Agradecemos ao Dr. Michael Wooten por sua ajuda na preparação do manuscrito. Este trabalho foi financiado pelo NIH 2RO1NS033661 (MWW).

1. Set-up antes da colheita <ol><li> Para gerar filhotes de pré-natal para a colheita neurônio, agendar cruzamento entre camundongos adultos de 19 dias antes do dia de isolamento do neurônio. (C57BL / 6 idades de 2-8 meses, foram usados ​​em acasalamentos para efeitos de desenvolver este protocolo). Acasalamento bem sucedida pode ser confirmado por detecção de um rolhão vaginal na confirmação palpitação, fêmea ou visual da gravidez. </li><li> O dia antes do isolamento do neurônio: <ol class="ualpha"><li> Para aplicações de imunofluorescência, lamelas de vidro em revestimento de uma placa de 24 cavidades com uma camada leve de 03:01 Collagen 1, cauda de rato: poli-D-Lisina solução. </li><li> Para aplicações de cultura de células, o revestimento de tamanho apropriado do tecido utensílios de plástico de cultura com uma camada leve de 3:1 Collagen 1, cauda de rato: poli-D-Lisina solução. </li></ol></li><li> Descanse as placas descobertos em uma capa de cultura de tecidos sob a luz UV durante a noite. </li><li> Lavar as placas com Hank estéril de Solução Salina Equilíbrio (HBSS) antesde usar. Placas revestidas podem ser preenchidos com HBSS e armazenado até uma semana a 4 ° C no escuro. </li></ol> 2. Colheita de Tecidos <ol><li> A esterilidade é sempre um fator quando crescer culturas celulares primárias e, como tal, o maior cuidado deve ser exercido para garantir o ambiente mais estéril possível. Com muita atenção à técnica estéril, dissecção inicial e colheita de tecido neural para este protocolo pode ser concluído fora de uma câmara de fluxo laminar com um risco mínimo de contaminação. Após a colheita inicial, todas as etapas subsequentes devem ser realizados sob condições estéreis máximos dentro de uma capa classificado para cultura de células. </li><li> Euthanize um rato grávida de aproximadamente 19 dias pós-fertilização por decapitação. A utilização de anestesia a eutanásia a fêmea grávida não é recomendada como anestesia é conhecido por causar a morte das células do cérebro (Stratmann, et al., 2010). Usando estéreis tesoura de dissecção e pinças, criar uma abertura no lado ventral domouse para revelar completamente cavidade do corpo. Os instrumentos podem ser esterilizados com álcool e uma chama aberta. </li><li> Filhotes de pré-natal será localizado para a parte posterior da cavidade do rato corpo e devem ser facilmente visíveis no útero. Com uma pinça estéril, autoclavada, abra o útero e remover filhotes. Decapitar filhotes com novas tesouras estéreis e cabeça no lugar removido gaze estéril sob um microscópio de dissecação. Estéreis, instrumentos autoclavados pode ser chama limpa utilizando álcool e uma chama aberta antes e durante a utilização. </li><li> Com uma tesoura estéreis ou crânio, bisturi aberto de filhote de trás do pescoço até o nariz. Este procedimento pode normalmente ser completado com a inserção uma ponta da tesoura dentro do forame vertebral e, em seguida, proceder anteriormente. Retire cuidadosamente o cérebro inteiro com uma pinça. Coloque o cérebro em gaze estéril. Usando um bisturi estéril, remover o cerebelo e incisão para baixo da linha média do cérebro para separá-lo em dois hemisférios (Figura 1)<html> . </li><li> Segure uma pequena seção de meninges em torno do hipocampo com pinças esterilizadas e puxe-o suavemente para longe. Embora não seja estritamente necessário para remover as meninges antes de isolar o hipocampo, a presença das meninges pode fazer a dissecção do hipocampo mais difícil devido à dureza da membrana. Em ambos os casos, o hipocampo será mais claramente visível após as meninges foram removidos. O hipocampo é uma estrutura curva que se inicia na parte distal do hemisfério e se dobra ventralmente (Figura 2). Como o interior, lado, côncava (caudal) está enfrentando um ventrículo, já é livre. Portanto, para isolar o hipocampo, uma precisa para cortar ao longo do lado exterior convexa. Após a dissecção, levantar delicadamente cada hipocampos com uma pinça estéreis e de transferência em um pequeno prato de cultura de tecido com aquecidos (37 ° C) HBSS sob uma capa de cultura de células. O tecido do cérebro podem ser combinados a partir de filhotes de múltiplas. </li></ol>&quot;&gt; 3. Tissue dissociação <ol><li> Usando um bisturi estéril, o tecido cerebral suavemente mince em 3 ml de HBSS estéril num prato de cultura 100 milímetros de Tecido. </li><li> Transferir o tecido picadas e HBSS para um tubo de 15 ml. Adicionar 1,5 ml de HBSS e 0,5 ml de solução de tripsina a 0,25% para um volume total de 5 ml. </li><li> Cap e inverter suavemente o tubo 4-5 vezes para misturar. Tentar evitar a produção de bolhas como ADN libertado a partir do tecido digerido irá aderir às bolhas e fazer com que o tecido picada para flutuar em vez de assentar no fundo do tubo (Figura 3). </li><li> Incubar tecido do hipocampo a 37 ° C durante 15 minutos, invertendo o tubo como acima cada 5 minutos. </li><li> Permitir que o tecido a assentar no fundo do tubo. </li><li> Cuidadosamente remover o excesso de solução utilizando uma pipeta estéril, deixando o tecido não perturbada no fundo do tubo. </li><li> Lavar tecido pelete com 5 ml de HBSS a 37 ° C durante 5 minutos. Repita um total de 3 vezes. Permita que o tecido completamente resolverpara a parte inferior do tubo de cada vez, antes de prosseguir para o passo de lavagem seguinte. </li><li> Remover a lavagem