis de la traza entera electroforético. Microglia ARN tiene un 8.6 de RIN. <a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57431/57431fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57431/57431fig5.jpg"> Figura 5 : Pruebas de calidad y la cantidad de cDNA amplificado de muestras de RNA de la microglía de pez cebra de PD 5. La imagen muestra la distribución de tamaño fragmento de cDNA de la muestra analizada con un tamaño promedio de 299 BP <a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57431/57431fig5large.jpg" target="_blank">haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>Condición</td>
			<td>Experimento</td>
			<td>Número de los pescados</td>
			<td>Número de células</td>
			<td>Número de células por pescado</td>
			<td>Concentración de RNA (pg/ul)</td>
			<td>ARN total (pg)</td>
			<td>Cantidad de RNA por la célula (pg)</td>
			<td>Puntuación de RIN</td>
		</tr>
<tr>
<td>3dpf</td>
			<td>1</td>
			<td>700</td>
			<td>11922</td>
			<td>17.03</td>
			<td>126</td>
			<td>1512</td>
			<td>0.13</td>
			<td>8</td>
		</tr>
<tr>
<td>3dpf</td>
			<td>2</td>
			<td>600</td>
			<td>22527</td>
			<td>37,55</td>
			<td>253</td>
			<td>3036</td>
			<td>0.13</td>
			<td>7.9</td>
		</tr>
<tr>
<td>3dpf</td>
			<td>3</td>
			<td>600</td>
			<td>18688</td>
			<td>31.15</td>
			<td>255</td>
			<td>3060</td>
			<td>0.16</td>
			<td>7.7</td>
		</tr>
<tr>
<td>3dpf</td>
			<td>4</td>
			<td>600</td>
			<td>11121</td>
			<td>18.54</td>
			<td>189</td>
			<td>2268</td>
			<td>0.20</td>
			<td>7.8</td>
		</tr>
<tr>
<td>3dpf</td>
			<td>5</td>
			<td>600</td>
			<td>15581</td>
			<td>25.97</td>
			<td>131</td>
			<td>1572</td>
			<td>0.10</td>
			<td>8.4</td>
		</tr>
<tr>
<td>3dpf</td>
			<td>6</td>
			<td>600</td>
			<td>11965</td>
			<td>19.94</td>
			<td>256</td>
			<td>3072</td>
			<td>0.26</td>
			<td>8.2</td>
		</tr>
<tr>
<td>5dpf</td>
			<td>1</td>
			<td>600</td>
			<td>58629</td>
			<td>97.72</td>
			<td>362</td>
			<td>4344</td>
			<td>0.07</td>
			<td>7.4</td>
		</tr>
<tr>
<td>5dpf</td>
			<td>2</td>
			<td>600</td>
			<td>32510</td>
			<td>54.18</td>
			<td>348</td>
			<td>4176</td>
			<td>0.13</td>
			<td>8.1</td>
		</tr>
<tr>
<td>5dpf</td>
			<td>3</td>
			<td>600</td>
			<td>77884</td>
			<td>129.81</td>
			<td>594</td>
			<td>7128</td>
			<td>0.09</td>
			<td>8.3</td>
		</tr>
<tr>
<td>5dpf</td>
			<td>4</td>
			<td>600</td>
			<td>50755</td>
			<td>84.59</td>
			<td>305</td>
			<td>3660</td>
			<td>0.07</td>
			<td>8.6</td>
		</tr>
<tr>
<td>5dpf</td>
			<td>5</td>
			<td>600</td>
			<td>44967</td>
			<td>74.95</td>
			<td>134</td>
			<td>1608</td>
			<td>0.04</td>
			<td>7.6</td>
		</tr>
<tr>
<td>5dpf</td>
			<td>6</td>
			<td>600</td>
			<td>51031</td>
			<td>85.05</td>
			<td>163</td>
			<td>1956</td>
			<td>0.04</td>
			<td>7.9</td>
		</tr>
<tr>
<td>7dpf</td>
			<td>1</td>
			<td>600</td>
			<td>60496</td>
			<td>100.83</td>
			<td>183</td>
			<td>2196</td>
			<td>0.04</td>
			<td>7.6</td>
		</tr>
<tr>
<td>7dpf</td>
			<td>2</td>
			<td>450</td>
			<td>55517</td>
			<td>123.37</td>
			<td>183</td>
			<td>2196</td>
			<td>0.04</td>
			<td>7.8</td>
		</tr>
<tr>
<td>7dpf</td>
			<td>3</td>
			<td>600</td>
			<td>88897</td>
			<td>148.16</td>
			<td>465</td>
			<td>5580</td>
			<td>0.06</td>
			<td>8.1</td>
		</tr>
<tr>
<td>7dpf</td>
			<td>4</td>
			<td>600</td>
			<td>63008</td>
			<td>105.01</td>
			<td>356</td>
			<td>4272</td>
			<td>0.07</td>
			<td>8.4</td>
		</tr>
<tr>
<td>7dpf</td>
			<td>5</td>
			<td>350</td>
			<td>34956</td>
			<td>99.87</td>
			<td>245</td>
			<td>2940</td>
			<td>0.08</td>
			<td>8.1</td>
		</tr>
<tr>
<td>7dpf</td>
			<td>6</td>
			<td>600</td>
			<td>63887</td>
			<td>106.48</td>
			<td>341</td>
			<td>4092</td>
			<td>0.06</td>
			<td>7.8</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabla 1: Resumen de microglia aislamiento y datos de extracción de RNA de las larvas de pez cebra de PD 3, 5 y 7.
<table fo:font-size="7" fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>ID de muestra interna</td>
			<td>ID de muestra externo</td>
			<td>Qubit (ng/ul)</td>
			<td>Qubit(NG/UL)</td>
			<td>Concentración media (ng/ul)</td>
			<td>Volumen (ul)</td>
			<td>recibido de la UG</td>
			<td>Pasa/no pasa para la concentración mínima</td>
			<td>Pasa/no pasa para la mínimo cantidad</td>
			<td>Pasa/no pasa para la cantidad recomendada</td>
		</tr>
<tr>
<td>10907SD0010</td>
			<td>5 PD (experimento 4)</td>
			<td>58.8</td>
			<td>58.4</td>
			<td>58.6</td>
			<td>30</td>
			<td>1.76</td>
			<td>Pasar</td>
			<td>Pasar</td>
			<td>Pasar</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="10">Requisitos de la muestra para la preparación de la biblioteca:</td>
		</tr>
<tr>
<td>Preparación de la biblioteca</td>
			<td>Cantidad mínima (ng)</td>
			<td>Cantidad recomendada (ng)</td>
			<td>Mínima concentración ng/uL</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>TruSeq Nano gel biblioteca de insertar bp 350 libre de cDNA</td>
			<td>600</td>
			<td>1100</td>
			<td>10</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
</tbody></table>Tabla 2: Pruebas de la cantidad de cDNA amplificado de muestras de RNA de la microglía de pez cebra de PD 5.

