Nós gostaríamos de reconhecer todos os membros anteriores do laboratório Bouchier-Hayes que contribuíram para o desenvolvimento desta técnica. Este trabalho foi financiado em parte pelo prêmio de piloto pediátrica Hospital infantil do Texas a LBH. Agradecemos Joya Chandra (MD Anderson, Houston, Texas) permissão para incluir dados publicados em colaboração com a equipe dela. O desenvolvimento dos reagentes descrito foi apoiado pela citometria e núcleo de classificação de célula no Baylor College of Medicine com financiamento do NIH (NIAID P30AI036211 NCI P30CA125123 e NCRR S10RR024574) e a assistência de Joel M. Sederstrom

1. preparação de células e pratos da cultura
Nota: Execute os passos 1-3 em uma capa de fluxo laminar de cultura de tecidos. Use luvas.
<ol><li>Se utilizar pratos de vidro inferior, cubra o vidro com fibronectina. Ignorar a etapa 1.2 se usando pratos de plástico.<ol>
<li>Fazer uma solução de 0,1 mg/mL de fibronectina: diluir 1 mL da solução de fibronectina 1 mg/mL em 9 mL de 1X PBS.</li>
		<li>Cubra o fundo de vidro de cada poço com 0,5-1 mL de fibronectina e incube por 15 min à temperatura ambiente.</li>
		<li>Utilizando uma pipeta, recolher a solução de fibronectina e armazenar a 4 ° C. Nota: A solução de fibronectina pode ser reutilizada várias vezes.</li>
		<li>Lave o vidro uma vez com 1-2 mL 1X PBS e aspire o PBS.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Placa 1 x 105 células por poço de uma placa de 6 em 2 mL dos meios de cultura de célula apropriada (ver tabela 1 para números de celular para usar para poços de tamanhos diferentes). Se usando uma linha celular que expressa estàvel os caspase BiFC componentes (ver discussão), placa de 2 x 105 células e prossiga para a etapa de tratamento (etapa 3).</li>
	<li>Permitir que as células aderir ao prato durante a noite a 37 ° C, em uma incubadora de cultura de tecidos.</li>
</ol>2. transfecção de células para introduzir os caspase BiFC componentes
<ol><li>Transfect células com o reagente de transfeccao apropriado. Nota: Este protocolo descreve as instruções para Lipofectamine 2000, que foi otimizado para toxicidade mínima. Este protocolo tem sido usado com sucesso em células Hela, células MCF7 e células LN18. Se usar adicionais reagentes de transfecção sigam as instruções do fabricante e otimizar conforme necessário.<ol>
<li>Adicione 12 µ l de reagente de Transfeccao para 750 µ l de mídia reduzida de soro em um tubo estéril.</li>
		<li>Incube a temperatura ambiente por 5 min.</li>
		<li>Adicionar 10 ng de um plasmídeo do repórter (um plasmídeo codificação de uma proteína fluorescente, por exemplo, vermelho proteína fluorescente [RFP], que irá rotular as células transfectadas) para um tubo estéril de 1,5 mL para cada poço a transfected.</li>
		<li>Adicionar 20 ng de cada caspase BiFC plasmídeo (por exemplo, 20 ng de caspase-2 prodomínio [C2 Pro]-VC e 20 ng de C2 Pro-VN) para cada tubo (tabela 2).</li>
		<li>Trazer cada tubo até um volume total de 100 µ l adicionando mídia soro reduzida.</li>
		<li>Usando uma pipeta p200, adicione 100 µ l de solução de reagente de Transfeccao de passo 2.1.2 para a mistura de plasmídeo de forma gota a gota.</li>
		<li>Incube a mistura de reagente de transfeccao Plasmideo por 20 min em temperatura ambiente.</li>
		<li>Aspire os meios de comunicação das células com uma pipeta ou com sucção e em seguida, usando uma pipeta p1000, pipetar 800 µ l de meios livres de soro delicadamente para baixo do lado do bem.</li>
		<li>Usando uma pipeta p200, adicione 200 µ l do complexo DNA-lipídico gota a gota a cada poço.</li>
		<li>Incube as células em uma cultura de tecidos incubadora a 37 ° C por 3 h.</li>
		<li>Tomando cuidado para não perturbar a monocamada, remover os meios livres de soro contendo os complexos lipídios-DNA por aspiração usando sucção ou de uma pipeta.</li>
		<li>Pipete 2 mL do meio de crescimento completo pré-aquecido (37 ° C) suavemente para o lado de cada poço.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Incube as células a 37 ° C por 24-48 h para a expressão da proteína ideal numa incubadora de cultura de tecidos.</li>
</ol>3. indução de ativação de caspase
<ol><li>Tratar com uma droga ou estímulo que induz a caspase ativação aproximadamente 24 h pós-do transfection.<ol>
<li>Adicionar a concentração desejada do fármaco para pré aquecido (37 ° C) de imagem media (mídia de crescimento completo suplementada com Hepes [20 mM, pH 7,2-7,5] e 2-Mercaptoetanol [55 µM]) e misture delicadamente (tabela 3).</li>
		<li>Aspirar os meios de comunicação das células com uma pipeta ou com sucção e em seguida, usando uma pipeta, Pipetar 2 mL da solução de 3.1.1 suavemente para o lado do bem.</li>
		<li>Adicione imagem de mídia sem a droga a um bem como um controle não tratado.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Incubar as células em uma cultura de tecidos de incubadora a 37 ° C ou prossiga para o passo 4.3 para um experimento de lapso de tempo.</li>
</ol>4.. Aquisição de dados de Caspase BiFC
<ol><li>
Caspase BiFC para aquisição de ponto único tempo
	<ol>
<li>Liga o microscópio e a fonte de luz fluorescente, seguindo as instruções do fabricante.</li>
		<li>Encontre as células sob o filtro RFP e focar a fluorescência do gene repórter.</li>
		<li>Usando um contador mão-contagem, conte todas as células de RFP-positivo no campo visual. O número de registro.</li>
		<li>Mantendo o mesmo campo visual, alterne para o GFP (ou um filtro YFP se estiver disponível) e, usando um contador mão-contagem, contar o número de células vermelhas que também são verdes (Venus-positivo). Alterne entre os dois filtros para garantir que apenas os eritrócitos são avaliados para Venus-positividade. Registre o número (Figura 3).</li>
		<li>Conte pelo menos 100 células de RFP-positivo de cada uma das três áreas individuais da placa.</li>
		<li>Em cada área, calcule a porcentagem de células transfectada Venus-positivo (ou seja, eritrócitos que também são verdes). Média as percentagens resultantes para obter o desvio padrão.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Geração de imagens tridimensional de caspase BiFC