final a partir do tecido pelete e substituir com 2 ml de HBSS frescos. </li></ol> 4. Neuron trituração <ol><li> Antes de iniciar os passos trituração, você vai precisar para preparar fogo pipetas Pasteur polidas. Usando um queimador Bunson, mantenha uma estéril 9 polegadas pipeta de Pasteur ponta (Figura 4a) na chama até diâmetro da abertura da pipeta é de aproximadamente 0,5 mm de tamanho e arestas da abertura pipeta foram arredondados ligeiramente (Figura 4b). Permitir pipeta para esfriar completamente antes de iniciar o processo de trituração. </li><li> Usando um normal estéril 9 polegadas pipeta de Pasteur, suavemente triturar o tecido um total de 7 vezes. Pedaços maiores de tecido são normais neste ponto e deve ser deixada em repouso para o fundo do tubo antes de se mudar para o passo seguinte. </li><li> Transferir o sobrenadante para um novo tubo estéril 50 ml. </li><li&gt; Para o tecido restante, adicionar 2 ml de HBSS estéril e tritura-se um total de 5 vezes utilizando o fogo pipeta de Pasteur polida. </li><li> Permitir que todos os restantes pedaços maiores de tecido para assentar no fundo do tubo e combinar o sobrenadante com o sobrenadante anterior para um total de 4 ml dissociadas de células neuronais. </li></ol> 5. Plating célula <ol><li> Contar as células dissociadas utilizando um hemocitómetro. </li><li> Como regra geral, uma vez que os números de células foram determinados, subtrair 20% a partir de número final em conta qualquer morte celular que pode ocorrer após o plaqueamento. </li><li> As células podem ser revestida usando as recomendações abaixo: Para lamelas em uma placa de 24 poços - 6 x 10 4 células / poço em 0,5 ml Para 60 mm placas de cultura de tecidos - 4 x 10 5 células / placa em 3 ml Para 100 mm placas de cultura de tecidos - 6 x 10 células / placa de 6 em 6 ml </li><li> Misture o número de células apropriadas com o volume indicado de meios seletivos Neurobasal (NeurobasalMeios contendo B27 suplemento [1 ml / 50 ml], solução 0,5 mM de glutamina, 25 mM de glutamato (Mr 147,13 g / mol), penicilina (10.000 unidades / ml) / estreptomicina (10.000 ug / ml) [uL 250/50 ml] , 1 mM de HEPES (Mr 238,3 g / mol), 10% de calor cavalo inactivado Dador de soro) e adicionar as células a placas. Placas redemoinho suavemente para distribuir uniformemente as células. HI-Dador de soro de cavalo é adicionada aos meios sólidos para enriquecer as células durante as primeiras 24 horas de crescimento. As células são subsequentemente desmamados a partir do soro e devolvido a um ambiente isento de soro por redução de série do soro em cada substituição meios de comunicação. Deve também ser notado que, enquanto o glutamato em concentrações mais elevadas é tóxico para as culturas de células neuronais, nas concentrações mais baixas adicionado aqui, ela vai inibir a ligação de células não-neuronais 11. No entanto, só devem ser adicionados aos meios de comunicação de revestimento para as primeiras 24 horas de cultura e subsequentemente deixada de fora de quaisquer meios de alimentação para prevenir a neurotoxicidade das células. </li><li> Place neurónios a 37 ° C, 5% de CO 2 incubadora durante a noite. </li><li> Remover metade do volume dos meios de comunicação a partir das células e substituir com o mesmo volume de meios de alimentação Neurobasal (Media Neurobasal contendo B27 suplemento [1 ml / 50 ml], solução 0,5 mM de glutamina, penicilina (10.000 unidades / ml) / estreptomicina (10.000 ug / ml) [250 ul / 50 ml], 1 mM de HEPES (Mr 238,3 g / mol). </li><li> Neurónios devem ser alimentados a cada 4 dias através da remoção da metade dos meios de idade e substituindo-o com o mesmo volume de frescas meios de alimentação Neurobasal. Processos neuronais deve começar a ser visível no dia 1 (Figura 5a) e tornar-se prevalente por dia 10 (Figura 5b). </li></ol> 6. Os resultados representativos A capacidade de crescer e cultura células primárias neuronais tornou-se uma parte indispensável da neurociência. As culturas primárias permitem ao pesquisador analisar específicos celulares, modificação química e tratamento, alvo loclização e padrões de crescimento em um ambiente controlado. Muitos destes procedimentos utilizar metodologia sofisticada para visualizar mudanças específicas na respostas de células. Neste caso, neurónios do hipocampo são usados ​​para estudar específicas vias neuronais que seria difícil, se não impossível para analisar no cérebro intacto. Preparação de perto de populações homogéneas de neurónios de áreas específicas do cérebro é crítica para estudar a função cerebral. Efeitos moleculares nos neurônios individuais podem ser um instrumento para delinear as vias de ordem superior, como a memória ou aprendizagem. Como este protocolo produz culturas relativamente puras de neurónios do hipocampo, sem a necessidade de uma camada alimentadora de células gliais, estes neurónios são facilmente utilizadas para estudos de imunofluorescência. No entanto, como com toda a cultura primária de órgãos contendo vários tipos de células, alguma contaminação por células menos desejados podem ocorrer. No isolamento de células neuronais, a contaminação por células gliais pode ser um problema comum. As células da glia cum ser facilmente detectadas após visualização microscópica da cultura como sua morfologia difere significativamente dos neurónios alvo (Figura 6). O impacto da contaminação de células gliais dependerá da utilização prevista das culturas. Se as células estão sendo usados ​​de imuno-fluorescência exame, a contaminação