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Isolation and RNA Extraction of Neurons, Macrophages and Microglia from Larval Zebrafish Brains

Aislamiento y extracción de ARN de las neuronas, macrófagos y Microglia de cerebros de larvas de pez cebra

Presentamos un protocolo para aislar a las neuronas, macrófagos y microglia del cerebro de pez cebra larvas bajo condiciones fisiológicas y patológicas. Al aislamiento, el RNA se extrae de estas células a analizar su perfil de expresión génica. Este protocolo permite la colección de ARN de alta calidad para realizar análisis posteriores como qPCR y transcriptómica.

To gain a detailed understanding of the role of different CNS cells during development or the establishment and progression of brain pathologies, it is ...

isolation-rna-extraction-neurons-macrophages-microglia-from-larval

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

13.7K vistas.  University of Edinburgh. Presentamos un protocolo para aislar a las neuronas, macrófagos y microglia del cerebro de pez cebra larvas bajo condiciones fisiológicas y patológicas. Al aislamiento, el RNA se extrae de estas células a analizar su perfil de expresión génica. Este protocolo permite la colección de ARN de alta calidad para realizar análisis posteriores como qPCR y transcriptómica.

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Isolation and Culture of Adult Zebrafish Brain-derived Neurospheres

The zebrafish is a highly relevant model organism for understanding the cellular and molecular mechanisms involved in neurogenesis and brain regeneration in vertebrates. However, an in-depth analysis of the molecular mechanisms underlying zebrafish adult neurogenesis has been limited due to the lack of a reliable protocol for isolating and culturing neural adult stem/progenitor cells. Here we provide a reproducible method to examine adult neurogenesis using a neurosphere assay derived from zebrafish whole brain or from the telencephalon, tectum and cerebellum regions of the adult zebrafish brain. The protocol involves, first the microdissection of zebrafish adult brain, then single cell dissociation and isolation of self-renewing multipotent neural stem/progenitor cells. The entire procedure takes eight days. Additionally, we describe how to manipulate gene expression in zebrafish neurospheres, which will be particularly useful to test the role of specific signaling pathways during adult neural stem/progenitor cell proliferation and differentiation in zebrafish.