	<ol>
<li>Ligue o microscópio seguindo as instruções do fabricante e lançar o software de aquisição.</li>
		<li>Selecione o x 60 ou objectivo de óleo x 63 e coloque uma gota de óleo sobre o objetivo</li>
		<li>Coloque o prato de cultura no palco microscópio usando o suporte de placa correta.</li>
		<li>Usando uma fonte de luz de epifluorescência e a parte do olho de microscópio ou o laser confocal e tela do computador, navegue até um campo de interesse.</li>
		<li>Focar a fluorescência de repórter usando o laser RFP ou filtro.</li>
		<li>Se epifluorescência tem sido utilizada até este ponto, mudar a fonte de luz para o laser confocal e visualizar a imagem ao vivo das células como adquirida pela câmera e exibido pelo software de aquisição na tela do computador.</li>
		<li>Usando o controle de joystick e a roda de foco, ajuste o foco e a posição das células para que as células estão no centro do visor. Escolha as células que são separadas uns dos outros e não se sobrepõem.</li>
		<li>Entrada a potência do laser de porcentagem para 50% e o tempo de exposição a 100 ms para Venus e RFP como ponto de partida para determinar as configurações ideais para usar para o experimento.</li>
		<li>Ligue a captura ao vivo e inspecionar a imagem resultante e os histogramas de exibição acompanhamento para ambos os canais.</li>
		<li>Se o sinal é baixo e a imagem é difícil de decifrar, aumente o tempo percentual de potência e/ou exposição de laser em incrementos até que o sinal na imagem parece ser bom.</li>
		<li>Certifique-se de que o sinal não chega saturação. Inspecione o histograma de exibição para certificar-se de que um pico distinto é visível para cada fluor. Se o pico engloba a exibição de histograma inteiro, entrada do laser poder e exposição ajustes inferiores (Figura 2).</li>
		<li>Visualize as células de controle (não tratada ou não-transfectadas) sob as mesmas condições para garantir que o sinal é específico. Nota: Única cor transfectants também pode ser usado para controle de crossover, mas se os sinais são espacialmente distintas (por exemplo, mitocondrial contra citosólico) isso não é necessário.</li>
		<li>Selecione ou abra o módulo de pilha de Z no software do microscópio.</li>
		<li>Usando o botão de foco, aproximado posição focal correspondente ao centro da célula.</li>
		<li>Ajuste o foco em uma direção, até que a célula não é mais visível, selecione essa opção como a primeira posição.</li>
		<li>Ajuste o foco na direção oposta até a célula novamente não é mais visível e selecionar esta opção como a posição inferior.</li>
		<li>Escolha o tamanho de passo ótimo (geralmente cerca de 20 µm) e iniciar a aquisição para instruir a câmera para tirar automaticamente uma única imagem em cada canal em cada uma das 20 etapas µm entre as posições superior e inferior.</li>
		<li>Use o software de renderização 3D para reconstruir a imagem 3D (Figura 4filme 1).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Imagem de lapso de tempo de caspase BiFC
	<ol>
<li>Pelo menos 1 h antes do experimento, ligue o microscópio e seleccionar a temperatura de 37 ° c.</li>
		<li>Selecione o x 40, 60 x ou objectivo de óleo x 63 e coloque uma gota de óleo sobre o objetivo.</li>
		<li>Coloque o prato de cultura no palco microscópio usando o suporte de placa correta.</li>
		<li>Se uma fonte de2 CO está disponível, coloque o dispositivo de entrega do CO2 (normalmente uma tampa de plexiglass ligada ao tubo que entrega o CO2) em cima do suporte da placa. Definir o CO2 nível de 5% e ligar o CO2 controlador de dentro do software. Se não houver uma fonte de2 CO, incluem 20 mM Hepes para tamponar a mídia.</li>
		<li>Navegue até um campo de células transfectadas e visualizar a imagem ao vivo das células como exibido pelo software de aquisição na tela do computador usando o laser RFP e adquirida pela câmera.</li>
		<li>Seguindo os passos 4.2.8-4.2.12, entrada as configurações para porcentagem do laser poder e tempo de exposicao do laser de RFP. Manter estes valores tão baixos quanto possível e ainda ser capaz de detectar o sinal fluorescente.</li>
		<li>Usando um controle positivo da amostra (ver tabela 3 para obter exemplos), siga passos 4.2.8-4.2.12 para as configurações de entrada para porcentagem do laser poder e tempo de exposicao para a luz de laser YFP. Manter estes valores tão baixos quanto possível enquanto ainda é capaz de detectar o sinal de Venus.</li>
		<li>Para cada poço da placa, escolha um número de posições diferentes que contêm uma ou mais células expressando o repórter.</li>
		<li>O intervalo de tempo entre cada quadro do lapso de tempo e total número de quadros a serem tomadas de entrada. Verifique se há tempo para adquirir todas as posições selecionadas antes que o próximo quadro é para ser tomado.</li>
		<li>Re-visitar cada posição e corrigir e atualizar o foco conforme necessário.</li>
		<li>Para corrigir para drift focal que pode resultar de mudanças de temperatura ou vibrações externas, ligue o sistema de correção de desvio de foco (se disponível).</li>
		<li>Começar o lapso de tempo e salvar os dados.</li>
		<li>Analise os dados usando o software de imagem disponível (Figura 5filme 2).</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Salvesen, G. S., Riedl, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caspase+mechanisms.">Caspase mechanisms.</a> Adv Exp Med Biol. 615, 13-23 (2008).</li><li>Boatright, K. M., Salvesen, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+caspase+activation.">Mechanisms of caspase activation.</a> Curr Opin Cell Biol. 15 (6), 725-731 (2003).</li><li>Luthi, A. U., Martin, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+CASBAH:+a+searchable+database+of+caspase+substrates.">The CASBAH: a searchable database of caspase substrates.</a> Cell Death Differ. 14 (4), 641-650 (2007).</li><li>Baliga, B. C., Read, S. 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Os autores declaram que eles têm não tem interesses financeiro concorrente.

