Bu tekniğin gelişimine katkıda bulunan tüm önceki üyeleri Bouchier-Hayes laboratuvar kabul etmek istiyoruz. Bu eser kısmen bir Texas Çocuk Hastanesi Pediatrik Pilot Ödülü LBH tarafından finanse edildi. Joya Chandra (MD Anderson, Houston, Teksas) ekibi ile işbirliği içinde yayımlanan verileri eklemek izin için teşekkür ediyoruz. Açıklanan reaktifler gelişimi NIH (NIAID P30AI036211, ncı P30CA125123 ve NCRR S10RR024574) ve Joel M. Sederstrom yardımıyla fon ile sitometresi ve hücre sıralama özünde Baylor Tıp Fakültesi tarafından desteklenmiştir

1. hücre ve kültür yemeklerin hazırlanması
Not: Bir doku kültürü laminar akış mahallede 1-3 adımları gerçekleştirin. Eldiven giymek.
<ol><li>Cam alt yemekleri kullanıyorsanız, fibronektin ile cam ceket. Adım 1.2 için plastik yemekleri kullanıyorsanız atlayın.<ol>
<li>Fibronektin bir 0.1 mg/mL solüsyon olun: 1 mL 1 mg/mL fibronektin çözeltisi 1 X PBS 9 ml seyreltik.</li>
		<li>Kapak cam kuyunun her 0.5-1 mL fibronektin ve oda sıcaklığında 1-5 min için kuluçkaya.</li>
		<li>Bir pipet kullanarak, fibronektin çözüm toplamanız ve 4 ° C'de Not: Fibronektin çözüm birden çok kez yeniden kullanılabilir.</li>
		<li>Bir kez 1-2 mL 1 X PBS ile cam yıkama ve PBS Aspire edin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>6-şey plaka 2 ml (bkz. Tablo 1 için farklı büyüklükte kuyular için kullanılacak cep numaralarını) uygun hücre kültür ortamının kuyu başına 1 x 105 hücre plaka. Stabil (konuya bakın) caspase BiFC bileşenleri ifade eder bir hücre kültürünü kullanıyorsanız, 2 x 105 hücreleri plaka ve tedavi tutamaçlarından (Adım 3).</li>
	<li>Gecede 37 ° C'de bir doku kültürü kuluçka çanak uygun hücrelere izin.</li>
</ol>2. caspase BiFC bileşenleri tanıtmak transfection hücre
<ol><li>Uygun transfection reaktif hücrelerle transfect. Not: Bu protokol Lipofectamine 2000, en az toksisite için optimize edilmiş talimatı özetliyor. Bu iletişim kuralı başarıyla Hela hücreleri, MCF7 hücreleri ve LN18 hücreleri kullanılmaktadır. Ek kullanarak transfection reaktifler üreticinin yönergeleri izleyin ve gerektiği şekilde en iyi duruma getirme.<ol>
<li>Transfection reaktif 12 µL düşük serum medya steril tüp içinde 750 µL ekleyin.</li>
		<li>5 min için oda sıcaklığında kuluçkaya.</li>
		<li>10 eklemek bir muhabir plazmid (floresan bir protein transfected hücreleri etiketlenir örneğin kırmızı floresan protein [RFP], kodlama bir plazmid) ng steril 1,5 mL tüp transfected her şey için.</li>
		<li>20 eklemek her caspase BiFC plazmid ng (örneğin, 20 ng caspase-2 prodomain [C2 Pro]-VC ve 20 ng C2 Pro-VN) her Tube (Tablo 2).</li>
		<li>Her tüp 100 µL toplam hacmi kadar düşük serum medya ekleyerek getir.</li>
		<li>P200 pipet kullanarak, transfection reaktif çözeltinin 100 µL 2.1.2 adımından plazmid karışıma dropwise bir şekilde ekleyin.</li>
		<li>Plazmid-transfection reaktif karıştırmak için oda sıcaklığında 20 dk kuluçkaya.</li>
		<li>Ve sonra kullanarak p1000 pipet pipet 800 µL serum Ücretsiz medya yavaşça aşağı kuyunun medya bir pipet kullanarak hücreleri veya emme Aspire edin.</li>
		<li>P200 pipet kullanarak dropwise DNA-lipid kompleks 200 µL her şey için ekleyin.</li>
		<li>3 h için bir doku kültürü kuluçka makinesi-37 ° C'de hücrelerde kuluçkaya.</li>
		<li>Değil monolayer bozabilir, aspirasyon emme kullanarak veya bir pipet ile DNA-lipit kompleksi içeren serum boş ortam kaldırmak için dikkat çekici.</li>
		<li>Önceden ısıtılmış (37 ° C) tam büyüme medya yavaşça aşağı her şey tarafında 2 mL pipet.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Doku kültürü kuluçka için en uygun protein ifade için 24-48 h 37 ° C'de hücreler kuluçkaya.</li>
</ol>3. indüksiyon caspase harekete geçirmek
<ol><li>Bir uyuşturucu veya uyarıcı caspase harekete geçirmek yaklaşık 24 s sonrası transfection ikna ile tedavi.<ol>
<li>Uyuşturucu için istenen konsantrasyonu önceden sıcak (37 ° C) görüntüleme medya (Hepes [20 mM, pH 7.2-7,5] ve 2-mercaptoethanol [55 µM] ile desteklenmiş tam büyüme medya) ve karışımı yavaşça ekleyin (Tablo 3).</li>
		<li>Ve sonra bir pipet kullanarak, yavaşça aşağı kuyunun 3.1.1 çözümden 2 mL pipet medya bir pipet kullanarak hücreleri veya emme Aspire edin.</li>
		<li>Uyuşturucu olmadan görüntüleme medya için bir şey tedavi edilmemiş bir denetim ekleyin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Doku kültürü kuluçka 37 ° C'de hücreler kuluçkaya veya adım 4.3 için hızlandırılmış bir deneme için devam edin.</li>
</ol>4. Caspase BiFC veri toplama
<ol><li>
Caspase BiFC tek zaman nokta toplama
	<ol>
<li>Mikroskop ve üreticinin yönergeleri izleyerek Floresan ışık kaynağı açın.</li>
		<li>RFP filtre ve muhabir gen Floresans odaklanmak altındaki hücreleri bulmak.</li>
		<li>Bir el-taksitli karşı kullanarak, görme alanı içinde RFP pozitif hücrelerin tümünü say. Kaydedin.</li>
		<li>Aynı görme alanı korurken, geçiş GFP filtre (veya YFP filtre varsa) ve el-taksitli sayaç kullanarak, aynı zamanda yeşil kırmızı hücreleri saymak (Venüs-pozitif). Sadece kırmızı hücreleri Venüs-pozitif için değerlendirilmesini sağlamak için bu iki filtrenin arasında ileri geri geçiş. (Şekil 3) kaydedin.</li>
		<li>Her plaka üç bireysel alanların en az 100 RFP pozitif hücreleri saymak.</li>
		<li>Her alanda Venüs-pozitif transfected hücreleri (Yani aynı zamanda yeşil olan alyuvar) yüzdesini hesaplamak. Standart sapma almak için elde edilen yüzde ortalama.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Caspase BiFC, üç boyutlu görüntüleme
	<ol>
<li>Üreticinin yönergelerini izleyerek mikroskobunun açmak ve satın alma yazılımı başlatmak.</li>
		<li>60 x veya 63 x petrol hedefi seçin ve bir damla yağı hedefte yer</li>
		<li>Kültür çanak doğru plaka sahibi kullanma mikroskop sahne alanı üzerine yerleştirin.</li>
		<li>Ya bir epifluorescence ışık kaynağı ve mikroskop göz parça veya confocal lazerler ve bilgisayar ekranı kullanarak, ilgi bir alana gidin.</li>
		<li>RFP lazer veya filtre kullanarak muhabir Floresans odaklan.</li>
		<li>Epifluorescence bu noktaya kadar kullanılan varsa, ışık kaynağı confocal lazerler geçer ve kamera tarafından alınan ve bilgisayar ekranında edinme yazılımı tarafından görüntülenen hücrelerin canlı görüntü görselleştirmek.</li>
		<li>Böylece hücreleri vizör ortasına joystick kontrolü ve odak tekerleğin kullanımı, ince odak ve hücrelerin konumunu ayarını yapın. Birbirinden ayrılır ve olmayan üst üste gelen hücreleri seçin.</li>
		<li>Yüzde lazer gücü % 50 ve 100 ms, pozlama süresi için deneme için kullanmak için en iyi ayarları belirlemek için bir başlangıç noktası olarak Venüs ve RFP için giriş.</li>
		<li>Canlı yakalama açmak ve ortaya çıkan görüntü ve eşlik eden görüntü çubuk her iki kanal için incelemek.</li>
		<li>Görüntü sinyali iyi görünüyor kadar sinyali düşük ise ve görüntü yapmak zordur, artışlarla yüzde lazer güç ve/veya pozlama süresini artırın.</li>
		<li>Sinyal doygunluk ulaşmak değil emin olun. Farklı bir zirve için her fluor görünür olduğundan emin olmak için ekran histogram bakarak kontrol edin. Tüm histogram ekran zirve kapsar, giriş alt lazer güç ve pozlama ayarlarını (Şekil 2).</li>
		<li>Kontrol (tedavi edilmemiş veya sigara transfected) hücreleri sinyal belirli olduğundan emin olmak için aynı koşullar altında görselleştirin. Not: Tek renkli transfectants de denetimine crossover için kullanılabilir, ancak sinyalleri dağınık şekilde farklı (örneğin karşı sitozolik mitokondrial) ise bu gerekli değildir.</li>
		<li>Z yığın modülü içinde belgili tanımlık mikroskop bilgisayar yazılımı açın veya seçin.</li>
		<li>Odak topuzu, yaklaşık hücrenin merkezine karşılık gelen odak konumunu kullanarak.</li>
		<li>Hücre görünene kadar bir yönde odak ayarlamak, bu olarak üst konumunu seçin.</li>
		<li>Hücreyi yeniden artık görünür duruma gelene kadar ters yönde odak ayarlamak ve bu alt pozisyon seçin.</li>
		<li>En uygun adım boyu (genellikle yaklaşık 20 µm) seçin ve otomatik olarak üst ve alt pozisyonlar arasında 20 µm adımların her biri, her kanaldaki tek bir görüntü çekmek için kamera istemek için satın başlar.</li>
		<li>3D görüntü (şekil 4film 1) yeniden oluşturmak için 3B oluşturma yazılımını kullanın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Caspase BiFC zaman hata görüntüleme
	<ol>
<li>Deneme önce en az 1 h mikroskobunun açın ve 37 ° c sıcaklık ayarlayın</li>
		<li>40 x 60 x veya 63 x petrol hedefi seçin ve bir damla yağı hedefte yerleştirin.</li>
		<li>Kültür çanak doğru plaka sahibi kullanma mikroskop sahne alanı üzerine yerleştirin.</li>
		<li>CO2 kaynak kullanılabilir durumdaysa, CO2 teslimatı (CO2sunar tüp bağlı genellikle bir pleksiglas kapak) plaka sahibi üstüne yerleştirin. CO2 düzey 5 %'ye ayarlarsanız ve yazılım içinde CO2 denetleyicisinden açmak. CO2 kaynak yoksa, 20 mM Hepes tampon medya dahil.</li>
		<li>Transfected hücrelerinin bir alana gidin ve kamera tarafından alınan ve edinme yazılımlar RFP lazer kullanarak bilgisayar ekranında görüntülenen hücrelerin canlı görüntü görselleştirmek.</li>
		<li>Adımları 4.2.8-4.2.12, giriş ayarları için yüzde lazer güç ve pozlama kez RFP lazer. Bu değerler hala floresan sinyali algılamak mümkün olurken mümkün olduğunca düşük tutmak.</li>
		<li>Olumlu bir denetimi kullanarak örnek (bakınız Tablo 3 örnekler için), takip için yüzde lazer güç ve pozlama kez YFP lazer ışık ayarları giriş için adımları 4.2.8-4.2.12. Bu değerler hala Venüs sinyali algılamak mümkün olurken mümkün olduğunca düşük tutmak.</li>