Here we provide a reproducible method to examine adult neurogenesis using a neurosphere assay derived from the whole brain or from either the telencephalic, tectal or cerebellar regions of the adult zebrafish brain. Additionally, we describe the procedure to manipulate gene expression in zebrafish neurospheres.

Aislamiento y cultivo de neuroesferas derivada de cerebro de adultos de pez cebra

The zebrafish is a highly relevant model organism for understanding the cellular and molecular mechanisms involved in neurogenesis and brain regeneration ...

Investigación

Biología del Desarrollo

Culture and Transfection of Zebrafish Primary Cells

Zebrafish embryos are transparent and develop rapidly outside the mother, thus allowing for excellent in vivo imaging of dynamic biological processes in an intact and developing vertebrate. However, the detailed imaging of the morphologies of distinct cell types and subcellular structures is limited in whole mounts. Therefore, we established an efficient and easy-to-use protocol to culture live primary cells from zebrafish embryos and adult tissue.
In brief, 2 dpf zebrafish embryos are dechorionated, deyolked, sterilized, and dissociated to single cells with collagenase. After a filtration step, primary cells are plated onto glass bottom dishes and cultivated for several days. Fresh cultures, as much as long term differenciated ones, can be used for high resolution confocal imaging studies. The culture contains different cell types, with striated myocytes and neurons being prominent on poly-L-lysine coating. To specifically label subcellular structures by fluorescent marker proteins, we also established an electroporation protocol which allows the transfection of plasmid DNA into different cell types, including neurons. Thus, in the presence of operator defined stimuli, complex cell behavior, and intracellular dynamics of primary zebrafish cells can be assessed with high spatial and temporal resolution. In addition, by using adult zebrafish brain, we demonstrate that the described dissociation technique, as well as the basic culturing conditions, also work for adult zebrafish tissue.

We present an efficient and easy-to-use protocol for preparing primary cell cultures of zebrafish embryos for transfection and live cell imaging as well as a protocol to prepare primary cells from adult zebrafish brain.

Cultura y transfección de células primarias de pez cebra

Zebrafish embryos are transparent and develop rapidly outside the mother, thus allowing for excellent in vivo imaging of dynamic biological processes in ...

RNA Isolation from Embryonic Zebrafish and cDNA Synthesis for Gene Expression Analysis

Many important and complex laboratory procedures require an input of high quality, intact RNA.  A degraded sample or the presence of impurities can lead to disastrous results in downstream experimental applications.  It is therefore, of utmost importance to use solid techniques with numerous safeguards and quality control checks to ensure a superior sample.  Herein, we detail a protocol to isolate total RNA from whole zebrafish embryos using a commercially available chemical denaturant and subsequent cleanup to remove traces of DNA and impurities using a commercial RNA isolation kit. As RNA is relatively unstable and easily prone to cleavage by RNAses, most protocols assay gene expression using a cDNA product that is directly synthesized from an RNA template. We detail a procedure to convert RNA into the more stable cDNA product using a commercially available kit. Throughout these procedures there are numerous quality control checks to ensure that the sample is not degraded or contaminated.  The end product of these protocols is cDNA that is suitable for microarray analysis, RT-PCR or long-term storage.    

The isolation of high quality, intact RNA is an essential step in many laboratory protocols. Here, we demonstrate RNA extraction from whole zebrafish embryos and cDNA synthesis for subsequent application in various experimental procedures including gene expression microarray analysis.

Aislamiento del ARN de síntesis embrionarias pez cebra y el cDNA de análisis de expresión génica

Many important and complex laboratory procedures require an input of high quality, intact RNA.  A degraded sample or the presence of impurities can lead ...

