Agradecemos Darren Obbard imagem de Drosophila em Figura 3 e no manuscrito de vídeo; J. Marie Hardwick, Wade Gibson e Heather M. Lamb para discussão valiosa sobre este manuscrito. Este trabalho foi apoiado por um Sir Edward Youde Memorial Fellowship (H.L.T.), Dr. Walter Szeto Memorial Scholarship (H.L.T.), Fulbright conceder 007-2009 (H.L.T.), Life Science Research Foundation fellowship (H.L.T.) e o ICN K22 concedem CA204458 (H.L.T.). Ho Lam Tang era um Shurl e Kay Curci Fundação Fellow da Fundação de pesquisa de Ciências da vida (2014-2017).

1) preparação de moscas CaspaseTracker Biosensor
<ol><li>Anestesiar moscas com CO2e use um pincel para transferência de 7 a 10 sensíveis à caspase Gal4 (DQVD)19 virgem fêmeas e 7 a 10 G-rastreamento53 Gal4 repórter jovem masculinas moscas (ou vice-versa) no mesmo frasco com comida de mosca e colar de fermento fresco. Nota: Cruz de moscas Gal4 Caspase-sensível (DQVD) e G-rastreamento produzirá moscas de descendência CaspaseTracker. Cruz da Caspase -nosensível (DQVA)19 Gal4 e moscas G-rastreamento irão fornecer controle negativo voa (ver discussão). Fermento fresco colar serve como fonte de proteína para aumentar a produção de ovos, assim que aumenta o número de descendentes. Selecionar as fêmeas virgens e jovem macho voa de acordo com seus fenótipos54.</li>
	<li>Incubar as moscas a 18 graus Celsius (oC) durante a Cruz por 3 a 7 dias e depois transferir as moscas para um novo frasco para configurar uma nova Cruz a 18 ° C. Continue a incubar o frasco original a 18 ° C até a descendência voa eclose. Nota: Transferi o pai voa para novos frascos para evitar superlotação de progênie no frasco original. Moscas de pai podem produzir progênie com alimentos frescos e colar de levedura nos primeiro de 2 a 3 interruptores, e então a produtividade diminuirá significativamente com o tempo. Levantando moscas 18 ° C pode reduzir o sinal específico de biosensor CaspaseTracker (ver discussão).</li>
	<li>Selecione progênie voa com fenótipos correto54 para experimentos seguintes. Nota: Os transgenes de caspase-sensível Gal4 e G-rastreamento aqui estão localizados no cromossomo segundo, equilibrado com balanceador CyO. Selecione a progenitura de asa não-curly (sem CyO), que tem ambos os transgenes de caspase-sensível Gal4 e G-rastreamento.</li>
</ol>2) a aplicação de indução de morte celular transitória para moscas CaspaseTracker Biosensor
<ol><li>Transferência de 10 a 20 recém eclosed fêmea voa para um novo frasco com alimentos frescos de voar e colar de fermento fresco para 1 dia a 18 ° C, para permitir a produção de câmara de ovos pela ovogênese. Nota: Mantendo a fêmea com moscas machos pode aumentar a produção de câmara de ovos.</li>
	<li>Para câmaras de ovo submeter-se a apoptose por choque frio, transferência de induzir a fêmea voa para novo frasco vazio, que é então colocado a-7 ° C durante 1 h. Nota: choque frio fere células através da indução de55,de ruptura de membrana plasmática56.</li>
	<li>Para induzir o ovo câmaras submeter-se a apoptose por inanição de proteína, transferi as moscas fêmeas para um novo frasco com 8% de sacarose e 1% alimentos de ágar a 18 ° C durante 3 dias. Nota: Fome de proteínas (alimentos não proteico) pode desencadear câmaras de ovo para se submeter a apoptose57,58,59 e autofagia60,61. Interruptor voa para um novo frasco com comida de ágar de sacarose e 1% de 8% todos os dias para manter a condição ideal de sacarose a comida de mosca.</li>
	<li>Transferi as moscas estressadas volta para um novo frasco com alimentos frescos de voar e colar de fermento fresco por 3 dias a 18 ° C, para permitir-lhes para se recuperar. Disse a fome e as moscas de fome-recuperado para obter câmaras de ovo de ovários como descrito62. Nota: Para dissecar drosófila para obter os ovários, anestesiar moscas com CO2e usar 2 pares de pinças para remover a cabeça de mosca e use a pinça para puxar a base do abdômen para remover os ovários das moscas.</li>
</ol>3) fixação e coloração das câmaras de ovo dissecado para a imagem latente
<ol><li>Transferi as câmaras dissecado ovo junto com ao redor de soro fisiológico 0,5 mL tamponado fosfato (PBS) para tubos de centrífuga de 1 mL. Permitir que os ovos se acalmar. Nota: Cubra as pontas de pipetas de plástico com 1% albumina de soro bovino (BSA) dissolvido em água ou PBS para evitar que as câmaras de ovo para ficar na superfície de plástico das dicas. Execute os seguintes procedimentos no escuro para evitar fotobranqueamento de proteína fluorescente vermelha (RFP, também conhecido como DsRed) e proteína verde fluorescente (GFP) na sala do ovo.</li>
	<li>Remova a PBS pipetando e então aplique paraformaldeído 4% de 0,5 mL de PBS para corrigir as câmaras de ovo em temperatura ambiente no escuro por 20 a 30 min. Nota: Aplica rotação suave neste e as seguintes etapas de incubação.</li>
	<li>Remover o paraformaldeído pipetando e em seguida, lavou a câmara de ovo com 0,5 mL PBST (PBS + 0,1% Triton X-100) por 3 vezes. Nota: Fixação prolongada poderia reduzir os sinais RFP e GFP.</li>
	<li>Incubar as câmaras de ovo com PBST para 1 a 2 h à temperatura ambiente ou durante a noite a 4 ° C, com suave rotação para permeabilize as câmaras de ovo. Nota: PBST também pode evitar câmaras de ovo para manter a superfície de plástico revestida não-BSA.</li>
	<li>Remover o PBST pipetando e em seguida, aplicar 0,5 mL de 10 μg/mL de corante azul de Hoechst nuclear em PBST ovo câmaras para 1 a 2 h à temperatura ambiente a mancha para núcleo. NOTA1: Evite a incubação prolongada com corante nuclear como isto irá aumentar o sinal específico. Obs2: Uma abordagem alternativa para manchar o núcleo sem Hoechst é adicionar 200 agente μL de montagem de antibranqueamento com DAPI (ver materiais) e incubar durante a noite,63, antes de montar os tecidos no deslizamento da tampa de vidro, conforme descrito no protocolo 3.8. Note3: executar a coloração e os procedimentos a seguir no escuro para evitar fotobranqueamento.</li>
	<li>Remover o corante nuclear pipetando e em seguida, aplicar 0,5 mL PBST lavar as câmaras de ovo em tubos de centrífuga de 1 mL por 3 vezes, com incubação de 10 a 20 min com suave rotação entre cada etapa de lavagem.</li>
	<li>Remover todos os PBST com pipeta fina e em seguida, aplicar 200 agente de montagem antibranqueamento μL (ver materiais) para incubar as câmaras de ovo em temperatura ambiente por 3 h ou durante a noite a 4 ° C até que as câmaras de ovo afundam até o fundo do tubo. Nota: os tecidos que absorveram plenamente o agente de montagem afundam até o fundo do tubo.</li>
	<li>Montar as câmaras de ovo manchado por transferi-los com 200 μL antibranqueamento montagem agente sobre uma lâmina de vidro previamente limpos para a imagem latente por pipetagem, cobrir as câmaras de ovo com uma lamela de vidro previamente limpos de 20 x 20 mm e selar a lamínula sobre a lâmina de vidro, colocando esmalte na borda da lamínula. NOTA1: Limpeza prévia a lâmina de vidro e lamínulas com água ou 70% de etanol. Obs2: Aplique vaselina entre a lâmina de vidro e o deslizamento da tampa para evitar destruir as câmaras de ovo por overcompression.</li>
	<li>As câmaras de ovo usando fluorescência ou microscópio confocal, usando um x 20, at 0.8 de imagem plano-Apochromat objectivo, com excitação luz de comprimento de onda 405 nm para coloração nuclear (detectar emissões ~ 461 nm), 561 nm para (sinal RFP (atividade da caspase recentes ou em curso) detectar emissões ~ 590 nm) e 488 nm para sinal GFP (passado atividade caspase) (detectar emissões ~ 518nm). Nota: Consulte nossos protocolos publicados para microscopia20,64.</li>
</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