A família de protease caspase é conhecida por seus papéis críticos na apoptose e imunidade inata 1. Por causa de sua importância, determinar quando, onde e quanto à eficácia das caspases específicas são ativadas podem fornecer insights cruciais sobre os mecanismos de caspase vias de ativação. O protocolo baseado em imagem descrito aqui permite a visualização dos primeiros passos para a cascata de ativação de caspase. Esta técnica tira proveito das interações da proteína: proteína dinâmica ativação de caspase naquela unidade.
As caspases podem ser divididas em dois grupos: as caspases de iniciador (caspase-1, -2, -4, -5, -8, -9, -10 e -12) e as carrasco caspases (caspase-3, -6 e -7). As caspases carrasco estão presentes na célula como dímeros pré-formadas e são ativadas por clivagem entre os grandes e pequenos subunidade 2. Quando ativado, eles cleave inúmeras proteínas estruturais e reguladoras, resultando em apoptose 3. As iniciador caspases são as caspases primeiras para ser ativado em uma via e geralmente acionar a ativação das caspases carrasco. Em contraste com o carrasco caspases, iniciador caspases são ativadas por dimerização 4,5. Este dimerização é facilitada pelo recrutamento de monômeros inativos para complexos de peso molecular grande específico conhecidos como plataformas de ativação. Montagem de plataformas de ativação é regida por uma série de interações da proteína: proteína específica. Estas são mediadas por motivos de interação de proteínas conservadas presentes no proform de caspase o iniciador e incluem o domínio da morte (DD), domínio effector da morte (DED) e de domínio (cartão) de recrutamento de caspase 6 (figura 1A). Plataformas de ativação incluem geralmente uma proteína do receptor e uma proteína do adaptador. O receptor é normalmente ativado mediante a ligação de um ligante, induzindo uma mudança conformacional que permite a oligomerização de numerosas moléculas. O receptor então também recruta a caspase diretamente ou moléculas do adaptador que por sua vez, trazem a caspase ao complexo. Assim, numerosas moléculas de caspase entram em proximidade que permite dimerização. Isso é conhecido como o modelo de proximidade induzida por 7. Uma vez dimerized, a caspase sofre de autoprocessamento, que serve para estabilizar a enzima activa 4,8. Por exemplo, montagem do apoptossomo Apaf1 é acionada pelo citocromo c após sua libertação da mitocôndria em um processo chamado de permeabilização da membrana mitocondrial externa (MOMP). Apaf1, por sua vez, recruta caspase-9, através de uma interação que é mediada por um cartão presente em ambas as proteínas 9. Semelhante resultado de interações proteína na Assembleia da CD95 morte induzindo sinalização complexo (disco) que leva à ativação de caspase-8; o PIDDosome, que pode ativar caspase-2; e vários inflammasome complexos que iniciam a ativação de caspase-1 10,11,12. Assim, iniciador caspases são recrutadas para plataformas específicas de ativação através de um mecanismo comum, resultando em proximidade induzida e dimerização, sem a qual não ocorrerá ativação.
Complementação de fluorescência caspase Bimolecular (BiFC) é um ensaio baseado em imagens que foi desenvolvido para medir este primeiro passo na ativação das caspases de iniciador, permitindo a visualização direta da proximidade de caspase induzido após a plataforma de ativação montagem. Este método aproveita-se das propriedades da proteína fluorescente divisão Venus. Vênus é um mais brilhante e mais fotoestável versão de proteína fluorescente amarela (YFP) que pode ser separada em dois fragmentos não-fluorescente e ligeiramente sobrepostos: N-terminal de Vênus (Venus N ou VN) e o C-terminal de Vênus (Venus C ou VC). Estes fragmentos mantêm a capacidade de redobrar e tornar-se fluorescente quando na proximidade de 13. Cada fragmento de Vênus é fundido para o prodomínio da caspase, que é a porção mínima da caspase que vincula-se à plataforma de ativação. Isso garante que as caspases não reter a atividade enzimática e, portanto, a análise simultânea de jusante eventos associados a eventos endógenos é possível. A Vênus de fragmentos redobrar quando os prodomains de caspase são recrutados para a plataforma de ativação e passam por proximidade induzida. (Figura 1B). A fluorescência de Venus resultante pode ser usada com precisão e especificamente monitorar a Localização subcellular, a cinética e a eficiência do conjunto de plataformas de ativação de caspase iniciador em células únicas. Dados de imagem podem ser adquirido por microscopia confocal ou por microscopia de fluorescência padrão e pode ser adaptado para uma série de abordagens diferentes microscopia incluindo: imagem de lapso de tempo para controlar a ativação de caspase em tempo real; imagem de alta resolução para determinações precisas de Localização subcellular; e ponto final quantificação da eficiência de ativação.
Esta técnica foi desenvolvida para investigar a ativação de caspase-214. Enquanto a plataforma de ativação de caspase-2 é pensada para ser o PIDDosome, que consiste do receptor PIDD (proteína p53-induzido com um domínio de morte) e o adaptador RAIDD (RIP-associado ICH-1/CAD-3 proteínas homólogas com um domínio de morte), Ativação de caspase-2 independente de PIDDosome tem sido relatada. Isto sugere que plataformas adicionais de ativação de caspase-2 existem 15,16. Apesar de não saber os componentes completo da plataforma de ativação de caspase-2, permitiu-se a caspase BiFC técnica para interrogatório bem sucedido das vias sinalização caspase-2 para o nível molecular 14,17. Adaptámos também com êxito este protocolo para as caspases inflamatórias (caspase-1, -4, -5 e -12) 18 e, em princípio, a mesma abordagem deve ser suficiente para da mesma forma, analisar cada uma das caspases restantes do iniciador. Este protocolo da mesma forma pode ser adaptado investigar outros caminhos foram dimerização é um grande sinal de ativação. Por exemplo, as proteínas STAT são ativadas por dimerização após fosforilação por Janus quinase (JAK) 19. Assim, o sistema de BiFC pode ser usado para visualizar para ativação STAT, bem como muitas outras vias reguladas por interações proteína dinâmico. O seguinte protocolo fornece instruções passo a passo para a introdução dos repórteres em células, bem como as metodologias de análise e aquisição de imagem.

<table><tbody><tr><td>6-well Uncoated No. 1.5 20 mm glass bottom dishes</td><td>Mattek</td><td>P06G-1.5-20-F</td><td></td></tr><tr><td>Human Plasma Fibronectin Purified Protein</td><td>Millipore</td><td>FC010-10MG</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Sigma</td><td>D8537-6x500ML</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000 reagent</td><td>Invitrogen</td><td>11668019</td><td></td></tr><tr><td>OPTI MEM I</td><td>Invitrogen</td><td>31985088</td><td></td></tr><tr><td>C2-Pro VC plasmid</td><td>Addgene</td><td>49261</td><td></td></tr><tr><td>C2-Pro VN plasmid</td><td>Addgene</td><td>49262</td><td></td></tr><tr><td>Inflammatory caspase BiFC plasmids</td><td></td><td></td><td>available by request from LBH</td></tr><tr><td>HeLa cells stably expressing the C2-Pro BiFC components</td><td></td><td></td><td>available by request from LBH</td></tr><tr><td>DsRed mito plasmid</td><td>Clontech</td><td>632421</td><td>similar plasmids that can be used as fluorescent reporters can be found on Addgene</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Invitrogen</td><td>15630106</td><td></td></tr><tr><td>2 Mercaptoethanol 1000X</td><td>Invitrogen</td><td>21985023</td><td></td></tr><tr><td>q-VD-OPH</td><td>Apex Bio</td><td>A1901</td><td></td></tr></tbody></table>

lighting up the pathways to caspase activation using bimolecular fluorescence complementation