glial pode ser nada mais do que uma inconveniência ao tentar fotografar os neurônios individuais. No entanto, se as culturas neuronais são para ser utilizadas para a análise bioquímica, qualquer contaminação significativa por células gliais poderia causar grandes alterações nos resultados. Formas de lidar com a contaminação das células da glia são descritos mais detalhadamente na discussão. Uma vez que os neurónios foram isolados com sucesso e crescidas em cultura, uma aplicação típica é examinar processos celulares imuno-fluorescência técnicas. Como ilustrado na Figura 7, organelos, tais como as mitocôndrias, podem ser coradas utilizando corantes vitais adicionados aos meios de cultura antes de fixaration. Endógenos proteínas celulares pode ser visualizada a partir de células fixas, utilizando imuno-fluorescência padrão técnicas (Figura 8). Uma vez que as células neuronais são fixos, anticorpos específicos para proteínas de interesse pode ser introduzida para a célula e estas proteínas podem ser visualizada utilizando um microscópio de fluorescência. Neurônios cultivados também fornecer o pesquisador com os meios para examinar os efeitos individuais de proteínas sobre as funções neuronais. Utilizando uma variedade de técnicas, incluindo transfecções de DNA, electroporação ou transdução virai, as proteínas podem ser superexpresso em células neuronais (Figura 9). Como neural células respondem aos efeitos do excesso de proteínas expressas podem ter consequências diretas sobre como o cérebro pode responder e oferece a possibilidade de identificar alvos celulares para os tratamentos com medicamentos. Os detalhes destes tipos de experiências de ir para além do âmbito do presente documento, mas eles não ilustram que as culturas preparados por esta técnica são adequados para uma grande variedade de baixo-saplicações TREAM. No entanto, a simplicidade global deste protocolo, bem como, o período de tempo curto necessário para preparar estas culturas neuronais tornar este um método ideal para utilização em hoje neurociência laboratório. <img alt="A Figura 1" src="/files/ftp_upload/3634/3634fig1.jpg" /> Figura 1. Dissecção do cérebro do rato pré-natal. A primeira incisão é baixo da linha média do cérebro separando-o em dois hemisférios. <img alt="A Figura 2" src="/files/ftp_upload/3634/3634fig2.jpg" /> Figura 2. Localização do hipocampo do cérebro do rato pré-natal. O corpo estriado é movido para o lado para visualizar o hipocampo e é conhecido pelo &quot;feijão&quot; curva estrutura do tipo na região distal de cada hemisfério. <img alt="A Figura 3" src="/files/ftp_upload/3634/3634fig3.jpg" /> Figura 3. Dissociação de tecido do hipocampo em solução de tripsina. <pclass = &quot;jove_content&quot;&gt; <img alt="A Figura 4" src="/files/ftp_upload/3634/3634fig4.jpg" /> A Figura 4. Pontas de pipetas de Pasteur utilizado em trituração do tecido do hipocampo. (A) normal ponta de pipeta Pasteur. (B) Fire-polido Pasteur ponta da pipeta. Tomar nota das arestas arredondadas e da diminuição de aproximadamente 50% em pipeta tamanho de abertura. <img alt="A Figura 5" src="/files/ftp_upload/3634/3634fig5.jpg" /> Figura 5. Neurônios isolados usando este procedimento e banhado em NB Media. (A) O crescimento celular 1 dia pós-revestimento. Processos neuronais começar a ser visível durante o dia 1. (B) crescimento celular 10 dias pós-regulamentação, neurites são ramificadas e sobreposições. <img alt="A Figura 6" src="/files/ftp_upload/3634/3634fig6.jpg" /> Figura 6. Neurónios do hipocampo contaminados com células gliais cultivadas durante 7 dias e coradas com o marcador MitoTracker organela Red CM-H2XRos (Invitrogen # M7515) e transfeCTED com GFP-LC3 utilizando Lipofectamine 2000 (Invitrogen # 11668019). As mitocôndrias são visíveis em todas as células no entanto, apenas um único neurónio com êxito foi transfectada com o construto fluorescente. A contaminação com células gliais faz análise de GFP-LC3 expressão nos processos neuronais difíceis de visualizar. <img alt="A Figura 7" src="/files/ftp_upload/3634/3634fig7.jpg" /> Figura 7. Neurónios do hipocampo cultivadas durante 7 dias e coradas com o marcador MitoTracker organela Red CM-H 2 Xros (Invitrogen # M7513). Este corante vital é usado para corar as mitocôndrias activa em células de cultura de tecidos. As células foram fixadas em paraformaldeído a 4% / PBS e visualizada por microscopia de fluorescência. O corante em si é não fluorescente até oxidado na mitocôndria. Mitocôndria ativa pode ser visto ao longo dos processos neuronais. <img alt="A Figura 8" src="/files/ftp_upload/3634/3634fig8.jpg" /> Figura 8. </strOng&gt; neurónios do hipocampo cultivadas durante 7 dias, fixadas com paraformaldeído a 4% / PBS e imuno-coradas com anticorpo monoclonal anti β-tubulina (Sigma # T0198). Seguindo o anticorpo primário, Oregon Verde de cabra marcado anti-rato-anticorpo secundário (Invitrogen # O11033) foi adicionado e visualizada por microscopia de fluorescência. <img alt="A Figura 9" src="/files/ftp_upload/3634/3634fig9.jpg" /> A Figura 9. Culturas neuronais do hipocampo foram cultivadas durante 5 dias e transfectadas com GFP-LC3β construção de ADN utilizando Lipofectamine 2000 (Invitrogen # 11668019). No dia 7, as células foram fixadas usando paraformaldeído a 4% / PBS e aggresomes com GFP LC3β etiquetados incorporada a sua membrana externa foram visualizadas por microscopia de fluorescência. Aggresomes estão localizados ao longo do corpo da célula e neurites e são indicados com setas.