O sistema de dupla biosensor CaspaseTracker é uma nova e exclusiva ferramenta que permite a detecção de recente ou atividade caspase em curso e rastreamento de células que reverteram a morte celular processar e sobrevivem depois de experimentar caspase atividade na vivo. Enquanto atividade caspase tem sido tradicionalmente assume-se como uma marca registrada da apoptose, crescentes estudos revelam que não-apoptotic caspase atividade desempenha funções potenciais em funções diversas células normais, tais como a regulação da atividade neuronal79, 80, aprendizagem e memória81,,82,83,84, supressão de necroptotic célula morte85,86, nucleologênese individualização87, 88, microRNA processamento destino célula padronização91, proliferação de célula90e89. Além de apoptose e anastasis, o sistema de biosensor CaspaseTracker, portanto, pode detectar não-apoptotic caspase atividade, que está presente no cérebro e lóbulos de óptica, cárdia, intestino, Malpighi túbulos, traqueia, músculos e outros tecidos da Drosófila19,46,64. Este sinal de biosensor também poderia representar a atividade atual ou passado anastatic durante o desenvolvimento do embrião ou homeostase normal nestes tecidos. Para estudar o anastasis após estresse ambiental induzindo a morte celular transiente em animais vivos, é essencial escolher tecidos com as células que não exibem nenhuma atividade de biosensor caspase sob condições fisiológicas normais, mas que pode ser induzido a se submeter a caspase ativação por indução de morte celular transitória. Câmaras de ovo são ideais para essa finalidade, porque normalmente não têm nenhuma atividade de caspase de germarium para a fase 10 durante a ovogênese58,59,92.
Expondo feminino drosófila para transientes estresses ambientais, tais como proteínas fome e frio, choque, pode eficientemente desencadear ativação de caspase e morte celular no ovo câmaras19,57,58, 78. Passos críticos dentro do protocolo incluem evitar a indução de morte celular prolongada para moscas. As condições otimizadas de choque frio (1 h a-7 oC) a fêmea voa e fome de proteína (8% de sacarose em ágar de 1% para 3 dias) podem desencadear o processo de morte celular caspase-ativado nas câmaras de ovo e permitir-lhes para se recuperar após as estressado moscas são retornadas para condição normal19. Tratamento prolongado com um estímulo de morte celular pode desencadear mais câmaras de ovo para se submeter ao processo de morte celular, mas a taxa de recuperação também é reduzida, presumivelmente porque as câmaras de ovo moribundo experimentam enormes danos além do reparo.
Uma etapa crítica adicional neste protocolo é reduzir o sinal de fundo CaspaseTracker em câmaras de ovo pelo cruzamento, criando e mantendo que o CaspaseTracker voa em uma temperatura mais baixa, como 18 óC. Enquanto a maioria das câmaras de ovo de forma otimizada criados moscas não exibir atividade caspase no germarium fase 10 durante a ovogênese58, cerca de 1% das câmaras de ovo poderia apresentam atividade de biosensor caspase sem indução de morte celular19 . Isso pode refletir a taxa de atrito normal devido a erros inatos ou pode ser acionado involuntariamente durante a ovogênese pelas condições padrão de laboratório. Como Gal4 exibe menos atividade em moscas em baixa temperatura93, levantar moscas 18 oC, em vez de à temperatura ambiente, pode reduzir o sinal endógeno que ativa o sistema CaspaseTracker. Alternativamente, moscas de comutação para uma temperatura mais elevada, tais como 29 óC, pode aumentar a sensibilidade do sistema de CaspaseTracker, devido a aumentar a Gal4 atividade93e potencialmente outro endógeno dependente da temperatura enzimática atividades.
É importante distinguir as células CaspaseTracker-positivo que passam por processo de morte celular ou anastasis de células que apresentam não-apoptotic caspase atividade. Células apoptóticas expressam RFP (transiente marcador para atividade de caspases em andamento ou recente) e muitas vezes de GFP (fabricante de permanente para últimos atividade caspase) no tratamento de indução de apoptose, como estas células a morrer têm atividade caspase em curso que Gal4 cleave-ativado, que, em seguida ativa o transiente (Gal4 atividade dependente RFP) e permanente (Gal4 acionado FLPase-FRT mediada GFP) repórteres do sistema G-rastreamento. A apoptose destas células pode ser confirmada por morfológicos e bioquímicos timbres tais e.u. condensação nuclear detectado pela coloração com corantes nuclear14,19,58e clivagem de caspase detectado pelo immunostaining19,94. As células que já sofreram anastasis exibem permanente expressão de GFP devido o eventos de recombinação mediada por FLPase do sistema de rastreamento-G. Estas células expressam sem RFP como eles não têm nenhuma atividade de caspases em curso, nem outras marcas da apoptose19. Estas células também exibem normal morfologia nuclear. As células têm em curso não-apoptotic caspase atividade muitas vezes exibir expressão tanto RFP e GFP, e também tem uma morfologia nuclear normal19.
Pode ser difícil de distinguir células que experimentou anastasis partir dessas células que tinham passado não-apoptotic caspase atividade, porque ambos exibir apenas as boas práticas agrícolas e não tem nenhuma marca de morte celular. Portanto, o cuidadosos controle de experimentos devem ser incluídos19. Para exemplos, para estudar o anastasis nas câmaras de ovo, é essencial para examinar a expressão de GFP em moscas salientou-se recuperou e não-forçado moscas (controle negativo). Moscas recuperadas devem mostrar mais células GFP-expressando que moscas átonas, se anastasis ocorreu após a ativação de caspase. Também é importante distinguir os sinais fluorescentes CaspaseTracker de autofluorescência inespecífica, como observado na cutícula, pigmentos e corpos de gordura19. Geramos o controlo negativo biosensor moscas, transformando o local de clivagem de caspase do biosensor (DQVD), para uma sequência não-cleavable (DQVA) e tornando o biosensor de controle não-responsivos a caspase atividade19. O sinal detectado na caspase sensível (DQVD), mas não nas moscas de biosensor de controlo negativo (DQVA) é o sinal de interesse, provocado pela atividade de caspases, em vez de autofluorescência.
Nossa atual Drosophila dual CaspaseTracker biosensor pode identificar células com atividade de caspases "recente" pela expressão de RFP e células com atividade de caspases "passado" pela expressão de GFP19. Notamos que a RFP não é um indicador de atividade da caspase "tempo real", porque demora algumas horas de tempo de reação para Gal4 dirigir a expressão de RFP, em resposta à atividade de caspases. Para adicionar uma função de "tempo real", o Drosophila CaspaseTracker biosensor pode ser combinado com o recentemente desenvolvido iCasper biosensor52, um "tempo real" e "escuro a brilhante" em vivo biosensor que mostra apenas seu sinal far-red quando é clivados por caspases.
Além de apoptose, CaspaseTracker poderia potencialmente também ser ativado durante a tipos alternativos de morte celular como células podem mudar caminhos de morte celular durante seu curso que direta ou indiretamente envolve a ativação de caspase, tais como autofagia após fome95,96, necrose pela membrana de plasma frio induzida por choque ruptura19,55,56,78e induzido por staurosporine necroptosis97, 98. Nossos estudos actuais e anteriores demonstraram que o CaspaseTracker biosensores podem rotular células obtidas estas células morte induções em vitro ou na vivo17,18,19 , 20 , 21. como estas induções de morte celular sozinhos poderiam simultaneamente ativar múltiplas vias de morte celular nas mesmas células, a recuperação destas células a morrer sugere que anastasis é um fenômeno de recuperação celular geral que pode reverter a morte celular diferente processos, incluindo apoptose, autofagia, necrose e necroptosis, individualmente ou simultaneamente.
O biosensor na vivo CaspaseTracker facilitará a busca das funções ainda desconhecidas, mecanismos e implicações terapêuticas da anastasis (Figura 4)21. Para revelar a assinatura molecular da anastasis, realizamos estudos de microarray-curso a tempo inteiro-genoma gene expressão para analisar as células do fígado primário do mouse durante a reversão da apoptose induzida pelo etanol e curiosamente, encontrei alterações marcantes no transcrição de genes envolvidos em várias vias, incluindo pro-sobrevivência, antioxidação, resposta de dano do ADN, modificação de histona, angiogênese, migração celular e transformação18,21. Esta constatação é suportada pelo nosso estudo de validação da recuperação de células de câncer de fígado humano HepG2 de apoptose18,21e, também, um estudo recente de sequenciação do ARN independente das células HeLa, na recuperação de apoptose99. Curiosamente, a regulação de alguns fatores de pro-sobrevivência encontrados em células anastatic são também observadas na reversão de insuficiência cardíaca, progressão do tumor e recorrência do câncer100,101,102, sugerindo a eventual participação de anastasis. Para estudar as potencialidades fisiológicas, patológicas e terapêuticas da anastasis, é importante identificar as células anastatic e seguir o seu destino em pequenos animais, como isso permitirá estudos terapêuticos e mecanicistas. Nossa Drosophila e mamíferos CaspaseTracker biosensores serão ferramentas úteis para testar as contribuições potenciais de anastasis no desenvolvimento normal, homeostase, recuperação de tecido, evolução do tumor, recorrência de câncer e metástase. Conclusão destes estudos vai aumentar nossa compreensão da função natural de anastasis e oferecem um potencial para identificar Revolucionárias novas abordagens terapêuticas para doenças intratáveis por mediação de morte celular e sobrevivência através de controlando anastasis.