A família de caspase de proteases desempenham um papel essencial na apoptose e imunidade inata. Entre estes, um subgrupo conhecido como iniciador caspases são os primeiros a ser ativado nestes caminhos. Este grupo inclui caspase-2, -8 e -9, bem como as caspases inflamatórias, caspase-1, -4 e -5. As caspases iniciador são todos ativadas por dimerização seguir ao recrutamento de complexos Multiproteicos específicos, chamados de plataformas de ativação. Complementação de fluorescência caspase Bimolecular (BiFC) é uma abordagem baseada em imagem onde dividir proteínas fluorescentes fundidas ao iniciador caspases são usadas para visualizar o recrutamento das caspases iniciador de suas plataformas de ativação e o resultante induzida por proximidade. Esta fluorescência fornece uma leitura de um dos primeiros passos necessários para a ativação de caspase iniciador. Usando um número de diferentes abordagens baseadas em microscopia, esta técnica pode fornecer dados quantitativos sobre a eficiência da ativação de caspase em um nível de população, bem como a cinética de ativação de caspase e o tamanho e o número de ativação de caspase complexos em uma base por célula.

Um exemplo de caspase-2 BiFC induzida por dano do ADN é mostrado na Figura 3. Camptothecin, uma topoisomerase eu inibidor, foi usado para induzir danos e caspase-2 ativação do DNA. O mCherry da proteína fluorescente vermelha foi usado como um repórter para mostrar que as células expressam a sonda BiFC e para ajudar a visualizar o número total de células. Fluorescência de Vênus é mostrada em verde e a grande partitura representam caspase-2 induzido por proximidade. Estas células podem ser contadas determinar a percentagem de células de Venus-positivo. Conclusões sobre Localização subcellular também podem ser feitas de tais imagens. No exemplo mostrado, proximidade induzida caspase-2 foi detectada no nucléolo, bem como o citoplasma 17. Para fornecer visualização de alta resolução da Localização subcellular da ativação de caspase complexa, células individuais podem ser fotografadas em três dimensões. A Figura 4 mostra duas maneiras de representar tais imagens em 3D. O primeiro é para gerar uma reconstrução 3D da célula. O exemplo mostra induzida por camptothecin BiFC de caspase-2 no núcleo em vermelho e verde. A reconstrução 3D mostra a localização relativa dos dois fluorophores em toda as células. Este tipo de exibição de resultados é especialmente eficaz quando apresentado como um filme, girando a célula em torno de um único eixo (filme 1). O segundo painel é a vista ortogonal da mesma célula. Isto fornece a visualização xy, xze yz da célula em um ponto específico na célula. Representação dos resultados dessa maneira pode ser mais adequada para uma apresentação de papel tais como em um artigo de jornal, como é mais fácil de interpretar os dados 3D apresentados em um formato 2D. A Figura 5 mostra um exemplo de imagem de lapso de tempo de caspase-2 BiFC em uma linhagem de células de glioblastoma tratada com o bortezomib inibidor de proteossomo (Veja também o filme 2). O gráfico mostra o aumento da intensidade média de Venus por célula média de um número de células (adaptado de 20). Este tipo de dados também pode ser exibido como uma série de vestígios de célula única em um gráfico. No exemplo mostrado, o início da proximidade de caspase induzida é cerca de 2 h após o tratamento.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57316/57316fig1.jpg"> Figura 1: esquemático do caspase estrutura e metodologia de complementação (BiFC) de fluorescência bimolecular. (A) a estrutura geral de uma caspase iniciador. As subunidades prodomínio, grandes e pequenas e o motivo QACRG conservado que contém a sítio ativo de cisteína são retratados. (B) BiFC usa divisão proteínas fluorescentes que sozinho não são fluorescentes, mas podem associar para reformar a molécula fluorescente quando fundido a interação de proteínas. Para caspase BiFC, o prodomínio (Pro) ou caspase completo é fundido ao N-terminal metade (Venus-N) e para o C-terminal metade (Venus-C) de Vênus. Em seu estado monomérico as caspase proteínas de fusão não são fluorescentes. Em cima de recrutamento para uma plataforma de ativação, como o PIDDosome, como mostrado aqui, Associação das duas metades de Vênus é imposta representando a proximidade de caspase induzida que é medida como um aumento na fluorescência de Venus. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57316/57316fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57316/57316fig2.jpg"> Figura 2: imagem representativa para reconhecer a saturação usando o exibição de histograma. São mostrados exemplos de ideal (painel superior) e sinais saturados (painel inferior). A Vênus (pico amarelo) e sinais RFP (pico vermelho) são mostrados. O eixo x indica a intensidade e o eixo y é o número de pixels. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57316/57316fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57316/57316fig3.jpg"> Figura 3: complementação de fluorescência bimolecular de Caspase-2 (BiFC) seguindo o dano do ADN. Células HeLa, expressando os caspase-2 BiFC componentes foram deixadas não tratado (A) ou tratadas com camptothecin (100 µM) (B) na presença do qVD-OPH (20 µM). mCherry foi co expressa como repórter fluorescente. Imagens representativas mostram células (vermelho) com BiFC de caspase-2 (verde) em células tratadas camptothecin 16 h após o tratamento. Barras de escala representam 20 µm. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57316/57316fig3large.jpg" target="_blank">clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57316/57316fig4.jpg"> Figura 4: localização de complementação de fluorescência bimolecular caspase-2 (BiFC). Células HeLa expressando os caspase-2 BiFC componentes e um repórter fluorescente nuclear foram tratadas com camptothecin (20 µM) na presença do qVD-OPH (20 µM). Reconstruções 3D composta de 0,1 μm serial imagens confocal à z-avião da célula foram feitas após 24 h e mostrar o núcleo em vermelho e caspase-2 BiFC em verde. O painel esquerdo mostra uma reconstrução de renderização de projeção 3D de intensidade máxima (ver também 1 filme). O painel direito mostra a exibição de fatias ortogonal da mesma célula. Caixa média (azul) é o plano XY , caixa da direita (amarelo) é o plano yz e caixa superior (branco) é o plano xz . Os planos yz e xz cruzam-se de acordo com a mira. Barras de escala representam 10 µm. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57316/57316fig4large.jpg" target="_blank">clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57316/57316fig5.jpg"> Figura 5: Time-Lapse de caspase complementação de fluorescência bimolecular (BiFC) (A) LN18 glioblastoma células transfectadas com os caspase-2 BiFC componentes e um marcador mitocondrial fluorescente vermelho (DsRed-mito, vermelho) foram tratados com bortezomib (15 nM) na presença do qVD-OPH (20 µM). As células foram colocadas em um microscópio confocal a 37 ° C e imagens foram tiradas a cada 2 min para 8 h. imagens de células representativas do show lapso de tempo que a proximidade induzida dos dois componentes caspase-2 BiFC resultou em um aumento na fluorescência de Venus ( verde) ao longo do tempo. (B) a intensidade média de Vênus em cada célula em cada ponto de tempo era medida. Fluorescência de Vênus aumentou ao longo do tempo após o tratamento bortezomib. Divisão no controle não tratado indicou condições de toxicidade baixa ou insignificante de luz de laser (figura adaptada de 20). Escala barras representam 20 µm. barras de erro representam o erro padrão da média (SEM) de 8 (controle) e 14 (bortezomib) de células individuais (Veja também o filme 2). <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57316/57316fig5large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Tamanho da placa</td>
			<td>Número de células</td>
			<td>Volume de mídia</td>
		</tr>
<tr>
<td>6 placa bem</td>
			<td>1 x 105 células / bem</td>
			<td>2 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>12 placa bem</td>
			<td>5 x 104 células / bem</td>
			<td>1 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>24 prato bem</td>
			<td>2.5 x 104 células / bem</td>
			<td>0,5 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>prato de câmara 4</td>
			<td>2.5 x 104 células / câmara</td>
			<td>1 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>prato de câmara 8</td>
			<td>1,25 x 104 células / câmara</td>
			<td>0,5 mL</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabela 1: orientações para um número de células para placa. Se usando células estàvel expressando os componentes de complementação (BiFC) de fluorescência bimolecular caspase, placa dobro as quantias mostradas aqui.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Tamanho da placa</td>
			<td>Reagente de transfeccao</td>
			<td>Mídia de soro reduzida</td>
			<td>Repórter do</td>
			<td>Plasmídeo de caspase-pro VC</td>
			<td>Plasmídeo VN caspase-pro</td>
			<td>Mídia de reduzida soro adicionada à mistura do plasmídeo</td>
			<td>Solução de reagente de transfeccao adicionada à mistura do plasmídeo</td>
			<td>Meios livres de soro adicionados às células</td>
		</tr>
<tr>
<td>6 placa bem</td>
			<td>12 µ l/placa</td>
			<td>750 Μ l</td>
			<td>10 ng</td>
			<td>20 ng</td>
			<td>20 ng</td>
			<td>ao total de 100 µ l</td>
			<td>100 Μ l</td>
			<td>800 Μ l</td>
		</tr>
<tr>
<td>12 placa bem</td>
			<td>12 µ l/placa</td>
			<td>750 Μ l</td>
			<td>5 ng</td>
			<td>10 ng</td>
			<td>10 ng</td>
			<td>ao total de 50 µ l</td>
			<td>50 Μ l</td>
			<td>400 Μ l</td>
		</tr>
<tr>
<td>24 prato bem</td>
			<td>12 µ l/placa</td>
			<td>750 Μ l</td>
			<td>2,5 ng</td>
			<td>5 ng</td>
			<td>5 ng</td>
			<td>ao total de 25 µ l</td>
			<td>25 Μ l</td>
			<td>200 Μ l</td>
		</tr>
<tr>
<td>prato de câmara 4</td>
			<td>4 µ l/placa</td>
			<td>250 Μ l</td>
			<td>2,5 ng</td>
			<td>5 ng</td>
			<td>5 ng</td>
			<td>ao total de 25 µ l</td>
			<td>25 Μ l</td>
			<td>200 Μ l</td>
		</tr>
<tr>
<td>prato de câmara 8</td>
			<td>4 µ l/placa</td>
			<td>250 Μ l</td>
			<td>1.25 ng</td>
			<td>2,5 ng</td>
			<td>2,5 ng</td>
			<td>a total 12,5 µ l</td>
			<td>12,5 Μ l</td>
			<td>100 Μ l</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabela 2: recomendado volumes dos reagentes utilizados para transientes do transfection. Nota: a quantidade de plasmídeo sugerida é apenas um ponto de partida. Se nenhum sinal for detectado, é aconselhável titula-se o plasmídeo de 20-200 ng por alvéolo de uma placa de 6.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Caspase</td>
			<td>Tratamento</td>
			<td>Concentração</td>
			<td>Tempo</td>
			<td>Resultados esperados</td>
		</tr>
<tr>
<td>Caspase-1</td>
			<td>ASC over expressa</td>
			<td>250 ng/bem de uma placa bem 6</td>
			<td>48 h</td>
			<td>50% BiFC positivo</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">Caspase-2</td>
			<td>RAIDD over expressa</td>
			<td>500 ng/bem de uma placa bem 6</td>
			<td>24 h</td>
			<td>90% BiFC positivo</td>
		</tr>
<tr>
<td>Camptothecin</td>
			<td>100 ΜM</td>
			<td>16 h</td>
			<td>30-60% BiFC positivo</td>
		</tr>
<tr>
<td>Choque de calor</td>
			<td>1 h a 45 ° C</td>
			<td>16 h</td>
			<td>80% BiFC positivo</td>
		</tr>
<tr>
<td>Caspase-4</td>
			<td>NALP1 Blumental</td>
			<td>250 ng/bem de uma placa bem 6</td>
			<td>48 h</td>
			<td>30% BiFC positivo</td>
		</tr>
<tr>
<td>Caspase-5</td>
			<td>IPAF Blumental</td>
			<td>250 ng/bem de uma placa bem 6</td>
			<td>48 h</td>
			<td>15% BiFC positivo</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabela 3: exemplos de controlos positivos para complementação de fluorescência bimolecular caspase (BiFC). As condições e os resultados esperados são baseados em dados publicados usando o Pro constrói 14,17,18. Plasmídeos co expressos devem transfected juntamente com o plasmídeo BiFC (etapa 2.1.4)
<img alt="Movie 1" src="/files/ftp_upload/57316/57316video1.jpg"> Filme 1: 3D localização de complementação de fluorescência bimolecular caspase-2 (BiFC). Reconstrução 3D, girava em torno do y-eixo de imagens confocal à z-avião de um Hela células expressando os componentes de caspase-2-BiFC e um repórter fluorescente nuclear foram tratados com camptothecin (20 µM) por 16 h. O filme mostra a caspase-2 BiFC (verde) e o núcleo (vermelho). <a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57316/3D_(Turn_around_Y).avi" target="_blank">Por favor clique aqui para ver este vídeo. (Botão direito do mouse para fazer o download.)</a>
<img alt="Movie 2" src="/files/ftp_upload/57316/57316video2.jpg"> Movie 2: Time-Lapse de complementação de fluorescência bimolecular caspase-2 (BiFC). LN18 glioblastoma células transfectadas com os caspase-2 BiFC componentes e tratados com bortezomib (15 nm) foram fotografada a cada 2 min para 8 h. O filme mostra a caspase-2 BiFC (verde) e as mitocôndrias (vermelho). <a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57316/Movie2.avi" target="_blank">Por favor clique aqui para ver este vídeo. (Botão direito do mouse para fazer o download.)</a>