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Não há conflitos de interesse declarados.

Culturas de hipocampo têm sido utilizados em biologia molecular para mais de 20 anos. Embora, em princípio, culturas neuronais pode ser feito de qualquer parte do cérebro, as culturas de hipocampo provaram ser os mais populares devido à arquitectura relativamente simples da população de células nervosas no hipocampo 7. Culturas do hipocampo são normalmente feitas de fase final de tecido embrionário. Este tecido é mais fácil para dissociar e contém menos células gliais do que o faz o tecido cerebral madura 1. Isolamento de neurónios do hipocampo de tecido embrionário também diminui o dano de cisalhamento para axónios e dendritos devido a menos contactos de adesão 3. Enquanto as culturas de hipocampo são mais frequentemente gerada a partir de ratos, devido ao isolamento relativamente mais fácil do hipocampo, os ratinhos também pode ser usado com os mesmos protocolos se o cuidado apropriada é feita durante o isolamento do tecido. Uma vez que os neurônios são cultivados, a capacidade de utilizar avançadas técnicas moleculares para analisar l subcelularocalization e tráfico podem ser empregadas. Isto pode ser especialmente vantajosa quando se analisam embrionárias letais ratinhos transgénicos uma vez que fornece a capacidade para estudar as interacções de proteínas que possam resultar na morte do embrião. O hipocampo tem sido implicado em ambos aprendizagem espacial e contextual 5 e 6 de memória. Crescimento de culturas primárias do hipocampo pode permitir uma correlação entre subcelulares eventos biológicos e seus efeitos sobre a capacidade do cérebro de aprender e lembrar. Tal como com todas as células neurais, neurónios cultivados a partir de culturas de hipocampo requerem factores de crescimento, hormonas críticos e aminoácidos. No cérebro, estes factores são fornecidos por células gliais. Esta relação simbiótica pode também ser realizada em um ambiente de cultura pelo crescimento de um &quot;alimentador&quot; camada de células da glia, juntamente com os neurónios em cultura. No entanto, as células gliais também produzem fatores citotóxicos durante sua vida útil 11 which podem ser tóxicos para os neurônios em cultura. Para evitar isto, os neurónios foram cultivados em meios isentos de soro, tais como meio Neurobasal suplementado com B27. O suplemento B27 é otimizado para a sobrevivência de neurônios do hipocampo, mas vai apoiar o crescimento de outras culturas neuronais, bem 4. L-glutamina é um aminoácido essencial para produção de energia e síntese de proteínas em cultura de células. No entanto, a glutamina pode ser lábil ao longo do tempo, degradar em amoníaco e derivados de ácidos carboxílicos, uma vez adicionado ao meio de cultura. Glutamax, um suplemento de cultura de células a partir de Invitrogen, pode ser utilizado como um substituto directo para L-glutamina, se desejado. Glutamax é mais estável em meios mas ligeiramente mais caro. Crescimento de neurónios em meios isentos de soro permite o estudo dos efeitos de factores de crescimento e hormonas sobre o crescimento e diferenciação neuronal. Nós submetemos um protocolo para o isolamento rápido de neurônios do hipocampo de embriões de camundongos pré-natal, usando a mídia Neurobasal eo supplem B27ent para o crescimento de neurónios em um ambiente livre de soro, sem a utilização de células de alimentação. Como com todas as culturas de protocolos de células primárias, é vantajoso minimizar o crescimento de tipos não-desejado de células (ie células gliais). Isto é mais facilmente conseguida por dissecação cuidadosa do hipocampo de circundante regiões do cérebro. Células pré-natal também conter um número relativamente pequeno de células gliais ajudando neste objetivo. No entanto, a contaminação de células gliais ainda podem ocorrer. É possível para reduzir a contaminação de células gliais, por tratamento com citosina arabinósido (AraC) em pontos de tempo iniciais na cultura 8,9. AraC pode ser usado como um agente anti-mitótico para reduzir a população de células não-neuronais capazes de síntese de DNA. No entanto, para evitar possíveis efeitos tóxicos do tratamento sobre os neurónios, ele deve ser usado no seu mais baixo faz eficaz (5 uM) e não adicionado após 3-4 dias de cultura 11. Outra opção seria a utilização de 5-fluoro-2&#39;-desoxiuridina (FUdR) tratamento de dezembrorease a proporção de células fibroblásticas-reactivas células microgliais 10. Uma vez colhido, o tecido do hipocampo pode ser tratada com uma solução de tripsina para dissociar diluído / desagregar