		<li>Plaka her şey için bir veya daha fazla hücre muhabir ifade içeriyor farklı pozisyonların sayısını seçin.</li>
		<li>Her kare kare alınması hızlandırılmış ve toplam sayısı arasındaki zaman aralığını girin. Sonraki kare alınması için önce tüm seçilen pozisyonlar elde etmek için zaman olduğundan emin olun.</li>
		<li>Her bir pozisyon yeniden ziyaret edin ve düzeltin ve odak gerektiği gibi güncelleştirin.</li>
		<li>Değişiklikleri sıcaklık veya dış titreşimler neden olabilir odak drift için düzeltmek için odak kayması düzeltme sistemi üzerinde (varsa) açın.</li>
		<li>Hızlandırılmış başlar ve verileri kaydetmek.</li>
		<li>Kullanılabilir görüntüleme yazılımı (şekil 5Film 2) kullanarak verileri analiz.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Salvesen, G. S., Riedl, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caspase+mechanisms.">Caspase mechanisms.</a> Adv Exp Med Biol. 615, 13-23 (2008).</li><li>Boatright, K. M., Salvesen, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+caspase+activation.">Mechanisms of caspase activation.</a> Curr Opin Cell Biol. 15 (6), 725-731 (2003).</li><li>Luthi, A. U., Martin, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+CASBAH:+a+searchable+database+of+caspase+substrates.">The CASBAH: a searchable database of caspase substrates.</a> Cell Death Differ. 14 (4), 641-650 (2007).</li><li>Baliga, B. C., Read, S. H., Kumar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biochemical+mechanism+of+caspase-2+activation.">The biochemical mechanism of caspase-2 activation.</a> Cell Death Differ. 11 (11), 1234-1241 (2004).</li><li>Boatright, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+unified+model+for+apical+caspase+activation.">A unified model for apical caspase activation.</a> Mol Cell. 11 (2), 529-541 (2003).</li><li>Aravind, L., Dixit, V. M., Koonin, E. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+domains+of+death:+evolution+of+the+apoptosis+machinery.">The domains of death: evolution of the apoptosis machinery.</a> Trends Biochem Sci. 24 (2), 47-53 (1999).</li><li>Salvesen, G. S., Dixit, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caspase+activation:+the+induced-proximity+model.">Caspase activation: the induced-proximity model.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (20), 10964-10967 (1999).</li><li>Oberst, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inducible+dimerization+and+inducible+cleavage+reveal+a+requirement+for+both+processes+in+caspase-8+activation.">Inducible dimerization and inducible cleavage reveal a requirement for both processes in caspase-8 activation.</a> J Biol Chem. 285 (22), 16632-16642 (2010).</li><li>Riedl, S. J., Salvesen, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+apoptosome:+signalling+platform+of+cell+death.">The apoptosome: signalling platform of cell death.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (5), 405-413 (2007).</li><li>Kischkel, F. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytotoxicity-dependent+APO-1+(Fas/CD95)-associated+proteins+form+a+death-inducing+signaling+complex+(DISC)+with+the+receptor.">Cytotoxicity-dependent APO-1 (Fas/CD95)-associated proteins form a death-inducing signaling complex (DISC) with the receptor.</a> EMBO J. 14 (22), 5579-5588 (1995).</li><li>Martinon, F., Burns, K., Tschopp, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+inflammasome:+a+molecular+platform+triggering+activation+of+inflammatory+caspases+and+processing+of+proIL-beta.">The inflammasome: a molecular platform triggering activation of inflammatory caspases and processing of proIL-beta.</a> Mol Cell. 10 (2), 417-426 (2002).</li><li>Tinel, A., Tschopp, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+PIDDosome,+a+protein+complex+implicated+in+activation+of+caspase-2+in+response+to+genotoxic+stress.">The PIDDosome, a protein complex implicated in activation of caspase-2 in response to genotoxic stress.</a> Science. 304 (5672), 843-846 (2004).</li><li>Shyu, Y. J., Liu, H., Deng, X., Hu, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+new+fluorescent+protein+fragments+for+bimolecular+fluorescence+complementation+analysis+under+physiological+conditions.">Identification of new fluorescent protein fragments for bimolecular fluorescence complementation analysis under physiological conditions.</a> Biotechniques. 40 (1), 61-66 (2006).</li><li>Bouchier-Hayes, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+cytoplasmic+caspase-2+activation+by+induced+proximity.">Characterization of cytoplasmic caspase-2 activation by induced proximity.</a> Mol Cell. 35 (6), 830-840 (2009).</li><li>Manzl, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caspase-2+activation+in+the+absence+of+PIDDosome+formation.">Caspase-2 activation in the absence of PIDDosome formation.</a> J Cell Biol. 185 (2), 291-303 (2009).</li><li>Manzl, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PIDDosome-independent+tumor+suppression+by+Caspase-2.">PIDDosome-independent tumor suppression by Caspase-2.</a> Cell Death Differ. 19 (10), 1722-1732 (2012).</li><li>Ando, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NPM1+directs+PIDDosome-dependent+caspase-2+activation+in+the+nucleolus.">NPM1 directs PIDDosome-dependent caspase-2 activation in the nucleolus.</a> J Cell Biol. , (2017).</li><li>Sanders, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+imaging+of+inflammatory+caspase+dimerization+reveals+differential+recruitment+to+inflammasomes.">Single-cell imaging of inflammatory caspase dimerization reveals differential recruitment to inflammasomes.</a> Cell Death Dis. 6, e1813 (2015).</li><li>Aaronson, D. S., Horvath, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+road+map+for+those+who+don't+know+JAK-STAT.">A road map for those who don't know JAK-STAT.</a> Science. 296 (5573), 1653-1655 (2002).</li><li>Manton, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+cell+death+by+the+novel+proteasome+inhibitor+marizomib+in+glioblastoma+in+vitro+and+in+vivo.">Induction of cell death by the novel proteasome inhibitor marizomib in glioblastoma in vitro and in vivo.</a> Sci Rep. 6, 18953 (2016).</li><li>Fan, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Split+mCherry+as+a+new+red+bimolecular+fluorescence+complementation+system+for+visualizing+protein-protein+interactions+in+living+cells.">Split mCherry as a new red bimolecular fluorescence complementation system for visualizing protein-protein interactions in living cells.</a> Biochem Biophys Res Commun. 367 (1), 47-53 (2008).</li><li>Chu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+far-red+bimolecular+fluorescence+complementation+system+that+allows+for+efficient+visualization+of+protein+interactions+under+physiological+conditions.">A novel far-red bimolecular fluorescence complementation system that allows for efficient visualization of protein interactions under physiological conditions.</a> Biosens Bioelectron. 25 (1), 234-239 (2009).</li><li>Karbowski, M., Youle, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+mitochondrial+morphology+in+healthy+cells+and+during+apoptosis.">Dynamics of mitochondrial morphology in healthy cells and during apoptosis.</a> Cell Death Differ. 10 (8), 870-880 (2003).</li><li>Proell, M., Gerlic, M., Mace, P. D., Reed, J. C., Riedl, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+CARD+plays+a+critical+role+in+ASC+foci+formation+and+inflammasome+signalling.">The CARD plays a critical role in ASC foci formation and inflammasome signalling.</a> Biochem J. 449 (3), 613-621 (2013).</li><li>Szymczak, A. L., Vignali, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+2A+peptide-based+strategies+in+the+design+of+multicistronic+vectors.">Development of 2A peptide-based strategies in the design of multicistronic vectors.</a> Expert Opin Biol Ther. 5 (5), 627-638 (2005).</li><li>Chang, D. W., Xing, Z., Capacio, V. L., Peter, M. E., Yang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interdimer+processing+mechanism+of+procaspase-8+activation.">Interdimer processing mechanism of procaspase-8 activation.</a> EMBO J. 22 (16), 4132-4142 (2003).</li><li>Stennicke, H. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caspase-9+can+be+activated+without+proteolytic+processing.">Caspase-9 can be activated without proteolytic processing.</a> J Biol Chem. 274 (13), 8359-8362 (1999).</li><li>Slee, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ordering+the+cytochrome+c-initiated+caspase+cascade:+hierarchical+activation+of+caspases-2,+-3,+-6,+-7,+-8,+and+-10+in+a+caspase-9-dependent+manner.">Ordering the cytochrome c-initiated caspase cascade: hierarchical activation of caspases-2, -3, -6, -7, -8, and -10 in a caspase-9-dependent manner.</a> J Cell Biol. 144 (2), 281-292 (1999).</li><li>McStay, G. P., Salvesen, G. S., Green, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overlapping+cleavage+motif+selectivity+of+caspases:+implications+for+analysis+of+apoptotic+pathways.">Overlapping cleavage motif selectivity of caspases: implications for analysis of apoptotic pathways.</a> Cell Death Differ. 15 (2), 322-331 (2008).</li></ol>