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Lighting Up the Pathways to Caspase Activation Using Bimolecular Fluorescence Complementation

Este protocolo descreve caspase Bimolecular complementação de fluorescência (BiFC); um método baseado em imagens que pode ser usado para visualizar induzida proximidade das caspases de iniciador, que é o primeiro passo para sua ativação.

Iluminando os caminhos para a ativação de Caspase usando fluorescência Bimolecular complementação

The caspase family of proteases play essential roles in apoptosis and innate immunity. Among these, a subgroup known as initiator caspases are the first ...

lighting-up-pathways-to-caspase-activation-using-bimolecular

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biochemistry

9.0K visualizações.  Baylor College of Medicine. Este protocolo descreve caspase Bimolecular complementação de fluorescência (BiFC); um método baseado em imagens que pode ser usado para visualizar induzida proximidade das caspases de iniciador, que é o primeiro passo para sua ativação.

Vídeo: Lighting Up the Pathways to Caspase Activation Using Bimolecular Fluorescence Complementation

Use of a Caspase Multiplexing Assay to Determine Apoptosis in a Hypothalamic Cell Model

The ability to multiplex assays in studies of complex cellular mechanisms eliminates the need for repetitive experiments, provides internal controls, and decreases waste in costs and reagents. Here we describe optimization of a multiplex assay to assess apoptosis following a palmitic acid (PA) challenge in an in vitro hypothalamic model, using both fluorescent and luminescent based assays to measure viable cell counts and caspase-3/7 activity in a 96-well microtiter plate format. Following PA challenge, viable cells were determined by a resazurin-based fluorescent assay. Caspase-3/7 activity was then determined using a luminogenic substrate, DEVD, and normalized to cell number. This multiplexing assay is a useful technique for determining change in caspase activity following an apoptotic stimulus, such as saturated fatty acid challenge. The saturated fatty acid PA can increase hypothalamic oxidative stress and apoptosis, indicating the potential importance of assays such as that described here in studying the relationship between saturated fatty acids and neuronal function.

Multiplex assays can provide beneficial information for basic cellular mechanisms&#160;and eliminate waste of reagents and unnecessary repetitive experiments. We describe here a multiplex caspase-3/7 activity assay, using fluorescent- and luminescent-based methods, to determine cell viability in an in vitro hypothalamic model following oxidative challenge with palmitic acid.

Utilização de uma caspase Multiplexing ensaio para determinar a apoptose em um modelo de célula hipotalâmica

The ability to multiplex assays in studies of complex cellular mechanisms eliminates the need for repetitive experiments, provides internal controls, and ...

Neurociência

Measuring Caspase Activity Using a Fluorometric Assay or Flow Cytometry

The activation of cysteine proteases, known as caspases, remains an important process in multiple forms of cell death. Caspases are critical initiators and executioners of apoptosis, the most studied form of programmed cell death. Apoptosis occurs during developmental processes and is a necessary event in tissue homeostasis. Pyroptosis is another form of cell death that utilizes caspases and is a critical process in activating the immune system through the activation of the inflammasome, which results in the release of members of the interleukin-1 (IL-1) family. To assess caspase activity, target substrates can be assessed. However, sensitivity can be an issue when examining single cells or low-level activity. We demonstrate how a fluorogenic substrate can be used with a population-based assay or single-cell assay by flow cytometry. With proper controls, different amino acid sequences can be used to identify which caspases are active. Using these assays, the simultaneous loss of the inhibitors of apoptosis proteins upon tumor necrosis factor (TNF) stimulation has been identified, which primarily induces apoptosis in macrophages rather than other forms of cell death.

The present protocol describes two methods to measure caspase activity through a fluorogenic substrate using flow cytometry or a spectrofluorometer.

Medindo a atividade da caspase usando um ensaio fluorométrico ou citometria de fluxo

The activation of cysteine proteases, known as caspases, remains an important process in multiple forms of cell death. Caspases are critical initiators ...

Bioquímica

Bimolecular Fluorescence Complementation

Defining the subcellular distribution of signaling complexes is imperative to understanding the output from that complex. Conventional methods such as immunoprecipitation do not provide information on the spatial localization of complexes. In contrast, BiFC monitors the interaction and subcellular compartmentalization of protein complexes. In this method, a fluororescent protein is split into amino- and carboxy-terminal non-fluorescent fragments which are then fused to two proteins of interest. Interaction of the proteins results in reconstitution of the fluorophore (Figure 1)1,2. A limitation of BiFC is that once the fragmented fluorophore is reconstituted the complex is irreversible3. This limitation is advantageous in detecting transient or weak interactions, but precludes a kinetic analysis of complex dynamics. An additional caveat is that the reconstituted flourophore requires 30min to mature and fluoresce, again precluding the observation of real time interactions4. BiFC is a specific example of the protein fragment complementation assay (PCA) which employs reporter proteins such as green fluorescent protein variants (BiFC), dihydrofolate reductase, b-lactamase, and luciferase to measure protein:protein interactions5,6. Alternative methods to study protein:protein interactions in cells include fluorescence co-localization and F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET)7. For co-localization, two proteins are individually tagged either directly with a fluorophore or by indirect immunofluorescence. However, this approach leads to high background of non-interacting proteins making it difficult to interpret co-localization data. In addition, due to the limits of resolution of confocal microscopy, two proteins may appear co-localized without necessarily interacting. With BiFC, fluorescence is only observed when the two proteins of interest interact. FRET is another excellent method for studying protein:protein interactions, but can be technically challenging. FRET experiments require the donor and acceptor to be of similar brightness and stoichiometry in the cell. In addition, one must account for bleed through of the donor into the acceptor channel and vice versa. Unlike FRET, BiFC has little background fluorescence, little post processing of image data, does not require high overexpression, and can detect weak or transient interactions. Bioluminescence resonance energy transfer (BRET) is a method similar to FRET except the donor is an enzyme (e.g. luciferase) that catalyzes a substrate to become bioluminescent thereby exciting an acceptor. BRET lacks the technical problems of bleed through and high background fluorescence but lacks the ability to provide spatial information due to the lack of substrate localization to specific compartments8. Overall, BiFC is an excellent method for visualizing subcellular localization of protein complexes to gain insight into compartmentalized signaling.