as células aderentes. No entanto, a exposição prolongada a concentrações mais elevadas de tripsina pode ser prejudicial para a subcultura de células assim que o tempo em solução de tripsina é mais frequentemente limitada entre 3-5 minutos. A concentração diluída de tripsina utilizada neste protocolo não permite maior tempo de incubação da enzima para aumentar a dissociação celular individual, mas deve ser tomado cuidado de respeitar estritamente os pontos de tempo previstos. A papaína pode ser usado como uma enzima alternativa e tem sido demonstrado ser mais eficaz e menos destrutiva com determinados tecidos, tais como neurónios retinais 10. Dissociação celular é seguido por trituração do tecido. Isto tem provado ser o passo mais importante na cultura neuronal consistente e é destaque por dois poin importantets. Em primeiro lugar, duas pipetas de Pasteur estéreis são utilizados durante este processo. A primeira é usada para interromper grosseiramente tecido / associação celular. O tamanho de abertura deste pipeta primeiro deve estar entre 1,0-1,5 mm. A seleção cuidadosa de pipetas diretamente do pacote fornecedor geralmente pode resultar em pipetas apropriadas para trituração esta em primeiro lugar. A pipeta de Pasteur segundo usado é &quot;-fogo polido&quot; ao longo de um bico de Bunsen para reduzir o tamanho da abertura de aproximadamente 0,5 mm de diâmetro. Isto também resulta em &quot;polir&quot; o anel de vidro da abertura de uma superfície mais lisa reduzindo danos mecânicos às células à medida que passam. Em segundo lugar, a velocidade / força de trituração através da pipeta é de grande importância. Como as células dissociar a partir do tecido todo, são obviamente mais frágil. Assim, o tratamento &quot;áspero&quot;, como neste momento seria prejudicial para a sobrevivência das células neuronais. Tecido tripsinizadas deve ser passadas através da pipeta a uma taxa de fluxo consistente, mas firme. Um erro comum por diapesquisador e é a idéia de ter que dissociar completamente o tecido até que não haja uma estrutura perceptível restante. Na maioria dos casos, isso irá resultar na morte neuronal maciça como as células serão muito danificado pela manipulação repetida mecânica. O número de vezes indicado para passar o tecido através da pipeta irá resultar em números suficientes de neurónios sem resultar em danos bruto para a população. Uma vez que as células foram dissociadas e reunidas, uma mancha azul de tripano de uma alíquota de células vai fornecer uma proporção de vivo para células mortas. Tipicamente, 75-80% das células devem sobreviver ao processo de colheita e pode ser usado para revestimento. A coloração com azul de tripano também pode ser usado para obter uma contagem de células exacta quando feito em um hemocitómetro. Na prática, uma vez uma contagem total de células é conseguida, adicionar 20% ao total e usar esse número de células para efeitos de revestimento para explicar a quantidade aproximada de morte celular. Números fornecidos no protocolo acima são um bom starting ponto para alcançar bons densidades de neurônios. Se a densidade neurónio é demasiado baixa, o plaqueamento, o crescimento celular provavelmente não será suficiente, tal como a densidade de revestimento é uma variável importante na propagação da população de células. As células devem ser alimentados a cada quatro dias com a mídia de alimentação B27/Neurobasal. Crescimento neuronal sob estas condições podem ser facilmente realizados para 10-14 dias em cultura e tem sido utilizada para propagar neurónios 2 para fora a 30 dias em cultura quando semeadas a 80 células / mm 2.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do Reagente </td><td> Vendedor </td><td> Número de Catálogo </td></tr><tr><td> Colágeno Rato Cauda 1 </td><td> BD Biosciences </td><td> 354236 </td></tr><tr><td> Poli-D-lisina Solução </td><td> Chemicon </td><td> Um-003-E </td></tr><tr><td> Hanks Balanced Salt Solution </td><td> Invitrogen </td><td> 14175-095 </td></tr><tr><td> Tripsina Solução (1X) 0,25%, líquido </td><td> Invitrogen </td><td> 15050-065 </td></tr><tr><td> NeuroBasal meio líquido (1X) </td><td> Invitrogen </td><td> 21103-049 </td></tr><tr><td> B27 Suplemento (50X) líquido </td><td> Invitrogen </td><td> 17504-044 </td></tr><tr><td> L-Glutamina mM 200 (100X) de líquido </td><td> Invitrogen </td><td> 25030-149 </td></tr><tr><td> Penicilina (10.000 unidades / ml) / estreptomicina (10.000 ug / ml) </td><td> Invitrogen </td><td> 15140-148 </td></tr><tr><td> HI Doadores-soro de cavalo </td><td> Atlanta Biologicals </td><td> S12150H </td></tr></tbody></table>