Programado a morte celular, tais como apoptose, desempenha um papel essencial no desenvolvimento embrionário e homeostase normal, eliminando indesejadas, feridas ou perigosas de células em organismos multicelulares1,2,3. A perda do equilíbrio entre a morte celular e sobrevivência pode levar a consequências fatais como câncer, insuficiência cardíaca, auto-imunidade e degeneração4,5,6,7,8. Ativação de carrasco caspases tem sido tradicionalmente considerada como o "ponto sem retorno" em apoptose9,10,11, que provoca rápida e maciça demolição celular12, 13,14,15,16. Desafio este dogma geral, temos demonstrado que culturas de células primárias moribundos e células cancerosas podem recuperar a não somente após a ativação de caspase, mas também seguir célula importante marcas de morte, incluindo blebbing de membrana plasmática, encolhimento celular, mitocondrial fragmentação, liberação de mitocondrial citocromo c no citosol, nuclear e condensação da cromatina, danos no DNA, fragmentação nuclear, célula superfície exposição de fosfatidilserina (PS) e formação de corpos apoptotic 17 , 18 , 19 , 20 , 21. propomos que anastasis é um fenómeno de recuperação de célula intrínsecas, como células morrendo podem recuperar após a remoção da célula morte estímulos17,18,19,20, 21. cunhou o termo "Anastasis" (Αναστάσης)18, que significa "subir de vida" em grego, para descrever este fenômeno de recuperação celular inesperado. Nossa observação de anastasis mais é suportada por recentes estudos independentes que também revelam a recuperação das células após a fosfatidilserina exteriorização22,23,24, limitado mitocondrial externa membrana de permeabilização25, ativação de linhagem mista como quinase (MLKL) e de encolhimento de célula26.
Caracterizar os mecanismos de regulação anastasis terá implicações fisiológicas, patológicas e terapêuticas mudança de paradigma. Anastasis poderia representar um mecanismo previamente desconhecido tilacoides para resgatar ou preservar importantes postmitotic células e tecidos que são difíceis de substituir e possivelmente conta para reversão de insuficiência cardíaca por descarga ventricular com ventricular esquerda assistir dispositivos (LVADs)27,28, recuperação de células fotorreceptoras após exposição transitória de luz excessiva29,30,31, ou reparação de neurônios depois de lesão cerebral32. Se então promover anastasis poderia reforçar a recuperação de células e tecidos. Por outro lado, anastasis pode ser uma tática de fuga inesperada, usada por células cancerosas a sobreviver a terapia de indução de morte celular, causando câncer recorrência17,18. Portanto, suprimindo o anastasis na morte de células cancerosas durante e após o tratamento do câncer pode ser uma romance estratégia terapêutica para curar o câncer, impedindo sua recaída.
Durante o processo de anastasis, achamos que algumas células recuperadas adquiriram permanentes alterações genéticas e foi submetido a transformação oncogênica, provavelmente devido a danos no DNA incorridos durante a apoptose18,20,21 . Inverter o processo de morte de células com DNA danificado pode ser um mecanismo de tumorigênese, potencialmente subjacente a observação que repetidas lesões no tecido aumenta o risco de câncer em uma variedade de tecidos, tais como lesões térmicas crônica do esôfago induzida pelo consumo de bebidas muito quentes33,34,35, lesão hepática devido ao alcoolismo36,37, evolução do tumor após genotóxicos câncer terapia38, 39,40e desenvolvimento de novos cancros de tecidos normais que surgem durante os intervalos entre os ciclos de terapia anti-câncer41,42,,43,44 . Se true, alvejando anastasis poderia impedir ou prender o desenvolvimento de câncer e progressão. Nós achamos que induzida por inanição moribundos células germinativas sofrem anastasis na re-alimentados Drosophila19.  Se anastasis ocorre em células germinativas com danos no DNA, pode ser conta para a observação de que prolongado estresse ambiental promove o desenvolvimento de doenças genéticas. Por exemplo, fomes contribuam para o desenvolvimento de doenças hereditárias transgeracional, como diabetes e doenças coronarianas45. Portanto, anastasis de compreensão pode levar a estratégias para a prevenção de doenças hereditárias causadas por este mecanismo potencial de desenvolvimento.
Para aproveitar a descoberta de anastasis e direcioná-lo para desenvolver terapias inovadoras, é essencial estudar a causa e consequência de anastasis em animais vivos. No entanto, tecnicamente é um desafio para identificar e rastrear anastatic células na vivo, porque as células que se recuperou do processo de morte celular aparecem morfologicamente indistinguíveis de células saudáveis normais, e não há nenhum biomarcador de anastasis identificados ainda17,18,21. Para resolver esses problemas, recentemente desenvolvemos um novo na vivo caspase biosensor designado "CaspaseTracker"19, para identificar e localizar as células que sobrevivem a apoptose depois de19,de ativação do caspase46, o marca registrada do apoptosis10,14. Distinguindo-a dos biosensores caspase "tempo real" como SCAT12,47, Apoliner48, CA-GFP49, ApoAlert18,50, C3AIs51 e iCasper52 que detecta atividade de caspases em curso, o biosensor CaspaseTracker adicionalmente apresenta a capacidade de permanentemente rotular as células nessa atividade caspase expressa mesmo transitoriamente. Portanto, o biosensor CaspaseTracker permite rastreamento de longo prazo de anastasis após reversão de caspase-mediada pilha morte processo em vivo.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1024">
	
