Financiamento para este trabalho foi fornecido pela Universidade de San Diego, a National Science Foundation Graduate Research Fellowship Program, NIH grant R01-HG007836 e pelo Ministério da ciência, TIC e planejamento futuro coreano.
Versões anteriores de uma várias figuras foram publicadas primeiramente em "Hoople, G. D. et al . Gel-seq: do inteiro-genoma e transcriptoma sequenciamento por simultânea baixa-entrada DNA e RNA biblioteca preparação usando barreiras semi-permeáveis hidrogel. Laboratório em um Chip 17, 2619-2630, doi:10.1039 / c7lc00430c (2017). " Laboratório em um Chip sancionou a reutilização das figuras nesta publicação.

<ol>
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KZ é co-fundador e Scientific Advisor de Singlera genômica Inc.

Existem vários passos críticos associados com a fabricação do dispositivo de Gel-seq, bem como o protocolo em si. Durante a fabricação, recomendamos começar com as espessuras de camada prescritos para as diversas regiões do gel. Passamos um tempo significativo teste opções de fabricação diferentes e o protocolo descrito aqui produz os melhores dispositivos para as fitas listadas na tabela de materiais e reagentes. Se pesquisadores usam um sistema alternativo de gaveta, eles podem ser necessário ajustar os volumes usados ao criar os dispositivos. O grande desafio na fabricação é que se a região de gel de alta densidade é muito grande pode delaminate das bordas da fita e criar bolsões de ar no interior da fita que perturbe a electroforese. Lançando várias fitas com vários volumes diferentes camada, pesquisadores devem ser capazes de determinar rapidamente a configuração ideal para o seu hardware específico.
O protocolo de Gel-seq também tem várias etapas críticas que podem ser validadas antes que o protocolo seja concluído. Um possível ponto de falha é a separação do gDNA e híbridos de RNA/cDNA. Isto pode ser validado pelo Gel-seq dispositivo de imagem após a separação (ver Figura 3B). Em um conjunto de experiências, nós achamos que nosso suprimento de laboratório da reserva tinha sido contaminado com DNA e estava causando autoflourescence substancial em nosso dispositivo (consulte a Figura 3D). Isto tornou difícil determinar se a separação teve lugar. Imagem fluorescente nos ajudou a identificar e corrigir este problema antes de usar qualquer reagentes caros para gerar bibliotecas de sequenciamento.
Outro ponto crítico é passo 6.2, o qPCR amplificação do cDNA após a separação. Pesquisadores devem prestar atenção para não overamplify nesta etapa, pois isso reduzirá a qualidade dos dados do RNA-seq. Esta consideração não é exclusiva para Gel-seq, mas é um aspecto comum de preparação de biblioteca do baixo-entrada RNA-seq. Amplificação por PCR durante a preparação da biblioteca de sequenciamento é muitas vezes necessária, mas ele pode introduzir vieses e erros de sequência. O número requerido de ciclos para o PCR depende da complexidade e quantidade de amostra. É geralmente aconselhável limitar o número de ciclo PCR para o mínimo requerido para produzir suficiente de cluster quando as bibliotecas são sequenciadas. Em teoria, um protocolo pode ser otimizado para determinar o número exato do ciclo que produz o número suficiente de cópia sem a introdução de artefatos excessivos. Na prática, entretanto, inconsistências na qualidade da amostra, carregar, ou manipulação cedo no protocolo pode afetar drasticamente a distribuição de modelos moleculares disponíveis para a preparação da biblioteca do PCR, que por sua vez afeta o número ideal de ciclo PCR. Encontrámos a solução mais geral para monitorar o progresso das reações de amplificação utilizando um corante fluorescente, executar as reações em um thermocycler PCR em tempo real e parar as reações na exponencial (lineares versus número de ciclo) fase. Em nossa experiência, monitoramento em tempo real é especialmente relevante quando desenvolver, adaptar ou adoptar um novo protocolo.
A última etapa crítica está gerando genômica e transcriptomic bibliotecas. A chave para esta etapa é definir a concentração inicial da amostra para a reação de preparação de biblioteca de DNA tão perto de 0,2 ng / µ l (total de 0.5 ng) quanto possível. Isto é relativamente simples para o cDNA amplificado de qPCR como normalmente há um excesso de cDNA, mas pode ser mais desafiador para as amostras gDNA. Encontramos uma cuidadosos atenção à etapa vacufuge foi necessária enquanto as amostras foram sendo concentradas. Como esperado, em experimentos com células de 1000, o passo de vacufuge poderia ser parado muito mais cedo do que as experiências com 100 células. O número de amostras no vacufuge também impactou a taxa de evaporação em nossos experimentos. Descobrimos que usando um flourometer para validar o DNA conteúdo a meio da etapa de concentração poderia ser útil ao executar o protocolo com amostras desconhecidas. Felizmente, se pesquisadores sobre concentrado uma amostra, nuclease livre da água pode ser adicionado para diluir a amostra. Teoricamente, é possível usar o vacufuge para secar o DNA e então ele resuspenda o volume desejado; no entanto, sugerimos evitar evaporação completa.