The subcellular localization of proteins is important in determining the spatio-temporal regulation of cell signaling. Here, we describe bimolecular fluorescence complementation (BiFC) as a straightforward method for monitoring the spatial interactions of proteins in the cell.

Complementação de fluorescência bimolecular

Defining the subcellular distribution of signaling complexes is imperative to understanding the output from that complex. Conventional methods such as ...

Biologia

Detecting Anastasis In Vivo by CaspaseTracker Biosensor

Anastasis (Greek for &#8220;rising to life&#8221;) is a recently discovered cell recovery phenomenon whereby dying cells can reverse late-stage cell death processes that are generally assumed to be intrinsically irreversible. Promoting anastasis could in principle rescue or preserve injured cells that are difficult to replace such as cardiomyocytes or neurons, thereby facilitating tissue recovery. Conversely, suppressing anastasis in cancer cells, undergoing apoptosis after anti-cancer therapies, may ensure cancer cell death and reduce the chances of recurrence. However, these studies have been hampered by the lack of tools for tracking the fate of cells that undergo anastasis in live animals. The challenge is to identify the cells that have reversed the cell death process despite their morphologically normal appearance after recovery. To overcome this difficulty, we have developed Drosophila and mammalian CaspaseTracker biosensor systems that can identify and permanently track the anastatic cells in vitro or in vivo. Here, we present in vivo protocols for the generation and use of the CaspaseTracker dual biosensor system to detect and track anastasis in Drosophila melanogaster after transient exposure to cell death stimuli. While conventional biosensors and protocols can label cells actively undergoing apoptotic cell death, the CaspaseTracker biosensor can permanently label cells that have recovered after caspase activation - a hallmark of late-stage apoptosis, and simultaneously identify active apoptotic processes. This biosensor can also track the recovery of the cells that attempted other forms of cell death that directly or indirectly involved caspase activity. Therefore, this protocol enables us to continuously track the fate of these cells and their progeny, facilitating future studies of the biological functions, molecular mechanisms, physiological and pathological consequences, and therapeutic implications of anastasis. We also discuss the appropriate controls to distinguish cells that undergo anastasis from those that display non-apoptotic caspase activity in vivo.

Detecting Anastasis In Vivo by CaspaseTracker Biosensor

Anastasis is technically challenging to detect in vivo because the cells that have reversed the cell death process can be morphologically indistinguishable from normal healthy cells. Here we describe protocols for detecting and tracking cells that undergo anastasis in live animals by using our newly developed in vivo CaspaseTracker biosensor system.

Detecção de Anastasis na Vivo por CaspaseTracker Biosensor

Anastasis (Greek for &#8220;rising to life&#8221;) is a recently discovered cell recovery phenomenon whereby dying cells can reverse late-stage cell death ...

Medicina

Visualization of Inflammatory Caspases Induced Proximity in Human Monocyte-Derived Macrophages

Inflammatory caspases include caspase-1, -4, -5, -11, and -12 and belong to the subgroup of initiator caspases. Caspase-1 is required to ensure correct regulation of inflammatory signaling and is activated by proximity-induced dimerization following recruitment to inflammasomes. Caspase-1 is abundant in the monocytic cell lineage and induces maturation of the pro-inflammatory cytokines interleukin (IL)-1&#946; and IL-18 to active secreted molecules. The other inflammatory caspases, caspase-4 and -5 (and their murine homolog caspase-11) promote IL-1&#946; release by inducing pyroptosis. Caspase Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) is a tool used to measure inflammatory caspase induced proximity as a readout of caspase activation. The caspase-1, -4, or -5 prodomain, which contains the region that binds to the inflammasome, is fused to non-fluorescent fragments of the yellow fluorescent protein Venus (Venus-N [VN] or Venus-C [VC]) that associate to reform the fluorescent Venus complex when the caspases undergo induced proximity. This protocol describes how to introduce these reporters into primary human monocyte-derived macrophages (MDM) using nucleofection, treat the cells to induce inflammatory caspase activation, and measure caspase activation using fluorescence and confocal microscopy. The advantage of this approach is that it can be used to identify the components, requirements, and localization of the inflammatory caspase activation complex in living cells. However, careful controls need to be considered to avoid compromising cell viability and behavior. This technique is a powerful tool for the analysis of dynamic caspase interactions at the inflammasome level as well as for the interrogation of the inflammatory signaling cascades in living MDM and monocytes derived from human blood samples.

This protocol describes the workflow to obtain monocytes-derived macrophages (MDM) from human blood samples, a simple method to efficiently introduce inflammatory caspase Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) reporters into human MDM without compromising cell viability and behavior, and an imaging-based approach to measure inflammatory caspase activation in living cells.

Visualização de Caspases Inflamatórias Induzidas proximidade em macrófagos derivados de monócitos humanos

Inflammatory caspases include caspase-1, -4, -5, -11, and -12 and belong to the subgroup of initiator caspases. Caspase-1 is required to ensure correct ...

Imunologia e Infecção

Evaluation of Caspase Activation to Assess Innate Immune Cell Death

Innate immunity provides the critical first line of defense in response to pathogens and sterile insults. A key mechanistic component of this response is the initiation of innate immune programmed cell death (PCD) to eliminate infected or damaged cells and propagate immune responses. However, excess PCD is associated with inflammation and pathology. Therefore, understanding the activation and regulation of PCD is a central aspect of characterizing innate immune responses and identifying new therapeutic targets across the disease spectrum.
This protocol provides methods for characterizing innate immune PCD activation by monitoring caspases, a family of cysteine-dependent proteases that are often associated with diverse PCD pathways, including&#160;apoptosis,&#160;pyroptosis, necroptosis, and PANoptosis. Initial reports characterized caspase-2, caspase-8, caspase-9, and caspase-10 as initiator caspases and caspase-3, caspase-6, and caspase-7 as effector caspases in apoptosis, while later studies found the inflammatory caspases, caspase-1, caspase-4, caspase-5, and caspase-11, drive pyroptosis. It is now known that there is extensive crosstalk between the caspases and other innate immune and&#160;cell death molecules across the previously defined PCD pathways, identifying a key knowledge gap in the mechanistic understanding of innate immunity and PCD and&#160;leading to the characterization of PANoptosis. PANoptosis is a unique innate immune inflammatory PCD pathway regulated by PANoptosome complexes, which integrate components, including caspases,&#160;from other cell death pathways.
Here, methods for assessing the activation of caspases in response to various stimuli are provided. These methods allow for the characterization of PCD pathways both in vitro and in vivo, as activated caspases undergo proteolytic cleavage that can be visualized by western blotting using optimal antibodies and blotting conditions. A protocol and western blotting workflow have been established that allow for the assessment of the activation of multiple caspases from the same cellular population, providing a comprehensive characterization of the PCD processes. This method can be applied across research areas in development, homeostasis, infection, inflammation, and cancer to evaluate PCD pathways throughout cellular processes in health and disease.