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">CONSUMABLES AND REAGENTS</td>
			<td style="width:229px;"></td>
			<td style="width:225px;"></td>
			<td style="width:297px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">Vectashield mounting medium</td>
			<td style="width:229px;">Vector Products</td>
			<td style="width:225px;">H-1000</td>
			<td>Antifade mounting medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vectashield mounting medium (with DAPI)</td>
			<td style="width:229px;">Vector Products</td>
			<td style="width:225px;">H-1200</td>
			<td>Antifade mounting medium with DAPI</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Forceps</td>
			<td style="width:229px;">Ted Pella</td>
			<td style="width:225px;">#505 (110mm, #5)</td>
			<td>Dumont tweezer biology grade, stainless steel</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hanging Drop Slides</td>
			<td style="width:229px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:225px;">12-565B</td>
			<td>Glass slides</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hoechst 33342</td>
			<td style="width:229px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:225px;">H1399</td>
			<td>DNA stain</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mitotracker Red CMXRos&#160;</td>
			<td style="width:229px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:225px;">M-7512</td>
			<td>Mitochondria stain</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">Cleaved caspase-3 (Asp175) antibody</td>
			<td style="width:229px;">Cell Signaling Technology</td>
			<td style="width:225px;">#9661</td>
			<td>Stain for active fragment of caspase-3</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">Bovine Serum Albumin (BAS)</td>
			<td style="width:229px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:225px;">A8806</td>
			<td>Blocking agent for immunostaining</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">Phosphate Buffered Saline&#160;</td>
			<td style="width:229px;">VWR</td>
			<td style="width:225px;">114-056-101</td>
			<td>Medium for washing and immunostaining</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Triton&#8482; X-100</td>
			<td style="width:229px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:225px;">T8787</td>
			<td>Detergent for cell permeabilization</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">Name</td>
			<td style="width:229px;">Company</td>
			<td style="width:225px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">EQUIPMENT</td>
			<td style="width:229px;"></td>
			<td style="width:225px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LSM780 confocal microscope</td>
			<td style="width:229px;">Carl Zeiss</td>
			<td style="width:225px;">N/A</td>
			<td>Imaging</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">Carl Zeiss Stereomicroscope Stemi 2000&#160;</td>
			<td style="width:229px;">Carl Zeiss</td>
			<td style="width:225px;">N/A</td>
			<td>Drosophila dissection</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:273px;">AmScope Fiber Optic Dual Gooseneck Microscope Illuminator, 150W</td>
			<td style="width:229px;">AmScope</td>
			<td style="width:225px;">WBM99316&#160;</td>
			<td>Light source</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detecting anastasis in vivo by caspasetracker biosensor