Yazarlar onlar rakip hiçbir mali çıkarları var bildirin.

Caspase proteaz aile kritik rollerine Apoptozis ve doğuştan gelen bağışıklık 1bilinmektedir. Onların önemi nedeniyle, ne zaman, nerede ve nasıl verimli bir şekilde belirlenmesi belirli caspases aktif çok önemli caspase mekanizmaları harekete geçirmek yolları kazandırabileceğini. Burada açıklanan görüntüleme tabanlı iletişim kuralı caspase harekete geçirmek cascade ilk adımda görselleştirme sağlar. Bu teknik, bu sürücü caspase etkinleştirme dinamik protein: protein etkileşimleri yararlanır.
Caspases iki gruba ayrılabilir: Başlatıcı caspases (caspase-1, -2, -4, -5 -8 -9, -10 ve -12) ve Cellat caspases (caspase-3, -6 ve -7). Cellat caspases ön şekillendirilmesi dimer hücrede mevcut ve büyük ve küçük alt birim 2arasında bir bölünme tarafından aktif hale gelir. Etkinleştirildiğinde, onlar apoptosis 3' te sonuçlanan çok sayıda yapısal ve düzenleyici proteinler ayırmak. Başlatıcı caspases bir yolu var olmak harekete geçirmek ve genellikle Cellat caspases aktivasyonu tetiklemek için ilk caspases vardır. Cellat caspases aksine, başlatıcı caspases dimerization 4,5tarafından etkinleştirilir. Bu dimerization harekete geçirmek platformlar bilinen belirli büyük molekül ağırlığı kompleksleri için etkin olmayan monomerleri alımı tarafından yönetilir. Derleme etkinleştirme platformlarının bir dizi belirli protein: protein etkileşimler tarafından yönetilir. Bunlar tarafından korunmuş protein etkileşim motifleri mevcut başlatıcı caspase proform aracılı ve ölüm etki alanı (DD), ölüm efektör etki alanı (DED) ve caspase işe alım etki alanı (kart) 6 (şekil 1A) içerir. Harekete geçirmek platformlar genellikle bir reseptör protein ve bir adaptör protein içerir. Reseptör genellikle çok sayıda molekülleri Oligomerizasyonda için sağlar bir konformasyonal değişim inducing bir ligand bağlanması üzerine devreye girer. Reseptör sonra da caspase doğrudan veya sırayla getirmek caspase kompleksi için adaptör molekül acemi. Böylece, çok sayıda caspase molekülleri yakın dimerization izin gelmek. Bu indüklenen yakınlık modeli 7olarak bilinir. Dimerized sonra caspase aktif enzim 4,8stabilize etmek için hizmet vermektedir işlenirken uğrar. Örneğin, Apaf1 apoptosome Meclisi yayınlandıktan sonra mitokondri mitokondrial dış membran permeabilization (MOMP) denen bir süreç üzerinden sitokrom c tarafından tetiklenir. Apaf1 caspase-9 her iki proteinler 9' mevcut bir kartıyla aracılık ettiği bir etkileşimi aracılığıyla sırayla acemi. Caspase-8 harekete geçirmek yol açan karmaşık sinyal inducing CD95 ölüm (disk) Meclisi benzer protein etkileşimleri sonucunda; caspase-2-ebilmek harekete geçirmek PIDDosome; ve caspase-1 harekete geçirmek 10,11,12başlatmak çeşitli inflammasome kompleksleri. Böylece, başlatıcı caspases belirli harekete geçirmek platformları için indüklenen yakınlık ve dimerization, hangi olmadan harekete geçirmek gerçekleşmez sonuçlanan bir ortak mekanizma ve suikastler falan.
Harekete geçirmek platformu takip caspase indüklenen yakınlık doğrudan görselleştirme izin başlatıcı caspases, harekete geçirmek bu ilk adımda ölçmek için geliştirilmiş bir görüntüleme tabanlı tahlil Caspase Bimolecular floresan uluslara (BiFC) olduğunu derleme. Bu yöntem, split floresan protein Venüs özelliklerini yararlanır. Venüs olduğunu bir daha parlak ve daha photostable sürümü iki sigara floresan ve biraz örtüşen parçalara ayrılmış sarı floresan protein (YFP): N-terminus Venüs (Venüs N veya VN) ve C-terminus, Venüs (Venüs C veya VC). Bu parçaları yeteneği refold ve yakın 13zaman floresan haline korur. Her Venüs parça harekete geçirmek platforma bağlar caspase çok az bölümü olan caspase, prodomain için erimiş. Bu caspases enzimatik aktivite korur ve bu nedenle eşzamanlı akış aşağı olaylar endojen olaylar ile ilişkili olası analizidir sağlar. Ne zaman caspase prodomains harekete geçirmek platforma işe ve indüklenen yakınlık tabi Venüs e saldırı indirgenmesi parçaları. (Şekil 1B). Elde edilen Venüs Floresans doğru ve özellikle hücre altı yerelleştirme, kinetik ve başlatıcı caspase harekete geçirmek platformlar Tek Kişilik hücrelerde Meclisi etkinliğini izlemek için kullanılabilir. Veri görüntüleme confocal mikroskopi veya standart floresan mikroskopi elde edilebilir ve dahil olmak üzere farklı mikroskobu yaklaşımlar bir dizi için adapte edilebilir: hızlandırılmış caspase harekete geçirmek gerçek zamanlı; izlemek için görüntüleme yüksek kararlılık düşsel hücre altı yerelleştirme kesin tayini için; ve bitiş noktası miktar verimlilik etkinleştirme.
Bu teknik ilk caspase-214aktivasyonu araştırmak için geliştirilmiştir. Caspase-2 için harekete geçirmek platform PIDDosome olduğu düşünülen iken, reseptör PIDD (protein p53 kaynaklı bir ölüm etki ile) oluşan ve adaptör RAIDD (RIP ilişkili Ich-1/CAD-3 homolog protein ölüm etki alanı ile), PIDDosome bağımsız caspase-2 aktivasyon bildirilmiştir. Bu ek harekete geçirmek platformlar için caspase-2 15,16var olduğunu göstermektedir. Caspase-2 aktivasyon platformun tam bileşenleri bilmeden rağmen caspase BiFC tekniği başarılı sorgulama moleküler düzeyde 14,17caspase-2 sinyal yollar için izin verdi. Biz de başarıyla bu protokol inflamatuar caspases (caspase-1, -4, -5 ve -12) için adapte olması 18 ve prensip olarak, aynı yaklaşımı benzer şekilde her kalan başlatıcı caspases analiz için yeterli olmalıdır. Bu iletişim kuralı benzer şekilde adapte olabilir diğer yolları araştırmak için dimerization büyük aktive sinyal edilmistir. Örneğin, STAT protein fosforilasyon Janus kinaz (JAK) 19tarafından takip dimerization tarafından etkinleştirilir. Böylece, BiFC sistemi için STAT harekete geçirmek hem de dinamik protein etkileşimler tarafından düzenlenmiş birçok yollar görselleştirmek için kullanılabilir. Aşağıdaki iletişim kuralı resim alma ve çözümleme için gazetecilere hücreye giriş için adım adım yönergeler yanı sıra yöntemleri sağlar.

<table><tbody><tr><td>6-well Uncoated No. 1.5 20 mm glass bottom dishes</td><td>Mattek</td><td>P06G-1.5-20-F</td><td></td></tr><tr><td>Human Plasma Fibronectin Purified Protein</td><td>Millipore</td><td>FC010-10MG</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Sigma</td><td>D8537-6x500ML</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000 reagent</td><td>Invitrogen</td><td>11668019</td><td></td></tr><tr><td>OPTI MEM I</td><td>Invitrogen</td><td>31985088</td><td></td></tr><tr><td>C2-Pro VC plasmid</td><td>Addgene</td><td>49261</td><td></td></tr><tr><td>C2-Pro VN plasmid</td><td>Addgene</td><td>49262</td><td></td></tr><tr><td>Inflammatory caspase BiFC plasmids</td><td></td><td></td><td>available by request from LBH</td></tr><tr><td>HeLa cells stably expressing the C2-Pro BiFC components</td><td></td><td></td><td>available by request from LBH</td></tr><tr><td>DsRed mito plasmid</td><td>Clontech</td><td>632421</td><td>similar plasmids that can be used as fluorescent reporters can be found on Addgene</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Invitrogen</td><td>15630106</td><td></td></tr><tr><td>2 Mercaptoethanol 1000X</td><td>Invitrogen</td><td>21985023</td><td></td></tr><tr><td>q-VD-OPH</td><td>Apex Bio</td><td>A1901</td><td></td></tr></tbody></table>

lighting up the pathways to caspase activation using bimolecular fluorescence complementation

Proteaz caspase ailesinin Apoptozis ve doğuştan gelen bağışıklık önemli rol oynarlar. Başlatıcı caspases bilinen bir alt Bunlar arasında ilk bu yollar var olmak harekete geçirmek. Grup caspase-2, içerir -8 ve -9 gibi inflamatuar caspases, caspase-1, -4 ve -5. Başlatıcı caspases tüm işe alım harekete geçirmek platformlar olarak adlandırılan belirli multiprotein kompleksleri için takip dimerization tarafından etkinleştirilir. Caspase Bimolecular floresan uluslara (BiFC) nerede floresan proteinler caspases başlatıcı caspases onların harekete geçirmek platformları ve sonucu olan alımı görselleştirmek için kullanılan başlatıcı için erimiş bölünmüş bir görüntü tabanlı yaklaşımdır indüklenen yakınlık. Bu floresan bir okuma bir başlatıcı caspase harekete geçirmek için gerekli ilk adımları sağlar. Farklı mikroskobu tabanlı yaklaşımlar bir dizi kullanarak, bu teknik Nicel veri caspase harekete geçirmek bir nüfus düzeyde verimliliğini yanı sıra caspase harekete geçirmek ve caspase etkinleştirme sayısı ve boyutu Kinetik sağlayabilirsiniz Hücre başına temelinde kompleksleri.