isolation and culture of hippocampal neurons from prenatal mice

As culturas primárias de rato e murina neurónios do hipocampo são amplamente utilizados para revelar os mecanismos celulares em neurobiologia. Com o isolamento e crescente neurónios individuais, os pesquisadores são capazes de analisar as propriedades relacionadas com o tráfico celular, a estrutura celular e localização de proteínas individuais usando uma variedade de técnicas bioquímicas. Os resultados de tais experiências são fundamentais para testar as teorias que abordam a base neural da memória e aprendizagem. No entanto, a partir de resultados inequívocos estas formas de experiências são baseadas na capacidade de crescer culturas neuronais com a contaminação mínima por outros tipos de células cerebrais. Neste protocolo, usamos meios específicos projetados para o crescimento dos neurônios e dissecção cuidadosa do tecido hipocampal embrionário para otimizar o crescimento de neurônios saudáveis, minimizando os tipos de células contaminantes (astrócitos, por exemplo). Tecido embrionário de rato do hipocampo pode ser mais difícil de isolar do que o tecido roedor semelhante, devido ao tamanho da amostra para o dissection. Mostramos técnicas de dissecação detalhadas de hipocampo de ratos filhotes embrionárias dia 19 (E19). Uma vez que o tecido do hipocampo é isolado, a dissociação suave de células neuronais é conseguido com uma concentração diluída de tripsina e ruptura mecânica concebido para separar células de tecido conjuntivo, proporcionando mínimo de danos para as células individuais. Uma descrição detalhada de como preparar pipetas para ser utilizado na ruptura é incluído. Densidades de revestimento ideais são fornecidas de imuno-fluorescência protocolos para maximizar a cultura de células de sucesso. O protocolo fornece uma técnica rápida (cerca de 2 horas) e eficiente para a cultura de células neuronais do hipocampo do rato a partir de tecido.

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Isolation and Culture of Hippocampal Neurons from Prenatal Mice

Nós fornecer um protocolo para a cultura de neurónios do hipocampo altamente purificado a partir de cérebros de rato pré-natal, sem a utilização de uma camada de células alimentador glial.

Isolamento e Cultura de neurônios do hipocampo de ratos pré-natal

Primary cultures of rat and murine hippocampal neurons are widely used to reveal cellular mechanisms in neurobiology. By isolating and growing individual ...

isolation-and-culture-of-hippocampal-neurons-from-prenatal-mice

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

70.1K visualizações.  Auburn University. Nós fornecer um protocolo para a cultura de neurónios do hipocampo altamente purificado a partir de cérebros de rato pré-natal, sem a utilização de uma camada de células alimentador glial.

Vídeo: Isolation and Culture of Hippocampal Neurons from Prenatal Mice

Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies of these neurons are located in the dorsal spinal cord and their axons follow stereotyped trajectories during embryonic development. Commissural axons initially project ventrally towards the floorplate. After crossing the midline, these axons turn anteriorly and project towards the brain. Each of these steps is regulated by the action of several guidance cues. Cultures highly enriched in commissural neurons are ideally suited for many experiments addressing the mechanisms of axon pathfinding, including turning assays, immunochemistry and biochemistry. Here, we describe a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. First, the spinal cord is isolated and dorsal strips are dissected out. The dorsal tissue is then dissociated into a cell suspension by trypsinization and mechanical disruption. Neurons are plated onto poly-L-lysine-coated glass coverslips or tissue-culture dishes. After 30 hours in vitro, most neurons have extended an axon. The purity of the culture (Yam et al. 2009), typically over 90%, can be assessed by immunolabeling with the commissural neuron markers DCC, LH2 and TAG1 (Helms and Johnson, 1998). This neuronal preparation is a useful tool for in vitro studies of the cellular and molecular mechanisms of commissural axon growth and guidance during spinal cord development.

This video demonstrates a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. Dissociated commissural neurons are useful to study the cellular and molecular mechanisms of axon growth and guidance.

Dissecção e Cultura de Neurônios da Medula Espinhal comissural embrionárias

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

Neurociência

Nucleofection and Primary Culture of Embryonic Mouse Hippocampal and Cortical Neurons

Hippocampal and cortical neurons have been used extensively to study central nervous system (CNS) neuronal polarization, axon/dendrite outgrowth, and synapse formation and function. An advantage of culturing these neurons is that they readily polarize, forming distinctive axons and dendrites, on a two dimensional substrate at very low densities. This property has made them extremely useful for determining many aspects of neuronal development. Furthermore, by providing glial conditioning for these neurons they will continue to develop, forming functional synaptic connections and surviving for several months in culture. In this protocol we outline a technique to dissect, culture and transfect embryonic mouse hippocampal and cortical neurons. Transfection is accomplished by electroporating DNA into the neurons before plating via nucleofection. This protocol has the advantage of expressing fluorescently-tagged fusion proteins early in development (~4-8hrs after plating) to study the dynamics and function of proteins during polarization, axon outgrowth and branching. We have also discovered that this single transfection before plating maintains fluorescently-tagged fusion protein expression at levels appropriate for imaging throughout the lifetime of the neuron (&gt; 2 months in culture). Thus, this methodology is useful for studying protein localization and function throughout CNS development with little or no disruption of neuronal function.

This protocol outlines the steps required to dissect, transfect via electroporation and culture mouse hippocampal and cortical neurons. Short-term cultures may be used for studies of axon outgrowth and guidance, while long-term cultures can be used for studies of synaptogenesis and dendritic spine analysis.

Nucleofection e Cultura Primária de Neurônios do hipocampo do rato embrionárias e Cortical

Hippocampal and cortical neurons have been used extensively to study central nervous system (CNS) neuronal polarization, axon/dendrite outgrowth, and ...