Podemos ver os três métodos atuais para a geração de bibliotecas de DNA e RNA simultâneas, Gel-seq7, G & T-seq8e DR-seq9, como cortesia. Gel-seq é ideal para amostras no intervalo de 100-1000 células e não requer nenhum alvos suspensos ou conhecimento a priori do genoma. Os outros dois métodos são mais adequados para aplicações de célula única. Um dos nossos objetivos no desenvolvimento de Gel-seq era criar um protocolo que pode ser facilmente implementado por outros pesquisadores. Portanto, decidimos fabricar dispositivos dentro do fator de forma padrão de uma fita de gel de poliacrilamida. Enquanto a técnica que usamos para definir nossas diferentes membranas é novela, a maioria dos laboratórios de genética já tem todos os equipamentos necessários para fabricar o dispositivo Gel-seq. Além disso, o custo do dispositivo é trivial - apenas US $5,25 para um dispositivo que pode processar 12 amostras. Dito isto, como com qualquer protocolo de preparação de biblioteca usando reagentes comerciais, o custo total para a geração de bibliotecas continua alto. Nosso custo de reagente por exemplo foi de $50 para a amplificação de todo-transcript e US $28 para preparação de biblioteca para DNA e RNA. Felizmente, o próprio dispositivo de Gel-seq é independente de protocolo. Por exemplo, durante o desenvolvimento com sucesso testamos o dispositivo usando células de cultura e um mais velho RNA biblioteca amplificação protocolo19, embora não tenhamos encontrado não era adequado para amostras de tecido de ratos. Olhando para o futuro, como alternativas mais baratas para a preparação de biblioteca são desenvolvidas, nosso protocolo pode ser adaptado para trabalhar com essas novas técnicas. Acreditamos que os pesquisadores vão encontrá-lo simples para implementar Gel-seq em seus laboratórios. Esperamos que isto irá facilitar a rápida adoção da tecnologia.

Próxima geração (NGS) de sequenciamento teve um profundo impacto no caminho a pesquisa genética é realizada. Onde pesquisadores uma vez focada no sequenciamento do genoma de uma espécie inteira, é agora possível sequenciar o genoma de um tumor único ou até mesmo uma única célula em um experimento. 1 NGS também tornou rentável para sequenciar os transcritos de RNA encontrados dentro de uma célula, uma coleção de dados conhecidos como a transcriptoma. A capacidade de amplificar e sequenciar o DNA ou RNA de pequenas amostras de partida só foi alcançada nos últimos cinco anos. 2 , 3 , 4 infelizmente, protocolos padrão são incompatíveis e pesquisadores devem escolher-se para sequenciar o DNA ou RNA para uma determinada amostra. Quando uma amostra inicial é grande o suficiente, ele pode ser dividido ao meio. Em escalas menores, no entanto, perda de material devido a separação de amostras pode afetar a qualidade da biblioteca, e pool de amostras pode média variações interessantes entre as células. 5 além disso, os pesquisadores estão cada vez mais interessados em examinar as amostras que não podem ser divididas, como células únicas ou biópsias de pequeno tumor heterogêneo. 6
Para resolver este problema, recentemente foram desenvolvidos três protocolos para sequenciar o DNA e o RNA da mesma amostra inicial: Gel-seq7, G & T-seq8e DR-seq9. Este artigo apresenta um protocolo detalhado para Gel-seq, que pode ser usado para gerar simultaneamente bibliotecas de DNA e RNA de apenas 100 células no custo adicionado insignificante. O aspecto inovador do Gel-seq é a capacidade de separar o DNA e RNA baseado exclusivamente no tamanho usando matrizes de hidrogel de baixo custo. A inovação do núcleo do protocolo Gel-Seq é a separação física do DNA do RNA. Esta separação é alcançada electrophoretically usando uma combinação de membranas de poliacrilamida que aproveitam as diferenças de tamanho entre estas moléculas. Para colocar estas diferenças de tamanho em contexto, considere como o DNA e RNA são fotografada: enquanto o ADN existe na escala de mícron e pode ser visualizado usando microscópios tradicionais, RNA existe na escala de nanômetros e deve ser fotografado usando técnicas complexas como cryo-elétron microscopia. 10
A abordagem para separação de DNA e RNA neste protocolo é mostrada na Figura 1. O painel esquerdo mostra DNA e RNA livram flutuação em solução perto de uma membrana. Quando um campo elétrico é aplicado, como mostrado no painel da direita, DNA e RNA experimentam uma força eletroforética que induz a migração através da membrana. Ajustando as propriedades da membrana, nós criamos uma membrana semipermeável que separa o DNA do RNA. As moléculas de DNA são empurradas contra a membrana, mas tornar-se enredado na borda, devido ao seu grande tamanho. Pequenas moléculas de RNA, por outro lado, podem reconfigurar e tecer sua maneira através da membrana. Este processo, conhecido como reptation, é similar à maneira que uma cobra se move pela grama. Eventualmente, estas moléculas de RNA são interrompidas por uma membrana de alta densidade, segunda que é muito difícil para polímeros ainda menores (> 200 pares de bases) de esquivar-se através de. Uma vez que fisicamente separados, DNA e RNA podem ser recuperado e processadas para gerar informação sobre o genoma e transcriptoma. Enquanto podemos separar DNA e RNA, encontramos melhores resultados são obtidos se o RNA é reverso transcrito de cDNA antes da separação. Os híbridos de cDNA/RNA são mais estáveis que o RNA sozinho e ainda podem passar através da membrana de baixa densidade.