Caspase-2 BiFC DNA hasar tarafından indüklenen örneği şekil 3' te gösterilmiştir. Camptothecin, bir topoizomeraz ı inhibitörü, DNA hasarı ve caspase-2 aktivasyon ikna etmek için kullanıldı. Kırmızı floresan protein mCherry bir muhabir olarak hücreleri BiFC sonda hızlı göstermek için ve hücre toplam sayısı görselleştirmek yardımcı olmak için kullanılmıştır. Venüs Floresans yeşille gösterilmiş ve büyük puncta temsil eden caspase-2 yakınlık indüklenen. Bu hücreler Venüs-pozitif hücreler yüzdesini belirlemek için sayılabilir. Hücre altı yerelleştirme hakkında sonuçlar da böyle görüntülerden yapılabilir. Gösterilen örnekte de olduğu gibi sitoplazma 17çekirdekçik caspase-2 indüklenen yakınlık tespit edilmiştir. Yüksek çözünürlüklü görsel olarak caspase harekete geçirmek karmaşık hücre altı lokalizasyonu sağlamak için tek hücreleri üç boyutlu olarak yansıması. Şekil 4 tür 3D görüntüleri göstermek için iki yol gösterir. İlk hücrenin 3D bir yeniden yapılanma oluşturmaktır. Camptothecin kaynaklı caspase-2 BiFC yeşil ve kırmızı çekirdeği görülmektedir. 3D imar her iki fluorophores göreli lokalizasyonu hücreleri gösterir. Bu tür bir sonuçları görüntüleme hücre (film 1) tek bir eksen etrafında dönen bir film olarak görüntülendiğinde özellikle etkilidir. İkinci panelin aynı hücreyi ortogonal görünümüdür. Bu hücre hücrenin belirli bir noktasında, xy, xzve yz görselleştirme sağlar. 2D bir biçimde sunulan 3D verileri yorumlamak kolay olan sonuçları bu şekilde tasvir gibi kağıt sunuyu bir dergi makalesi için daha uygun olabilir. Şekil 5 proteasome inhibitörü bortezomib ile tedavi glioblastoma hücre kültürünü caspase-2 BiFC zaman hata görüntüleme örneği gösterir (Ayrıca bkz: Movie 2). Grafik ( 20' den uyarlanmıştır) hücre sayısı arasında ortalama hücre başına ortalama Venüs yoğunluk artışı gösterir. Bu tür veri tek hücre izleri bir grafik üzerinde bir numara olarak da görüntülenebilir. Gösterilen örnekte yaklaşık 2 h tedavi aşağıdaki indüklenen caspase yakınlık başlangıcı var.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57316/57316fig1.jpg"> Şekil 1: caspase yapısı ve bimolecular floresan uluslara (BiFC) metodolojisi şematik. (A) bir başlatıcı caspase genel yapısı. Prodomain, büyük ve küçük alt birimleri ve aktif sistein içerir korunmuş QACRG motifi tasvir edilmektedir. (B) BiFC yalnız floresan olmayan ancak floresan molekül etkileşen proteinler için erimiş reform ilişkilendirebilirsiniz split floresan proteinler kullanır. Caspase BiFC, prodomain (Pro) için ya da tam uzunlukta caspase N-terminal için yarı erimiş (Venüs-N) ve C-Terminal yarısı Venüs'ün (Venüs-C). Monomeric durumlarında caspase füzyon protein flüoresan değildir. İşe Alım için PIDDosome gibi bir harekete geçirmek platformu üzerine burada gösterildiği gibi iki yarıyı da Venüs'ün Derneği artış Venüs Floresans ölçülür indüklenen caspase yakınlık gösteren uygulanır. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57316/57316fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57316/57316fig2.jpg"> Şekil 2: ekran histogram kullanarak doygunluk tanımak için temsili resim. En iyi (üst paneli) ve doymuş sinyalleri (alt paneli) örnekleri gösterilir. Venüs (sarı tepe) ve RFP (kırmızı tepe) sinyalleri gösterilir. X ekseni yoğunluğu gösterir ve y ekseni sayı piksel. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57316/57316fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57316/57316fig3.jpg"> Şekil 3: DNA hasar takip Caspase-2 bimolecular floresan uluslara (BiFC). Caspase-2 BiFC bileşenleri ifade Hela hücreleri tedavi edilmemiş (A) yaptı veya camptothecin (100 µM) ile tedavi (B) qVD-OPH (20 µM) huzurunda. mCherry co floresan muhabir olarak ifade edilir. Temsili resim caspase-2 BiFC (Yeşil) hücrelerdeki 16 h tedavi aşağıdaki camptothecin tedavi ile hücreleri (kırmızı) gösterir. Ölçek çubukları temsil 20 µm. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57316/57316fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57316/57316fig4.jpg"> Şekil 4: caspase-2 bimolecular floresan uluslara (BiFC) lokalizasyonu. Caspase-2 BiFC bileşenleri ve floresan nükleer muhabir ifade Hela hücreleri qVD-OPH varlığında (20 µM) camptothecin (20 µM) ile tedavi edildi. 3D rekonstrüksiyonlar oluşan görüntülerden 0,1 mikron seri confocal- z-hücre boyutunda 24 h sonra yapılmış ve çekirdek yeşil kırmızı ve caspase-2 BiFC gösterir. Sol panelinde 3D maksimum yoğunluk projeksiyon işleme yeniden gösterir (Ayrıca bkz: film 1). Doğru kapı aynası aynı hücreyi dikey dilimleri görünümünü gösterir. Orta (mavi) xy düzlemi kutusudur, sağdaki kutu (sarı) yz uçak ise üstteki kutuda (beyaz) xz uçak. Yz ve xz uçaklar göre çapraz çizgileri kesiştiği. Ölçek çubukları temsil 10 µm. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57316/57316fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57316/57316fig5.jpg"> Şekil 5: hızlandırılmış caspase bimolecular floresan uluslara (BiFC), (A) caspase-2 BiFC bileşenleri ile LN18 glioblastoma hücreleri transfected ve bir kırmızı floresan mitokondrial marker (DsRed-mito, kırmızı) bortezomib ile tedavi (15 nM) qVD-OPH (20 µM) huzurunda. Hücreleri üzerinde 37 ° C'de confocal mikroskop yerleştirildi ve görüntüleri 8 h. görüntüleri için her 2 dk temsilcisi hücre iki caspase-2 BiFC bileşenleri indüklenen yakınlığı artış Venüs floresan ( sonuçlanan hızlandırılmış show dan alındı Yeşil) Zaman içinde. (B) Venüs, her zaman bir noktada her hücrede ortalama yoğunluğu ölçüldü. Venüs Floresans bortezomib tedaviden sonra zamanla arttı. Tedavi edilmemiş kontrol bölümü lazer ışık (şekil 20' den uyarlanmıştır) şartlarından düşük veya ihmal edilebilir toksisite belirtti. Ölçek çubukları temsil 20 µm. hata çubukları temsil standart hata değerlerin ortalamasının (SEM) 8 (kontrol) ve 14 (bortezomib) tek tek hücreleri (Ayrıca bkz: Movie 2). <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57316/57316fig5large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Plaka boyutu</td>