Calcium Phosphate Transfection of Primary Hippocampal Neurons

Calcium phosphate precipitation is a convenient and economical method for transfection of cultured cells. With optimization, it is possible to use this method on hard-to-transfect cells like primary neurons. Here we describe our detailed protocol for calcium phosphate transfection of hippocampal neurons cocultured with astroglial cells.

Fosfato de cálcio transfecção de primário neurônios do hipocampo

Calcium phosphate precipitation is a convenient and economical method for transfection of cultured cells. With optimization, it is possible to use this ...

Isolation and Culture of Dissociated Sensory Neurons From Chick Embryos

Neurons are multifaceted cells that carry information essential for a variety of functions including sensation, motor movement, learning, and memory. Studying neurons in vivo can be challenging due to their complexity, their varied and dynamic environments, and technical limitations. For these reasons, studying neurons in vitro can prove beneficial to unravel the complex mysteries of neurons. The well-defined nature of cell culture models provides detailed control over environmental conditions and variables. Here we describe how to isolate, dissociate, and culture primary neurons from chick embryos. This technique is rapid, inexpensive, and generates robustly growing sensory neurons. The procedure consistently produces cultures that are highly enriched for neurons and has very few non-neuronal cells (less than 5%). Primary neurons do not adhere well to untreated glass or tissue culture plastic, therefore detailed procedures to create two distinct, well-defined laminin-containing substrata for neuronal plating are described. Cultured neurons are highly amenable to multiple cellular and molecular techniques, including co-immunoprecipitation, live cell imagining, RNAi, and immunocytochemistry. Procedures for double immunocytochemistry on these cultured neurons have been optimized and described here.

Cell culture models provide detailed control over environmental conditions and thus provide a powerful platform to elucidate numerous aspects of neuronal cell biology. We describe a rapid, inexpensive, and reliable method to isolate, dissociate, and culture sensory neurons from chick embryos. Details of substrata preparation and immunocytochemistry are also provided.

Isolamento e Cultura de Dissociated neurônios sensoriais de Chick Embriões

Neurons are multifaceted cells that carry information essential for a variety of functions including sensation, motor movement, learning, and memory. ...

Isolation, Culture and Long-Term Maintenance of Primary Mesencephalic Dopaminergic Neurons From Embryonic Rodent Brains

Degeneration of mesencephalic dopaminergic (mesDA) neurons is the pathological hallmark of Parkinson&#8217;s diseae. Study of the biological processes involved in physiological functions and vulnerability and death of these neurons is imparative to understanding the underlying causes and unraveling the cure for this common neurodegenerative disorder. Primary cultures of mesDA neurons provide a tool for investigation of the molecular, biochemical and electrophysiological properties, in order to understand the development, long-term survival and degeneration of these neurons during the course of disease. Here we present a detailed method for the isolation, culturing and maintenance of midbrain dopaminergic neurons from E12.5 mouse (or E14.5 rat) embryos. Optimized cell culture conditions in this protocol result in presence of axonal and dendritic projections, synaptic connections and other neuronal morphological properties, which make the cultures suitable for study of the physiological, cell biological and molecular characteristics of this neuronal population.

The causes of degeneration of midbrain dopaminergic neurons during Parkinson&#8217;s disease are not fully understood. Cellular culture systems provide an essential tool for study of the neurophysiological properties of these neurons. Here we present an optimized protocol, which can be utilized for in vitro modeling of neurodegeneration.

Isolamento, cultura e Long-Term Manutenção da Primária mesencefálico Dopaminergic neurônios dos cérebros de roedores Embryonic

Degeneration of mesencephalic dopaminergic (mesDA) neurons is the pathological hallmark of Parkinson&#8217;s diseae. Study of the biological processes ...

Low-Density Primary Hippocampal Neuron Culture

The ability to probe the structure and physiology of individual nerve cells in culture is crucial to the study of neurobiology, and allows for flexibility in genetic and chemical manipulation of individual cells or defined networks. Such ease of manipulation is simpler in the reduced culture system when compared to the intact brain tissue. While many methods for the isolation and growth of these primary neurons exist, each has its own limitations. This protocol describes a method for culturing low-density and high-purity rodent embryonic hippocampal neurons on glass coverslips, which are then suspended over a monolayer of glial cells. This &#39;sandwich culture&#39; allows for exclusive long-term growth of a population of neurons while allowing for trophic support from the underlying glial monolayer. When neurons are of sufficient age or maturity level, the neuron coverslips can be flipped-out of the glial dish and used in imaging or functional assays. Neurons grown by this method typically survive for several weeks and develop extensive arbors, synaptic connections, and network properties.

This article describes the protocol for culturing low-density primary hippocampal neurons growing on glass coverslips inverted over a glial monolayer. The neuron and glial layers are separated by paraffin wax beads. The neurons grown by this method are suitable for high-resolution optical imaging and functional assays.

Low-Density hipocampo Cultura Neuron primária

The ability to probe the structure and physiology of individual nerve cells in culture is crucial to the study of neurobiology, and allows for flexibility ...