Anastasis ("ressurreição para a vida" em grego) é um fenômeno de recuperação celular recentemente descoberto pelo qual as células a morrer pode reverter processos de morte celular do tarde-estágio que geralmente são considerados intrinsecamente irreversível. Promoção anastasis poderia no resgate de princípio ou preservar feridos células que são difíceis de substituir tais como cardiomyocytes ou neurônios, facilitando assim a recuperação do tecido. Por outro lado, suprimindo anastasis em células de câncer, passando por apoptose após terapias contra o cancro, pode assegurar a morte de células de câncer e reduzir as chances de recorrência. No entanto, estes estudos foram dificultados pela falta de ferramentas para controlar o destino das células que passam por anastasis em animais vivos. O desafio é identificar as células que reverteram o processo de morte celular apesar de sua aparência morfologicamente normal após a recuperação. Para superar esta dificuldade, nós desenvolvemos Drosophila e sistemas de biosensor CaspaseTracker mamíferos que podem identificar e controlar permanentemente o anastatic células in vitro ou in vivo. Aqui, apresentamos os protocolos na vivo para a geração e utilização do sistema CaspaseTracker dual biosensor para detectar e rastrear anastasis em Drosophila melanogaster após exposição transitória aos estímulos de morte celular. Enquanto biosensores convencionais e protocolos podem rotular as células ativamente submetidos à morte de células apoptóticas, o biosensor CaspaseTracker permanentemente pode rotular as células que se recuperaram após a ativação de caspase - uma marca registrada da apoptose do tarde-estágio, e simultaneamente identifica processos apoptotic ativo. Este biosensor também pode acompanhar a recuperação das células que tentou outras formas de morte celular que directa ou indirectamente envolvidas caspase atividade. Portanto, este protocolo permite-nos acompanhar continuamente o destino dessas células e seus descendentes, facilitando estudos futuros da funções biológicas, mecanismos moleculares, fisiológicas e patológicas consequências e implicações terapêuticas de anastasis. Também discutimos os controles adequados para distinguir células que passam por anastasis daqueles que exibem não-apoptotic caspase atividade in vivo.

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Detecting Anastasis In Vivo by CaspaseTracker Biosensor

Anastasis é tecnicamente desafiador para detectar na vivo porque as células que reverteram o processo de morte celular podem ser morfologicamente indistinguíveis de células saudáveis normais. Aqui descrevemos os protocolos para detecção e monitoramento de células que passam por anastasis em animais vivos, usando nosso sistema de biosensor recentemente desenvolvido na vivo CaspaseTracker.

Detecção de Anastasis na Vivo por CaspaseTracker Biosensor

Anastasis (Greek for &#8220;rising to life&#8221;) is a recently discovered cell recovery phenomenon whereby dying cells can reverse late-stage cell death ...

detecting-anastasis-in-vivo-by-caspasetracker-biosensor

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Medicine

Detecting Anastasis In Vivo by CaspaseTracker Biosensor

9.2K visualizações.  Johns Hopkins University School of Medicine. Anastasis é tecnicamente desafiador para detectar na vivo porque as células que reverteram o processo de morte celular podem ser morfologicamente indistinguíveis de células saudáveis normais. Aqui descrevemos os protocolos para detecção e monitoramento de células que passam por anastasis em animais vivos, usando nosso sistema de biosensor recentemente desenvolvido na vivo CaspaseTracker.