			<td>Hücre sayısı</td>
			<td>Medya hacmi</td>
		</tr>
<tr>
<td>6 iyi plaka</td>
			<td>1 x 105 hücreleri / iyi</td>
			<td>2 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>12 iyi plaka</td>
			<td>5 x 104 hücreleri / iyi</td>
			<td>1 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>24 iyi plaka</td>
			<td>2. 5 x 104 hücreleri / de</td>
			<td>0.5 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>4 odası çanak</td>
			<td>2. 5 x 104 hücreleri / Oda</td>
			<td>1 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>8 odası çanak</td>
			<td>1,25 x 104 hücreleri / Oda</td>
			<td>0.5 mL</td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 1: hücre plaka numaraları için yönergeleri. Stabil caspase bimolecular floresan uluslara (BiFC) bileşenleri ifade hücreleri kullanıyorsanız, burada gösterilen tutarlar çift plaka.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Plaka boyutu</td>
			<td>Transfection reaktif</td>
			<td>İndirimli serum medya</td>
			<td>Muhabir plazmid</td>
			<td>Caspase-pro VC plazmid</td>
			<td>Caspase-pro VN plazmid</td>
			<td>İndirimli serum medya plazmid karışımı eklenir</td>
			<td>Transfection reaktif çözüm plazmid karışımı eklenir</td>
			<td>Serum boş ortam hücrelere eklendi</td>
		</tr>
<tr>
<td>6 iyi plaka</td>
			<td>12 µL/plaka</td>
			<td>750 ΜL</td>
			<td>10 ng</td>
			<td>20 ng</td>
			<td>20 ng</td>
			<td>Toplam 100 µL</td>
			<td>100 ΜL</td>
			<td>800 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>12 iyi plaka</td>
			<td>12 µL/plaka</td>
			<td>750 ΜL</td>
			<td>5 ng</td>
			<td>10 ng</td>
			<td>10 ng</td>
			<td>Toplam 50 µL</td>
			<td>50 ΜL</td>
			<td>400 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>24 iyi plaka</td>
			<td>12 µL/plaka</td>
			<td>750 ΜL</td>
			<td>2.5 ng</td>
			<td>5 ng</td>
			<td>5 ng</td>
			<td>Toplam 25 µL</td>
			<td>25 ΜL</td>
			<td>200 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>4 odası çanak</td>
			<td>4 µL/plaka</td>
			<td>250 ΜL</td>
			<td>2.5 ng</td>
			<td>5 ng</td>
			<td>5 ng</td>
			<td>Toplam 25 µL</td>
			<td>25 ΜL</td>
			<td>200 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>8 odası çanak</td>
			<td>4 µL/plaka</td>
			<td>250 ΜL</td>
			<td>1,25 ng</td>
			<td>2.5 ng</td>
			<td>2.5 ng</td>
			<td>Toplam 12.5 µL</td>
			<td>12.5 ΜL</td>
			<td>100 ΜL</td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 2: geçici transfection için kullanılan reaktifler hacimleri önerilir. Not: plazmid önerilen miktarı yalnızca bir başlangıç noktasıdır. Sinyal tespit edilirse, bu 20-200 ng 6-şey plaka kuyu başına gelen plazmid titre tavsiye edilir.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Caspase</td>
			<td>Tedavi</td>
			<td>Konsantrasyon</td>
			<td>Zaman</td>
			<td>Beklenen sonuçları</td>
		</tr>
<tr>
<td>Caspase-1</td>
			<td>Aşırı ifade ASC</td>
			<td>250 ng/iyi 6 iyi plaka</td>
			<td>48 h</td>
			<td>% 50 BiFC pozitif</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">Caspase-2</td>
			<td>Aşırı ifade RAIDD</td>
			<td>500 ng/iyi 6 iyi plaka</td>
			<td>24 h</td>
			<td>% 90 BiFC pozitif</td>
		</tr>
<tr>
<td>Camptothecin</td>
			<td>100 ΜM</td>
			<td>16 h</td>
			<td>% 30-60 BiFC pozitif</td>
		</tr>
<tr>
<td>Isı şok</td>
			<td>1s 45 ° c</td>
			<td>16 h</td>
			<td>% 80 BiFC pozitif</td>
		</tr>
<tr>
<td>Caspase-4</td>
			<td>Overexpressed NALP1</td>
			<td>250 ng/iyi 6 iyi plaka</td>
			<td>48 h</td>
			<td>% 30 BiFC pozitif</td>
		</tr>
<tr>
<td>Caspase-5</td>
			<td>Overexpressed IPAF</td>
			<td>250 ng/iyi 6 iyi plaka</td>
			<td>48 h</td>
			<td>% 15 BiFC pozitif</td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 3: caspase bimolecular floresan uluslara (BiFC) için olumlu denetim örnekleri. Beklenen sonuçlar ve koşulları temel alan üzerinde yayımlanan veri Pro kullanarak 14,17,18oluşturur. Ortak ifade plazmid BiFC plazmid (Adım 2.1.4) transfected
<img alt="Movie 1" src="/files/ftp_upload/57316/57316video1.jpg"> Film 1: caspase-2 bimolecular floresan uluslara (BiFC) 3D yerelleştirme. 3D yeniden yapılanma, döndürülmüş y-eksen- zconfocal görüntülerin-boyutunda bir Hela hücreleri ifade caspase-2-BiFC bileşenleri ve floresan nükleer muhabir için 16 h camptothecin (20 µM) ile tedavi. Film caspase-2 BiFC (Yeşil) ve çekirdek (kırmızı) gösterir. Bu videoyu izlemek için <a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57316/3D_(Turn_around_Y).avi" target="_blank">lütfen buraya tıklayın. (İndirmek için sağ tıklatın.)</a>
<img alt="Movie 2" src="/files/ftp_upload/57316/57316video2.jpg"> Movie 2: caspase-2 bimolecular floresan uluslara (BiFC), hızlandırılmış. LN18 glioblastoma hücreleri caspase-2 BiFC bileşenleri ile transfected ve bortezomib ile tedavi (15 nm) her 2 dk 8 h için görüntüsü. Film caspase-2 BiFC (Yeşil) ve mitokondri (kırmızı) gösterir. Bu videoyu izlemek için <a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57316/Movie2.avi" target="_blank">lütfen buraya tıklayın. (İndirmek için sağ tıklatın.)</a>