Spinal Cord Neurons Isolation and Culture from Neonatal Mice

We present a protocol for the isolation and culture of spinal cord neurons. The neurons are obtained from neonatal C57BL/6 mice and are isolated on postnatal day 1-3. A mouse litter, usually 4-10 pups born from one breeding pair, is gathered for one experiment, and spinal cords are collected individually from each mouse after euthanasia with isoflurane. The spinal column is dissected out and then the spinal cord is released from the column. The spinal cords are then minced to increase the surface area of delivery for an enzymatic protease that allows for the neurons and other cells to be released from the tissue. Trituration is then used to release the cells into solution. This solution is subsequently fractionated in a density gradient to separate the various cells in solution, allowing for neurons to be isolated. Approximately 1-2.5 x 106 neurons can be isolated from one litter group. The neurons are then seeded onto wells coated with adhesive factors that allow for proper growth and maturation. The neurons take approximately 7 days to reach maturity in the growth and culture medium and can be used thereafter for treatment and analysis.

This study presents a technique for the isolation of neurons from WT neonatal mice. It requires the careful dissection of the spinal cord from the neonatal mouse, followed by the separation of neurons from the spinal cord tissue through mechanical and enzymatic cleavage.

Isolamento e cultura de neurônios da medula espinhal de ratos neonatais

We present a protocol for the isolation and culture of spinal cord neurons. The neurons are obtained from neonatal C57BL/6 mice and are isolated on ...

Primary Culture of Neurons Isolated from Embryonic Mouse Cerebellum

The use of primary cell cultures has become one of the major tools to study the nervous system in vitro. The ultimate goal of using this simplified model system is to provide a controlled microenvironment and maintain the high survival rate and the natural features of dissociated neuronal and nonneuronal cells as much as possible under in vitro conditions. In this article, we demonstrate a method of isolating primary neurons from the developing mouse cerebellum, placing them in an in vitro environment, establishing their growth, and monitoring their viability and differentiation for several weeks. This method is applicable to embryonic neurons dissociated from cerebellum between embryonic days 12&ndash;18.

Conducting in vitro experiments to reflect in vivo conditions as adequately as possible is not an easy task. The use of primary cell cultures is an important step toward understanding cell biology in a whole organism. The provided protocol outlines how to successfully grow and culture embryonic mouse cerebellar neurons.

Cultura primária de neurônios isolados do cerebelo embrionário do rato

The use of primary cell cultures has become one of the major tools to study the nervous system in vitro. The ultimate goal of using this simplified model ...

Isolation and Culture of Oculomotor, Trochlear, and Spinal Motor Neurons from Prenatal Islmn:GFP Transgenic Mice

Oculomotor neurons (CN3s) and trochlear neurons (CN4s) exhibit remarkable resistance to degenerative motor neuron diseases such as amyotrophic lateral sclerosis (ALS) when compared to spinal motor neurons (SMNs). The ability to isolate and culture primary mouse CN3s, CN4s, and SMNs would provide an approach to study mechanisms underlying this selective vulnerability. To date, most protocols use heterogeneous cell cultures, which can confound the interpretation of experimental outcomes. To minimize the problems associated with mixed-cell populations, pure cultures are indispensable. Here, the first protocol describes in detail how to efficiently purify and cultivate CN3s/CN4s alongside SMNs counterparts from the same embryos using embryonic day 11.5 (E11.5) IslMN:GFP transgenic mouse embryos. The protocol provides details on the tissue dissection and dissociation, FACS-based cell isolation, and in vitro cultivation of cells from CN3/CN4 and SMN nuclei. This protocol adds a novel in vitro CN3/CN4 culture system to existing protocols and simultaneously provides a pure species- and age-matched SMN culture for comparison. Analyses focusing on the morphological, cellular, molecular, and electrophysiological characteristics of motor neurons are feasible in this culture system. This protocol will enable research into the mechanisms that define motor neuron development, selective vulnerability, and disease.

Isolation and Culture of Oculomotor, Trochlear, and Spinal Motor Neurons from Prenatal Islmn:GFP Transgenic Mice

This work presents a protocol to yield homogeneous cell cultures of primary oculomotor, trochlear, and spinal motor neurons. These cultures can be used for comparative analyses of the morphological, cellular, molecular, and electrophysiological characteristics of ocular and spinal motor neurons.

Isolamento e Cultura dos neurônios oculomotores, trochlear e motores espinhais de pré-natal Islmn:GFP Ratos Transgênicos

Oculomotor neurons (CN3s) and trochlear neurons (CN4s) exhibit remarkable resistance to degenerative motor neuron diseases such as amyotrophic lateral ...

Isolation and Culture of Primary Neurons and Glia from Adult Rat Urinary Bladder

The lower urinary tract has two main functions, namely, periodic urine storage and micturition; these functions are mediated through central and peripheral neuroregulation. Although extensive research on the lower urinary tract nervous system has been conducted, most studies have focused on primary culture. This protocol introduces a method for the isolation and culture of bladder neurons and glia from Sprague&#8211;Dawley rats. In this method, the neurons and glia were incubated in a 37 &#176;C, 5% CO2 incubator for 5&#8211;7 days. As a result, they grew into mature shapes suitable for related subsequent immunofluorescence experiments. Cells were morphologically observed using an optical microscope. Neurons, synaptic vesicles, and glia were identified by &#946;-III-tubulin and MAP-2, Synapsin-1, and GFAP staining, respectively. Meanwhile, immunocytochemistry was performed on several neurotransmitter-related proteins, such as choline acetyltransferase, DYNLL2, and SLC17A9.

This protocol attempts to establish a repeatable protocol for primary neurons and glia isolation from rat bladder for further cellular experiments.