Biología

Procesamiento de células intestinales de larvas de pez cebra para la secuenciación de ARN unicelular

Gut Isolation from Zebrafish Larvae for Single-cell RNA Sequencing

The gastrointestinal (GI) tract performs a range of functions essential for life. Congenital defects affecting its development can lead to enteric neuromuscular disorders, highlighting the importance to understand the molecular mechanisms underlying GI development and dysfunction. In this study, we present a method for gut isolation from zebrafish larvae at 5 days post fertilization to obtain live,&#160;viable cells which can be used for single-cell RNA sequencing (scRNA-seq) analysis. This protocol is based on the manual dissection of the zebrafish intestine, followed by enzymatic dissociation with papain. Subsequently, cells are submitted to fluorescence-activated cell sorting, and viable cells are collected for scRNA-seq. With this method, we were able to successfully identify different intestinal cell types, including epithelial, stromal, blood, muscle, and immune cells, as well as enteric neurons and glia. Therefore, we consider it to be a valuable resource for studying the composition of the GI tract in health and disease, using the zebrafish.

Autor destacado: Aislamiento y análisis de células intestinales de larvas de pez cebra para investigar los aspectos transcriptómicos del desarrollo gastrointestinal 

Here, we describe a method for gut isolation from zebrafish larvae at 5 days post fertilization, for single-cell RNA sequencing analysis.

Aislamiento intestinal de larvas de pez cebra para la secuenciación de ARN de una sola célula

The gastrointestinal (GI) tract performs a range of functions essential for life. Congenital defects affecting its development can lead to enteric ...

Isolation of Region-specific Microglia from One Adult Mouse Brain Hemisphere for Deep Single-cell RNA Sequencing

As resident macrophages in the central nervous system, microglia actively control brain development and homeostasis, and their dysfunctions may drive human diseases. Considerable advances have been made to uncover the molecular signatures of homeostatic microglia as well as alterations of their gene expression in response to environmental stimuli. With the advent and maturation of single-cell genomic methodologies, it is increasingly recognized that heterogenous microglia may underlie the diverse roles they play in different developmental and pathological conditions. Further dissection of such heterogeneity can be achieved through efficient isolation of microglia from a given region of interest, followed by sensitive profiling of individual cells. Here, we provide a detailed protocol for the rapid isolation of microglia from different brain regions in a single adult mouse brain hemisphere. We also demonstrate how to use these sorted microglia for plate-based deep single-cell RNA sequencing. We discuss the adaptability of this method to other scenarios and provide guidelines for improving the system to accommodate large-scale studies.

We provide a protocol for isolation of microglia from different dissected regions of an adult mouse brain hemisphere, followed by semi-automated library preparation for deep single-cell RNA sequencing of full-length transcriptomes. This method will help to elucidate functional heterogeneity of microglia in health and disease.

Aislamiento de microglia específica de la región del hemisferio cerebral de un ratón adulto para la secuenciación profunda del ARN de una sola célula

As resident macrophages in the central nervous system, microglia actively control brain development and homeostasis, and their dysfunctions may drive ...

Neurociencias

RNA Isolation from Cell Specific Subpopulations Using Laser-capture Microdissection Combined with Rapid Immunolabeling

Laser capture microdissection (LCM) allows the isolation of specific cells from thin tissue sections with high spatial resolution. Effective LCM requires precise identification of cells subpopulations from a heterogeneous tissue. Identification of cells of interest for LCM is usually based on morphological criteria or on fluorescent protein reporters. The combination of LCM and rapid immunolabeling offers an alternative and efficient means to visualize specific cell types and to isolate them from surrounding tissue. High-quality RNA can then be extracted from a pure cell population and further processed for downstream applications, including RNA-sequencing, microarray or qRT-PCR. This approach has been previously performed and briefly described in few publications. The goal of this article is to illustrate how to perform rapid immunolabeling of a cell population while keeping RNA integrity, and how to isolate these specific cells using LCM. Herein, we illustrated this multi-step procedure by immunolabeling and capturing dopaminergic cells in brain tissue from one-day-old mice. We highlight key critical steps that deserve special consideration. This protocol can be adapted to a variety of tissues and cells of interest. Researchers from different fields will likely benefit from the demonstration of this approach.

Gene expression analysis of a subset of cells in a specific tissue represents a major challenge. This article describes how to isolate high-quality total RNA from a specific cell population by combining a rapid immunolabeling method with laser capture microdissection.

Aislamiento de ARN a partir de células subpoblaciones específicas utilizando láser captura Microdissection Combinado con Rapid Immunolabeling

Laser capture microdissection (LCM) allows the isolation of specific cells from thin tissue sections with high spatial resolution. Effective LCM requires ...