Watch this Scientific Journal Video about Lighting Up the Pathways to Caspase Activation Using Bimolecular Fluorescence Complementation at JoVE.com

Lighting Up the Pathways to Caspase Activation Using Bimolecular Fluorescence Complementation

Bu iletişim kuralı açıklar caspase Bimolecular floresan uluslara (BiFC); Başlatan caspases, indüklenen yakınlığı hangi onların harekete geçirmek için ilk adımdır görselleştirmek için kullanılan bir görüntüleme tabanlı yöntemi.

Caspase harekete geçirmek Bimolecular floresan uluslara kullanarak yolları kadar aydınlatma

The caspase family of proteases play essential roles in apoptosis and innate immunity. Among these, a subgroup known as initiator caspases are the first ...

lighting-up-pathways-to-caspase-activation-using-bimolecular

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biochemistry

9.0K Görüntüleme.  Baylor College of Medicine. Bu iletişim kuralı açıklar caspase Bimolecular floresan uluslara (BiFC); Başlatan caspases, indüklenen yakınlığı hangi onların harekete geçirmek için ilk adımdır görselleştirmek için kullanılan bir görüntüleme tabanlı yöntemi.

Video: Lighting Up the Pathways to Caspase Activation Using Bimolecular Fluorescence Complementation

Use of a Caspase Multiplexing Assay to Determine Apoptosis in a Hypothalamic Cell Model

The ability to multiplex assays in studies of complex cellular mechanisms eliminates the need for repetitive experiments, provides internal controls, and decreases waste in costs and reagents. Here we describe optimization of a multiplex assay to assess apoptosis following a palmitic acid (PA) challenge in an in vitro hypothalamic model, using both fluorescent and luminescent based assays to measure viable cell counts and caspase-3/7 activity in a 96-well microtiter plate format. Following PA challenge, viable cells were determined by a resazurin-based fluorescent assay. Caspase-3/7 activity was then determined using a luminogenic substrate, DEVD, and normalized to cell number. This multiplexing assay is a useful technique for determining change in caspase activity following an apoptotic stimulus, such as saturated fatty acid challenge. The saturated fatty acid PA can increase hypothalamic oxidative stress and apoptosis, indicating the potential importance of assays such as that described here in studying the relationship between saturated fatty acids and neuronal function.

Multiplex assays can provide beneficial information for basic cellular mechanisms&#160;and eliminate waste of reagents and unnecessary repetitive experiments. We describe here a multiplex caspase-3/7 activity assay, using fluorescent- and luminescent-based methods, to determine cell viability in an in vitro hypothalamic model following oxidative challenge with palmitic acid.

Bir Hipotalamik Hücre Modeli Apoptosisi Belirleyen Bir Kaspaz Çoğullama Testi Kullanımı

The ability to multiplex assays in studies of complex cellular mechanisms eliminates the need for repetitive experiments, provides internal controls, and ...

Nörobilim

Measuring Caspase Activity Using a Fluorometric Assay or Flow Cytometry

The activation of cysteine proteases, known as caspases, remains an important process in multiple forms of cell death. Caspases are critical initiators and executioners of apoptosis, the most studied form of programmed cell death. Apoptosis occurs during developmental processes and is a necessary event in tissue homeostasis. Pyroptosis is another form of cell death that utilizes caspases and is a critical process in activating the immune system through the activation of the inflammasome, which results in the release of members of the interleukin-1 (IL-1) family. To assess caspase activity, target substrates can be assessed. However, sensitivity can be an issue when examining single cells or low-level activity. We demonstrate how a fluorogenic substrate can be used with a population-based assay or single-cell assay by flow cytometry. With proper controls, different amino acid sequences can be used to identify which caspases are active. Using these assays, the simultaneous loss of the inhibitors of apoptosis proteins upon tumor necrosis factor (TNF) stimulation has been identified, which primarily induces apoptosis in macrophages rather than other forms of cell death.