This protocol describes a comprehensive method for assessing caspase activation (caspase-1, caspase-3, caspase-7, caspase-8, caspase-9, and caspase-11) in response to both in vitro and in vivo (in mice) models of infection, sterile insults, and cancer to determine the initiation of cell death pathways, such as pyroptosis, apoptosis, necroptosis, and PANoptosis.

Avaliação da ativação da caspase para avaliar a morte de células imunes inatas

Innate immunity provides the critical first line of defense in response to pathogens and sterile insults. A key mechanistic component of this response is ...

Strategies for Tracking Anastasis, A Cell Survival Phenomenon that Reverses Apoptosis

Anastasis (Greek for &#8220;rising to life&#8221;) refers to the recovery of dying cells. Before these cells recover, they have passed through important checkpoints of apoptosis, including mitochondrial fragmentation, release of mitochondrial cytochrome c into the cytosol, activation of caspases, chromatin condensation, DNA damage, nuclear fragmentation, plasma membrane blebbing, cell shrinkage, cell surface exposure of phosphatidylserine, and formation of apoptotic bodies. Anastasis can occur when apoptotic stimuli are removed prior to death, thereby allowing dying cells to reverse apoptosis and potentially other death mechanisms. Therefore, anastasis appears to involve physiological healing processes that could also sustain damaged cells inappropriately. The functions and mechanisms of anastasis are still unclear, hampered in part by the limited tools for detecting past events after the recovery of apparently healthy cells. Strategies to detect anastasis will enable studies of the physiological mechanisms, the hazards of undead cells in disease pathology, and potential therapeutics to modulate anastasis. Here, we describe effective strategies using live cell microscopy and a mammalian caspase biosensor&#160;for identifying and tracking anastasis in mammalian cells.

The term anastasis refers to the phenomenon in which dying cells reverse a cell suicide process at a late stage, repair themselves, and ultimately survive. Here we demonstrate protocols for detecting and tracking cells that undergo anastasis.

Estratégias para Rastreamento Anastasis, uma célula de sobrevivência Fenômeno que reverte apoptose

Anastasis (Greek for &#8220;rising to life&#8221;) refers to the recovery of dying cells. Before these cells recover, they have passed through important ...

In Vivo Biosensor Tracks Non-apoptotic Caspase Activity in Drosophila

Caspases are the key mediators of apoptotic cell death via their proteolytic activity. When caspases are activated in cells to levels detectable by available technologies, apoptosis is generally assumed to occur shortly thereafter. Caspases can cleave many functional and structural components to cause rapid and complete cell destruction within a few minutes. However, accumulating evidence indicates that in normal healthy cells the same caspases have other functions, presumably at lower enzymatic levels. Studies of non-apoptotic caspase activity have been hampered by difficulties with detecting low levels of caspase activity and with tracking ultimate cell fate in vivo. Here, we illustrate the use of an ultrasensitive caspase reporter, CaspaseTracker, which permanently labels cells that have experienced caspase activity in whole animals. This in vivo dual color CaspaseTracker biosensor for Drosophila melanogaster transiently expresses red fluorescent protein (RFP) to indicate recent or on-going caspase activity, and permanently expresses green fluorescent protein (GFP) in cells that have experienced caspase activity at any time in the past yet did not die. Importantly, this caspase-dependent in vivo biosensor readily reveals the presence of non-apoptotic caspase activity in the tissues of organ systems throughout the adult fly. This is demonstrated using whole mount dissections of individual flies to detect biosensor activity in healthy cells throughout the brain, gut, malpighian tubules, cardia, ovary ducts and other tissues. CaspaseTracker detects non-apoptotic caspase activity in long-lived cells, as biosensor activity is detected in adult neurons and in other tissues at least 10 days after caspase activation. This biosensor serves as an important tool to uncover the roles and molecular mechanisms of non-apoptotic caspase activity in live animals.

In Vivo Biosensor Tracks Non-apoptotic Caspase Activity in Drosophila

To detect healthy cells in whole animals that contain low levels of caspase activity, the highly sensitive biosensor designated CaspaseTracker was generated for Drosophila. Caspase-dependent biosensor activity is detected in long-lived healthy cells throughout the internal organs of adult animals reared under optimized conditions in the absence of death stimuli.

In Vivo Biosensor Tracks apoptótica não-Caspase Atividade em Drosophila

Caspases are the key mediators of apoptotic cell death via their proteolytic activity. When caspases are activated in cells to levels detectable by ...

Visualization of Caspase Activation in Human Monocyte-Derived Macrophages

Source: Bol&#237;var, B. E., et. al., <a href="https://app-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/v/63162">Visualization of Inflammatory Caspases Induced Proximity in Human Monocyte-Derived Macrophages.</a> J. Vis. Exp. (2022).
This video demonstrates the activation of caspase proteins in human macrophages using bimolecular fluorescence complementation reporter proteins. The pro-domains of caspase-1 are fused with non-fluorescent fragments of Venus proteins, which are recruited to inflammasome complexes. The proximity of inflammasomes induces the refolding and fluorescence of Venus fragments, confirming caspase activation in the macrophages.

Visualização da ativação de caspase em macrófagos derivados de monócitos humanos

Source: Bol&#237;var, B. E., et. al., Visualization of Inflammatory Caspases Induced Proximity in Human Monocyte-Derived Macrophages. J. Vis. Exp. 
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JoVE Encyclopedia of Experiments

Imunologia

Resposta Imune

Modulação Imunológica

Chemiluminescent Western Blot Assay for Protein Processing

Source: Hillert-Richter, L. K. et al., <a href="https://app-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/v/62842">Measuring Composition of CD95 Death-Inducing Signaling Complex and Processing of Procaspase-8 in this Complex.</a> J. Vis. Exp. (2021).
This video describes the chemiluminescence-based western blotting of immunoprecipitated lysates. The technique helps determine protein processing and activation. The chemiluminescent signal detected is proportional to the level of protein processing during its activation.

Ensaio de Western Blot Quimioluminescente para Processamento de Proteínas

Source: Hillert-Richter, L. K. et al., Measuring Composition of CD95 Death-Inducing Signaling Complex and Processing of Procaspase-8 in this Complex. J. ...