Brain Ventricular Microinjections of Lipopolysaccharide into Larval Zebrafish to Assess Neuroinflammation and Neurotoxicity

Neuroinflammation is a key player in various neurological disorders, including neurodegenerative diseases. Therefore, it is of great interest to research and develop alternative in vivo neuroinflammation models to understand the role of neuroinflammation in neurodegeneration. In this study, a larval zebrafish model of neuroinflammation mediated by ventricular microinjection of lipopolysaccharide (LPS) to induce an immune response and neurotoxicity was developed and validated. The transgenic zebrafish lines elavl3:mCherry, ETvmat2:GFP, and mpo:EGFP were used for real-time quantification of brain neuron viability by fluorescence live imaging integrated with fluorescence intensity analysis. The locomotor behavior of zebrafish larvae was recorded automatically using a video-tracking recorder. The content of nitric oxide (NO), and the mRNA expression levels of inflammatory cytokines including interleukin-6 (IL-6), interleukin-1&#946; (IL-1&#946;), and human tumor necrosis factor &#945; (TNF-&#945;) were investigated to assess the LPS-induced immune response in the larval zebrafish head. At 24 h after the brain ventricular injection of LPS, loss of neurons and locomotion deficiency were observed in zebrafish larvae. In addition, LPS-induced neuroinflammation increased NO release and the mRNA expression of IL-6, IL-1&#946;, and TNF-&#945; in the head of 6 days post fertilization (dpf) zebrafish larvae, and resulted in the recruitment of neutrophils in the zebrafish brain. In this study, injection of zebrafish with LPS at a concentration of 2.5-5 mg/mL at 5 dpf was determined as the optimum condition for this pharmacological neuroinflammation assay. This protocol presents a new, quick, and efficient methodology for brain ventricle microinjection of LPS to induce LPS-mediated neuroinflammation and neurotoxicity in a zebrafish larva, which is useful for studying neuroinflammation and could also be used as a high-throughput in vivo drug screening assay.

This protocol demonstrates the microinjection of lipopolysaccharide into the brain ventricular region in a zebrafish larval model to study the resulting neuroinflammatory response and neurotoxicity.

Microinyecciones ventriculares cerebrales de lipopolisacárido en larvas de pez cebra para evaluar la neuroinflamación y la neurotoxicidad

Neuroinflammation is a key player in various neurological disorders, including neurodegenerative diseases. Therefore, it is of great interest to research ...

Nuclei Isolation from Whole Tissue using a Detergent and Enzyme-Free Method

High-throughput transcriptome and epigenome profiling requires preparation of a single cell or single nuclei suspension. Preparation of the suspension with&#160;intact cell or nuclei involves dissociation and permeabilization, steps that can introduce unwanted noise and undesirable damage. Particularly, certain cell-types such as neurons are challenging to dissociate into individual cells. Additionally, permeabilization of the cellular membrane to release nuclei requires optimization by trial-and-error, which can be time consuming, labor intensive and financially nonviable. To enhance the robustness and reproducibility of sample preparation for high-throughput sequencing, we describe a rapid enzyme and detergent-free column-based nuclei isolation method. The protocol enables efficient isolation of nuclei from the entire zebrafish brain within 20 minutes. The isolated nuclei display intact nuclear morphology and low propensity to aggregate. Further, flow cytometry allows nuclei enrichment and clearance of cellular debris for downstream application. The protocol, which should work on soft tissues and cultured cells, provides a simple and accessible method for sample preparation that can be utilized for high-throughput profiling, simplifying the steps required for successful single-nuclei RNA-seq and ATAC-seq experiments.

Single nuclei isolation relies on dissociation and detergent-based permeabilization of the cell membrane, steps that need optimization and are prone to introducing technical artifacts. We demonstrate a detergent and enzyme-free protocol for rapid isolation of intact nuclei directly from whole tissue, yielding nuclei suitable for single-nucleus RNA-seq (snRNA-Seq) or ATAC-seq.

Aislamiento de núcleos de tejido entero utilizando un método de detergente y libre de enzimas

High-throughput transcriptome and epigenome profiling requires preparation of a single cell or single nuclei suspension. Preparation of the suspension ...

Aislamiento y extracción de ARN de las neuronas, macrófagos y Microglia de cerebros de larvas de pez cebra

Resumen

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