The present protocol describes two methods to measure caspase activity through a fluorogenic substrate using flow cytometry or a spectrofluorometer.

Florometrik Tahlil veya Akış Sitometrisi Kullanarak Kaspaz Aktivitesinin Ölçülmesi

The activation of cysteine proteases, known as caspases, remains an important process in multiple forms of cell death. Caspases are critical initiators ...

Biyokimya

Bimolecular Fluorescence Complementation

Defining the subcellular distribution of signaling complexes is imperative to understanding the output from that complex. Conventional methods such as immunoprecipitation do not provide information on the spatial localization of complexes. In contrast, BiFC monitors the interaction and subcellular compartmentalization of protein complexes. In this method, a fluororescent protein is split into amino- and carboxy-terminal non-fluorescent fragments which are then fused to two proteins of interest. Interaction of the proteins results in reconstitution of the fluorophore (Figure 1)1,2. A limitation of BiFC is that once the fragmented fluorophore is reconstituted the complex is irreversible3. This limitation is advantageous in detecting transient or weak interactions, but precludes a kinetic analysis of complex dynamics. An additional caveat is that the reconstituted flourophore requires 30min to mature and fluoresce, again precluding the observation of real time interactions4. BiFC is a specific example of the protein fragment complementation assay (PCA) which employs reporter proteins such as green fluorescent protein variants (BiFC), dihydrofolate reductase, b-lactamase, and luciferase to measure protein:protein interactions5,6. Alternative methods to study protein:protein interactions in cells include fluorescence co-localization and F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET)7. For co-localization, two proteins are individually tagged either directly with a fluorophore or by indirect immunofluorescence. However, this approach leads to high background of non-interacting proteins making it difficult to interpret co-localization data. In addition, due to the limits of resolution of confocal microscopy, two proteins may appear co-localized without necessarily interacting. With BiFC, fluorescence is only observed when the two proteins of interest interact. FRET is another excellent method for studying protein:protein interactions, but can be technically challenging. FRET experiments require the donor and acceptor to be of similar brightness and stoichiometry in the cell. In addition, one must account for bleed through of the donor into the acceptor channel and vice versa. Unlike FRET, BiFC has little background fluorescence, little post processing of image data, does not require high overexpression, and can detect weak or transient interactions. Bioluminescence resonance energy transfer (BRET) is a method similar to FRET except the donor is an enzyme (e.g. luciferase) that catalyzes a substrate to become bioluminescent thereby exciting an acceptor. BRET lacks the technical problems of bleed through and high background fluorescence but lacks the ability to provide spatial information due to the lack of substrate localization to specific compartments8. Overall, BiFC is an excellent method for visualizing subcellular localization of protein complexes to gain insight into compartmentalized signaling.

The subcellular localization of proteins is important in determining the spatio-temporal regulation of cell signaling. Here, we describe bimolecular fluorescence complementation (BiFC) as a straightforward method for monitoring the spatial interactions of proteins in the cell.

Bimoleküler Floresan tamamlama

Defining the subcellular distribution of signaling complexes is imperative to understanding the output from that complex. Conventional methods such as ...

Biyoloji

Detecting Anastasis In Vivo by CaspaseTracker Biosensor

Anastasis (Greek for &#8220;rising to life&#8221;) is a recently discovered cell recovery phenomenon whereby dying cells can reverse late-stage cell death processes that are generally assumed to be intrinsically irreversible. Promoting anastasis could in principle rescue or preserve injured cells that are difficult to replace such as cardiomyocytes or neurons, thereby facilitating tissue recovery. Conversely, suppressing anastasis in cancer cells, undergoing apoptosis after anti-cancer therapies, may ensure cancer cell death and reduce the chances of recurrence. However, these studies have been hampered by the lack of tools for tracking the fate of cells that undergo anastasis in live animals. The challenge is to identify the cells that have reversed the cell death process despite their morphologically normal appearance after recovery. To overcome this difficulty, we have developed Drosophila and mammalian CaspaseTracker biosensor systems that can identify and permanently track the anastatic cells in vitro or in vivo. Here, we present in vivo protocols for the generation and use of the CaspaseTracker dual biosensor system to detect and track anastasis in Drosophila melanogaster after transient exposure to cell death stimuli. While conventional biosensors and protocols can label cells actively undergoing apoptotic cell death, the CaspaseTracker biosensor can permanently label cells that have recovered after caspase activation - a hallmark of late-stage apoptosis, and simultaneously identify active apoptotic processes. This biosensor can also track the recovery of the cells that attempted other forms of cell death that directly or indirectly involved caspase activity. Therefore, this protocol enables us to continuously track the fate of these cells and their progeny, facilitating future studies of the biological functions, molecular mechanisms, physiological and pathological consequences, and therapeutic implications of anastasis. We also discuss the appropriate controls to distinguish cells that undergo anastasis from those that display non-apoptotic caspase activity in vivo.

Detecting Anastasis In Vivo by CaspaseTracker Biosensor

Anastasis is technically challenging to detect in vivo because the cells that have reversed the cell death process can be morphologically indistinguishable from normal healthy cells. Here we describe protocols for detecting and tracking cells that undergo anastasis in live animals by using our newly developed in vivo CaspaseTracker biosensor system.

Anastasis Vivo içinde CaspaseTracker Biyoalgılayıcı tarafından tespit

Anastasis (Greek for &#8220;rising to life&#8221;) is a recently discovered cell recovery phenomenon whereby dying cells can reverse late-stage cell death ...

Tıp

Visualization of Inflammatory Caspases Induced Proximity in Human Monocyte-Derived Macrophages

Inflammatory caspases include caspase-1, -4, -5, -11, and -12 and belong to the subgroup of initiator caspases. Caspase-1 is required to ensure correct regulation of inflammatory signaling and is activated by proximity-induced dimerization following recruitment to inflammasomes. Caspase-1 is abundant in the monocytic cell lineage and induces maturation of the pro-inflammatory cytokines interleukin (IL)-1&#946; and IL-18 to active secreted molecules. The other inflammatory caspases, caspase-4 and -5 (and their murine homolog caspase-11) promote IL-1&#946; release by inducing pyroptosis. Caspase Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) is a tool used to measure inflammatory caspase induced proximity as a readout of caspase activation. The caspase-1, -4, or -5 prodomain, which contains the region that binds to the inflammasome, is fused to non-fluorescent fragments of the yellow fluorescent protein Venus (Venus-N [VN] or Venus-C [VC]) that associate to reform the fluorescent Venus complex when the caspases undergo induced proximity. This protocol describes how to introduce these reporters into primary human monocyte-derived macrophages (MDM) using nucleofection, treat the cells to induce inflammatory caspase activation, and measure caspase activation using fluorescence and confocal microscopy. The advantage of this approach is that it can be used to identify the components, requirements, and localization of the inflammatory caspase activation complex in living cells. However, careful controls need to be considered to avoid compromising cell viability and behavior. This technique is a powerful tool for the analysis of dynamic caspase interactions at the inflammasome level as well as for the interrogation of the inflammatory signaling cascades in living MDM and monocytes derived from human blood samples.

This protocol describes the workflow to obtain monocytes-derived macrophages (MDM) from human blood samples, a simple method to efficiently introduce inflammatory caspase Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) reporters into human MDM without compromising cell viability and behavior, and an imaging-based approach to measure inflammatory caspase activation in living cells.