Vídeo: Detecting Anastasis In Vivo by CaspaseTracker Biosensor

In Vivo Canine Muscle Function Assay

We describe a minimally-invasive and reproducible method to measure canine pelvic limb muscle strength and muscle response to repeated eccentric 
contractions. The pelvic limb of an anesthetized dog is immobilized in a stereotactic frame to align the tibia at a right angle to the femur. Adhesive wrap affixes the 
paw to a pedal mounted on the shaft of a servomotor to measure torque. Percutaneous nerve stimulation activates pelvic limb muscles of the paw to either push (extend) or 
pull (flex) against the pedal to generate isometric torque. Percutaneous tibial nerve stimulation activates tibiotarsal extensor muscles. Repeated eccentric (lengthening) 
contractions are induced in the tibiotarsal flexor muscles by percutaneous peroneal nerve stimulation. The eccentric protocol consists of an initial isometric contraction 
followed by a forced stretch imposed by the servomotor. The rotation effectively lengthens the muscle while it contracts, e.g., an eccentric contraction. During 
stimulation flexor muscles are subjected to an 800 msec isometric and 200 msec eccentric contraction. This procedure is repeated every 5 sec. To avoid fatigue, 4 min rest 
follows every 10 contractions with a total of 30 contractions performed.

In Vivo Canine Muscle Function Assay

We describe a minimally-invasive and painless method to measure canine hindlimb muscle strength and muscle response to repeated eccentric contractions.

Em função Assay Canine Muscle Vivo

We describe a minimally-invasive and reproducible method to measure canine pelvic limb muscle strength and muscle response to repeated eccentric 
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Medicina

In vivo 19F MRI for Cell Tracking

In vivo 19F MRI allows quantitative cell tracking without the use of ionizing radiation. It is a noninvasive technique that can be applied to humans. Here, we describe a general protocol for cell labeling, imaging, and image processing. The technique is applicable to various cell types and animal models, although here we focus on a typical mouse model for tracking murine immune cells. The most important issues for cell labeling are described, as these are relevant to all models. Similarly, key imaging parameters are listed, although the details will vary depending on the MRI system and the individual setup. Finally, we include an image processing protocol for quantification. Variations for this, and other parts of the protocol, are assessed in the Discussion section. Based on the detailed procedure described here, the user will need to adapt the protocol for each specific cell type, cell label, animal model, and imaging setup. Note that the protocol can also be adapted for human use, as long as clinical restrictions are met.

In vivo 19F MRI for Cell Tracking

We describe a general protocol for in vivo cell tracking using MRI in a mouse model with ex vivo labeled cells. A typical protocol for cell labeling, image acquisition processing and quantification is included.

In vivo 19 F MRI para Rastreamento celular

In vivo 19F MRI allows quantitative cell tracking without the use of ionizing radiation. It is a noninvasive technique that can be applied to humans. ...

Detecting Abnormalities in Choroidal Vasculature in a Mouse Model of Age-related Macular Degeneration by Time-course Indocyanine Green Angiography

Indocyanine Green&#160;Angiography (or ICGA) is a technique performed by ophthalmologists to diagnose abnormalities of the choroidal and retinal vasculature of various eye diseases such as age-related macular degeneration (AMD). ICGA is especially useful to image the posterior choroidal vasculature of the eye due to its capability of penetrating through the pigmented layer with its infrared spectrum. ICGA time course can be divided into early, middle, and late phases. The three phases provide valuable information on the pathology of eye problems. Although time-course ICGA by intravenous (IV) injection is widely used in the clinic for the diagnosis and management of choroid problems, ICGA by intraperitoneal injection (IP) is commonly used in animal research. Here we demonstrated the technique to obtain high-resolution ICGA time-course images in mice by tail-vein injection and confocal scanning laser ophthalmoscopy. We used this technique to image the choroidal lesions in a mouse model of age-related macular degeneration. Although it is much easier to introduce ICG to the mouse vasculature by IP, our data indicate that it is difficult to obtain reproducible ICGA time course images by IP-ICGA. In contrast, ICGA via tail vein injection provides high quality ICGA time-course images comparable to human studies. In addition, we showed that ICGA performed on albino mice gives clearer pictures of choroidal vessels than that performed on pigmented mice. We suggest that time-course IV-ICGA should become a standard practice in AMD research based on animal models.

Indocyanine Green Angiography (or ICGA) performed by tail vein injection provides high quality ICGA time course images to characterize abnormalities in mouse choroid.

Detectar alterações no coróide Vasculature em um modelo do rato de Degeneração Macular relacionada com a Idade de-curso Tempo Indocianina Verde Angiografia

Indocyanine Green&#160;Angiography (or ICGA) is a technique performed by ophthalmologists to diagnose abnormalities of the choroidal and retinal ...

Intrauterine Telemetry to Measure Mouse Contractile Pressure In Vivo

A complex integration of molecular and electrical signals is needed to transform a quiescent uterus into a contractile organ at the end of pregnancy. Despite the discovery of key regulators of uterine contractility, this process is still not fully understood. Transgenic mice provide an ideal model in which to study parturition. Previously, the only method to study uterine contractility in the mouse was ex vivo isometric tension recordings, which are suboptimal for several reasons. The uterus must be removed from its physiological environment, a limited time course of investigation is possible, and the mice must be sacrificed. The recent development of radiometric telemetry has allowed for longitudinal, real-time measurements of in vivo intrauterine pressure in mice. Here, the implantation of an intrauterine telemeter to measure pressure changes in the mouse uterus from mid-pregnancy until delivery is described. By comparing differences in pressures between wild type and transgenic mice, the physiological impact of a gene of interest can be elucidated. This technique should expedite the development of therapeutics used to treat myometrial disorders during pregnancy, including preterm labor.