İnsan Monosit Kaynaklı Makrofajlarda İnflamatuar Kaspazların İndüklenen Yakınlığının Görselleştirilmesi

Inflammatory caspases include caspase-1, -4, -5, -11, and -12 and belong to the subgroup of initiator caspases. Caspase-1 is required to ensure correct ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Evaluation of Caspase Activation to Assess Innate Immune Cell Death

Innate immunity provides the critical first line of defense in response to pathogens and sterile insults. A key mechanistic component of this response is the initiation of innate immune programmed cell death (PCD) to eliminate infected or damaged cells and propagate immune responses. However, excess PCD is associated with inflammation and pathology. Therefore, understanding the activation and regulation of PCD is a central aspect of characterizing innate immune responses and identifying new therapeutic targets across the disease spectrum.
This protocol provides methods for characterizing innate immune PCD activation by monitoring caspases, a family of cysteine-dependent proteases that are often associated with diverse PCD pathways, including&#160;apoptosis,&#160;pyroptosis, necroptosis, and PANoptosis. Initial reports characterized caspase-2, caspase-8, caspase-9, and caspase-10 as initiator caspases and caspase-3, caspase-6, and caspase-7 as effector caspases in apoptosis, while later studies found the inflammatory caspases, caspase-1, caspase-4, caspase-5, and caspase-11, drive pyroptosis. It is now known that there is extensive crosstalk between the caspases and other innate immune and&#160;cell death molecules across the previously defined PCD pathways, identifying a key knowledge gap in the mechanistic understanding of innate immunity and PCD and&#160;leading to the characterization of PANoptosis. PANoptosis is a unique innate immune inflammatory PCD pathway regulated by PANoptosome complexes, which integrate components, including caspases,&#160;from other cell death pathways.
Here, methods for assessing the activation of caspases in response to various stimuli are provided. These methods allow for the characterization of PCD pathways both in vitro and in vivo, as activated caspases undergo proteolytic cleavage that can be visualized by western blotting using optimal antibodies and blotting conditions. A protocol and western blotting workflow have been established that allow for the assessment of the activation of multiple caspases from the same cellular population, providing a comprehensive characterization of the PCD processes. This method can be applied across research areas in development, homeostasis, infection, inflammation, and cancer to evaluate PCD pathways throughout cellular processes in health and disease.

This protocol describes a comprehensive method for assessing caspase activation (caspase-1, caspase-3, caspase-7, caspase-8, caspase-9, and caspase-11) in response to both in vitro and in vivo (in mice) models of infection, sterile insults, and cancer to determine the initiation of cell death pathways, such as pyroptosis, apoptosis, necroptosis, and PANoptosis.

Doğuştan İmmün Hücre Ölümünü Değerlendirmek için Kaspaz Aktivasyonunun Değerlendirilmesi

Innate immunity provides the critical first line of defense in response to pathogens and sterile insults. A key mechanistic component of this response is ...

Strategies for Tracking Anastasis, A Cell Survival Phenomenon that Reverses Apoptosis

Anastasis (Greek for &#8220;rising to life&#8221;) refers to the recovery of dying cells. Before these cells recover, they have passed through important checkpoints of apoptosis, including mitochondrial fragmentation, release of mitochondrial cytochrome c into the cytosol, activation of caspases, chromatin condensation, DNA damage, nuclear fragmentation, plasma membrane blebbing, cell shrinkage, cell surface exposure of phosphatidylserine, and formation of apoptotic bodies. Anastasis can occur when apoptotic stimuli are removed prior to death, thereby allowing dying cells to reverse apoptosis and potentially other death mechanisms. Therefore, anastasis appears to involve physiological healing processes that could also sustain damaged cells inappropriately. The functions and mechanisms of anastasis are still unclear, hampered in part by the limited tools for detecting past events after the recovery of apparently healthy cells. Strategies to detect anastasis will enable studies of the physiological mechanisms, the hazards of undead cells in disease pathology, and potential therapeutics to modulate anastasis. Here, we describe effective strategies using live cell microscopy and a mammalian caspase biosensor&#160;for identifying and tracking anastasis in mammalian cells.

The term anastasis refers to the phenomenon in which dying cells reverse a cell suicide process at a late stage, repair themselves, and ultimately survive. Here we demonstrate protocols for detecting and tracking cells that undergo anastasis.

Takip inişi, Apoptosisi tersine Cep Survival Fenomeni için Stratejiler

Anastasis (Greek for &#8220;rising to life&#8221;) refers to the recovery of dying cells. Before these cells recover, they have passed through important ...

In Vivo Biosensor Tracks Non-apoptotic Caspase Activity in Drosophila

Caspases are the key mediators of apoptotic cell death via their proteolytic activity. When caspases are activated in cells to levels detectable by available technologies, apoptosis is generally assumed to occur shortly thereafter. Caspases can cleave many functional and structural components to cause rapid and complete cell destruction within a few minutes. However, accumulating evidence indicates that in normal healthy cells the same caspases have other functions, presumably at lower enzymatic levels. Studies of non-apoptotic caspase activity have been hampered by difficulties with detecting low levels of caspase activity and with tracking ultimate cell fate in vivo. Here, we illustrate the use of an ultrasensitive caspase reporter, CaspaseTracker, which permanently labels cells that have experienced caspase activity in whole animals. This in vivo dual color CaspaseTracker biosensor for Drosophila melanogaster transiently expresses red fluorescent protein (RFP) to indicate recent or on-going caspase activity, and permanently expresses green fluorescent protein (GFP) in cells that have experienced caspase activity at any time in the past yet did not die. Importantly, this caspase-dependent in vivo biosensor readily reveals the presence of non-apoptotic caspase activity in the tissues of organ systems throughout the adult fly. This is demonstrated using whole mount dissections of individual flies to detect biosensor activity in healthy cells throughout the brain, gut, malpighian tubules, cardia, ovary ducts and other tissues. CaspaseTracker detects non-apoptotic caspase activity in long-lived cells, as biosensor activity is detected in adult neurons and in other tissues at least 10 days after caspase activation. This biosensor serves as an important tool to uncover the roles and molecular mechanisms of non-apoptotic caspase activity in live animals.

In Vivo Biosensor Tracks Non-apoptotic Caspase Activity in Drosophila

To detect healthy cells in whole animals that contain low levels of caspase activity, the highly sensitive biosensor designated CaspaseTracker was generated for Drosophila. Caspase-dependent biosensor activity is detected in long-lived healthy cells throughout the internal organs of adult animals reared under optimized conditions in the absence of death stimuli.

In Vivo Biyosensör Drosophila olmayan apoptotik Kaspaz Aktivite Tracks

Caspases are the key mediators of apoptotic cell death via their proteolytic activity. When caspases are activated in cells to levels detectable by ...

Visualization of Caspase Activation in Human Monocyte-Derived Macrophages

Source: Bol&#237;var, B. E., et. al., <a href="https://app-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/v/63162">Visualization of Inflammatory Caspases Induced Proximity in Human Monocyte-Derived Macrophages.</a> J. Vis. Exp. (2022).
This video demonstrates the activation of caspase proteins in human macrophages using bimolecular fluorescence complementation reporter proteins. The pro-domains of caspase-1 are fused with non-fluorescent fragments of Venus proteins, which are recruited to inflammasome complexes. The proximity of inflammasomes induces the refolding and fluorescence of Venus fragments, confirming caspase activation in the macrophages.

İnsan Monosit Kaynaklı Makrofajlarda Kaspaz Aktivasyonunun Görselleştirilmesi

Source: Bol&#237;var, B. E., et. al., Visualization of Inflammatory Caspases Induced Proximity in Human Monocyte-Derived Macrophages. J. Vis. Exp. 
...

JoVE Encyclopedia of Experiments

İmmünoloji

Bağışıklık Yanıtları

Bağışıklık Modülasyonu

Chemiluminescent Western Blot Assay for Protein Processing

Source: Hillert-Richter, L. K. et al., <a href="https://app-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/v/62842">Measuring Composition of CD95 Death-Inducing Signaling Complex and Processing of Procaspase-8 in this Complex.</a> J. Vis. Exp. (2021).
This video describes the chemiluminescence-based western blotting of immunoprecipitated lysates. The technique helps determine protein processing and activation. The chemiluminescent signal detected is proportional to the level of protein processing during its activation.

Source: Hillert-Richter, L. K. et al., Measuring Composition of CD95 Death-Inducing Signaling Complex and Processing of Procaspase-8 in this Complex. J. ...