Intrauterine Telemetry to Measure Mouse Contractile Pressure In Vivo

This manuscript provides a protocol for implanting telemeters in the mouse for the purpose of measuring intrauterine pressures during pregnancy.

Telemetria Intrauterine medir Rato contrátil Pressão<em&gt; In Vivo</em

A complex integration of molecular and electrical signals is needed to transform a quiescent uterus into a contractile organ at the end of pregnancy. ...

Rose Bengal Photothrombosis by Confocal Optical Imaging In Vivo: A Model of Single Vessel Stroke

In vivo imaging techniques have increased in utilization due to recent advances in imaging dyes and optical technologies, allowing for the ability to image cellular events in an intact animal. Additionally, the ability to induce physiological disease states such as stroke in vivo increases its utility. The technique described herein allows for physiological assessment of cellular responses within the CNS following a stroke and can be adapted for other pathological conditions being studied. The technique presented uses laser excitation of the photosensitive dye Rose Bengal in vivo to induce a focal ischemic event in a single blood vessel. 
The video protocol demonstrates the preparation of a thin-skulled cranial window over the somatosensory cortex in a mouse for the induction of a Rose Bengal photothrombotic event keeping injury to the underlying dura matter and brain at a minimum. Surgical preparation is initially performed under a dissecting microscope with a custom-made surgical/imaging platform, which is then transferred to a confocal microscope equipped with an inverted objective adaptor. Representative images acquired utilizing this protocol are presented as well as time-lapse sequences of stroke induction. This technique is powerful in that the same area can be imaged repeatedly on subsequent days facilitating longitudinal in vivo studies of pathological processes following stroke.

Rose Bengal Photothrombosis by Confocal Optical Imaging In Vivo:  A Model of Single Vessel Stroke

Here, we describe a semi-invasive optical microscopy approach for the induction of a Rose Bengal photothrombotic clot in the somatosensory cortex of a mouse in vivo. The technical aspects of the imaging procedure are described from induction of a photothrombotic event to application and data collection.

Rosa Bengala Fototrombose por imageamento óptico confocal<em&gt; In Vivo</em&gt;: Um Modelo de curso Veículo Individual

In vivo imaging techniques have increased in utilization due to recent advances in imaging dyes and optical technologies, allowing for the ability to ...

Triggering Reactive Gliosis In Vivo by a Forebrain Stab Injury

Following injury to the CNS, astrocytes undergo a broad range of biochemical, morphological, and molecular changes collectively referred to as reactive astrogliosis. Reactive astrocytes exert both inflammatory and protective effects that inhibit and promote, respectively, neural repair. The mechanisms underlying the diverse functional properties of reactive astrogliosis are not well understood. Achieving a greater understanding of these mechanisms is critical to developing therapeutic strategies to treat the injured CNS. Here we demonstrate a method to trigger reactive astrogliosis in the adult mouse forebrain using a forebrain stab lesion. This lesion model is simple, reliable, and requires only a stereotaxic device and a scalpel blade to produce the injury. The use of stab lesions as an injury model in the forebrain is well established and amenable to studies addressing a broad range of neuropathological outcomes, such as neuronal degeneration, neuroinflammation, and disruptions in the blood brain barrier (BBB). Thus, the forebrain stab injury model serves as a powerful tool that can be applied for a broad range of studies on the CNS response to trauma.

Triggering Reactive Gliosis In Vivo by a Forebrain Stab Injury

This article describes a detailed protocol to produce a forebrain stab injury in adult mice. The stab injury induces severe reactive gliosis and glial scar formation which can be subsequently examined by standard immunohistochemistry methods.

Disparo Reactive Gliose<em&gt; In Vivo</em&gt; Por um Stab Lesão Encéfalo anterior

Following injury to the CNS, astrocytes undergo a broad range of biochemical, morphological, and molecular changes collectively referred to as reactive ...

Generation of Microtumors Using 3D Human Biogel Culture System and Patient-derived Glioblastoma Cells for Kinomic Profiling and Drug Response Testing

The use of patient-derived xenografts for modeling cancers has provided important insight into cancer biology and drug responsiveness. However, they are time consuming, expensive, and labor intensive. To overcome these obstacles, many research groups have turned to spheroid cultures of cancer cells. While useful, tumor spheroids or aggregates do not replicate cell-matrix interactions as found in vivo. As such, three-dimensional (3D) culture approaches utilizing an extracellular matrix scaffold provide a more realistic model system for investigation. Starting from subcutaneous or intracranial xenografts, tumor tissue is dissociated into a single cell suspension akin to cancer stem cell neurospheres. These cells are then embedded into a human-derived extracellular matrix, 3D human biogel, to generate a large number of microtumors. Interestingly, microtumors can be cultured for about a month with high viability and can be used for drug response testing using standard cytotoxicity assays such as 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) and live cell imaging using Calcein-AM. Moreover, they can be analyzed via immunohistochemistry or harvested for molecular profiling, such as array-based high-throughput kinomic profiling, which is detailed here as well. 3D microtumors, thus, represent a versatile high-throughput model system that can more closely replicate in vivo tumor biology than traditional approaches.

Patient-derived xenografts of glioblastoma multiforme can be miniaturized into living microtumors using 3D human biogel culture system. This in vivo-like 3D tumor assay is suitable for drug response testing and molecular profiling, including kinomic analysis.

Geração de Microtumors Usando 3D Biogel Humano Sistema de Cultura e células de glioblastoma derivado do paciente para Kinomic Profiling e Testes resposta à droga

The use of patient-derived xenografts for modeling cancers has provided important insight into cancer biology and drug responsiveness. However, they are ...

Depletion of Mouse Cells from Human Tumor Xenografts Significantly Improves Downstream Analysis of Target Cells

The use of in vitro cell line models for cancer research has been a useful tool. However, it has been shown that these models fail to reliably mimic patient tumors in different assays1. Human tumor xenografts represent the gold standard with respect to tumor biology, drug discovery, and metastasis research 2-4. Tumor xenografts can be derived from different types of material like tumor cell lines, tumor tissue from primary patient tumors4 or serially transplanted tumors. When propagated in vivo, xenografted tissue is infiltrated and vascularized by cells of mouse origin. Multiple factors such as the tumor entity, the origin of xenografted material, growth rate and region of transplantation influence the composition and the amount of mouse cells present in tumor xenografts. However, even when these factors are kept constant, the degree of mouse cell contamination is highly variable.
Contaminating mouse cells significantly impair downstream analyses of human tumor xenografts. As mouse fibroblasts show high plating efficacies and proliferation rates, they tend to overgrow cultures of human tumor cells, especially slowly proliferating subpopulations. Mouse cell derived DNA, mRNA, and protein components can bias downstream gene expression analysis, next-generation sequencing, as well as proteome analysis 5. To overcome these limitations, we have developed a fast and easy method to isolate untouched human tumor cells from xenografted tumor tissue. This procedure is based on the comprehensive depletion of cells of mouse origin by combining automated tissue dissociation with the benchtop tissue dissociator and magnetic cell sorting. Here, we demonstrate that human target cells can be can be obtained with purities higher than 96% within less than 20 min independent of the tumor type.

Human tumor xenografts are vascularized and infiltrated by cells of mouse origin during the growth phase in vivo. To circumvent the bias caused by these contaminating cells during downstream analysis, we developed a method allowing for comprehensive depletion of all mouse cells by magnetic cell sorting.

Depleção de células do rato de xenoenxertos de tumor humano Melhora Significativamente Análise Downstream de células alvo

The use of in vitro cell line models for cancer research has been a useful tool. However, it has been shown that these models fail to reliably mimic ...

Regenerative Therapy by Suprachoroidal Cell Autograft in Dry Age-related Macular Degeneration: Preliminary In Vivo Report

This study is aimed at examining whether a suprachoroidal graft of autologous cells can improve best corrected visual acuity (BCVA) and responses to microperimetry (MY) in eyes affected by dry Age-related Macular Degeneration (AMD) over time through the production and secretion of growth factors (GFs) on surrounding tissue. Patients were randomly assigned to each study group. All patients were diagnosed with dry AMD and with BCVA equal to or greater than 1 logarithm of the minimum angle of resolution (logMAR). A suprachoroidal autologous graft by Limoli Retinal Restoration Technique (LRRT) was carried out on group A, which included 11 eyes from 11 patients. The technique was performed by implanting adipocytes, adipose-derived stem cells obtained from the stromal vascular fraction, and platelets from platelet-rich plasma in the suprachoroidal space. Conversely, group B, including 14 eyes of 14 patients, was used as a control group. For each patient, diagnosis was verified by confocal scanning laser ophthalmoscope and spectral domain-optical coherence tomography (SD-OCT). In group A, BCVA improved by 0.581 to 0.504 at 90 days and to 0.376 logMAR at 180 days (+32.20%) postoperatively. Furthermore, MY test increased by 11.44 dB to 12.59 dB at 180 days. The different cell types grafted behind the choroid were able to ensure constant GF secretion in the choroidal flow. Consequently, the results indicate that visual acuity (VA) in the grafted group can increase more than in the control group after six months.

Regenerative Therapy by Suprachoroidal Cell Autograft in Dry Age-related Macular Degeneration: Preliminary In Vivo Report

The goal of this study is to assess whether the suprachoroidal graft of adipose-derived stem cells included in the stromal vascular fraction and platelets derived from platelet-rich plasma by the Limoli Retinal Restoration Technique can improve visual acuity and retinal sensitivity responses in eyes affected by dry age-related macular degeneration.

Terapia regenerativa pela célula Suprachoroidal Autograft em seco Degeneration Macular Age-related: relatório preliminar na Vivo

This study is aimed at examining whether a suprachoroidal graft of autologous cells can improve best corrected visual acuity (BCVA) and responses to ...

Preparation of Naringenin Solution for In Vivo Application

The preparation of a compound (phytochemical) solution is an overlooked but critical step prior to its application in studies such as drug screening. The complete solubilization of the compound is necessary for its safe use and relatively stable results. Here, a protocol for preparing naringenin solution and its intraperitoneal administration in a high-fat diet and streptozotocin (STZ)-induced diabetic model is demonstrated as an example. A small amount of naringenin (3.52-6.69 mg) was used to test its solubilization in solvents, including ethanol, dimethylsulfoxide (DMSO), and DMSO plus Tween 80 reconstituted in physiological saline (PS), respectively. Complete solubilization of the compound is determined by observing the color of the solution, the presence of precipitates after centrifugation (2000 x g for 30 s), or allowing the solution to stand for 2 h at room temperature (RT). After obtaining a stable compound/phytochemical solution, the final concentration/amount of the compound required for in vivo studies can be prepared in a solvent-only (no PS) stock solution, and then diluted/mixed with PS as desired. The antidiabetic osteoporotic effects of naringenin in mice (intraperitoneal administration at 20 mg/kg b.w., 2 mg/mL) were assessed by measuring blood glucose, bone mass (micro-CT), and bone resorption rate (TRAP staining and ELISA). Researchers looking for detailed organic/phytochemical solution preparations will benefit from this technique.

Preparation of Naringenin Solution for In Vivo Application

Here, the protocol presents the preparation of naringenin solution for in vivo intraperitoneal administration. Naringenin is fully dissolved in a mixture of dimethylsulfoxide, Tween 80, and saline. The antidiabetic osteoporotic effects of naringenin were assessed by blood glucose testing, tartrate-resistant acid phosphatase staining, and enzyme-linked immunosorbent assay.

Preparação da Solução Naringenin para Aplicação In Vivo

The preparation of a compound (phytochemical) solution is an overlooked but critical step prior to its application in studies such as drug screening. The ...