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57315/57315fig1.jpg"> Figura 1 . Princípio de funcionamento de gel-seq. O princípio subjacente usado para separar fisicamente o DNA e RNA. Em um campo elétrico aplicado, pequenas moléculas de RNA migram através da membrana de baixa densidade, mas grandes moléculas de DNA estão presas na superfície. Esta figura foi reproduzida da ref. 7 com a permissão da Real Sociedade de química. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57315/57315fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Este paper descreve detalhadamente tanto a fabricação do Gel-seq dispositivo e o protocolo biológico para gerar emparelhado bibliotecas de DNA e RNA. Uma visão geral de ambos é mostrada na Figura 2. O dispositivo é fabricado pela estratificação três diferentes densidade geles de polyacrylamide em cima do outro em um processo semelhante à criação de gel de empilhamento padrão. 11 o protocolo biológico começa com 100-1000 células suspendidas em PBS. As células lysed e o RNA é convertido em cDNA antes que o dispositivo é usado para separar os híbridos de cDNA/RNA o DNA genômico. Após a separação e recuperação, genômica e transcriptomic bibliotecas são preparadas com um processo que segue de perto o protocolo de kit de preparação de biblioteca padrão do inteiro-genoma. Mais detalhes sobre o desenvolvimento e validação de Gel-seq podem ser lido no laboratório em uma publicação de Chip "Gel-seq: do inteiro-genoma e transcriptoma sequenciamento por simultânea baixa-entrada DNA e RNA biblioteca preparação usando barreiras semi-permeáveis hidrogel ." 7 
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57315/57315fig2.jpg"> Figura 2 . Protocolo de gel-seq. Uma visão geral das etapas para fabricar o dispositivo Gel-seq e o protocolo gerado emparelhado bibliotecas de DNA e RNA. Porções desta figura foram reproduzidas de ref. 7 com a permissão da Real Sociedade de química. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57315/57315fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Para gerar bibliotecas de DNA e RNA de células únicas, pesquisadores devem considerar o uso de G & T-seq ou Seq. DR G & T-Seq, como Gel-seq, se baseia em uma separação física do RNA do DNA genômico. Esta abordagem baseia-se no RNA mensageiro (mRNA) 3 ' polyadenylated cauda como um destino de suspenso. O mRNA é capturada em um grânulo magnético usando um primer de oligo-dT biotinilado. Uma vez que o mRNA foi capturado os grânulos são prendidos no lugar com um imã e o sobrenadante contendo o DNA genômico pode ser removido e transferido para outro tubo. Após concluir esta separação física, bibliotecas separadas podem ser geradas do mRNA e DNA. 8 esta abordagem funciona bem se o RNA de interesse é polyadenylated, porém não pode ser usado para estudar não-polyadenylated transcrições, tais como o RNA ribossomal, tRNA ou RNA de procariontes.
DR-seq baseia-se em uma etapa de pré-amplificação onde tanto o DNA e o cDNA derivados de RNA são amplificados no mesmo tubo. A amostra é então dividida em dois e processada em paralelo para preparar as bibliotecas de DNA e RNA-seq. Para distinguir entre DNA genômico e o cDNA derivados de RNA, DR-seq adota uma abordagem computacional. Sequências onde apenas exões estão presentes são computacionalmente suprimidas nos dados de DNA genômicos, como aqueles poderiam ter se originado de DNA ou RNA. 9 uma vantagem dessa abordagem é que o DNA e RNA de cDNA/precisam não ser fisicamente separados como é feito em Gel-seq e G & T-Seq A desvantagem, no entanto, é que DR-seq requer conhecimento a priori do genoma e transcriptoma (ou seja, exões contra os intrões) e talvez não seja ideal para aplicações tais como sequenciamento dos núcleos, no qual muitas transcrições ainda não são totalmente emendados e ainda contêm intrões. 12
O aspecto inovador do Gel-seq é a capacidade de separar o DNA e RNA em centenas de células com base exclusivamente em tamanho. Este método requer um priori nenhum conhecimento do genoma ou do transcriptoma, é robusto contra emenda incompleta e não está limitado a transcrições de poli-adenylated. Para aplicações onde um pesquisador pode começar com pelo menos 100 células, Gel-seq fornece uma abordagem simples, usando materiais baratos e amplamente disponível.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:905px;" width="906">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">Reagents</td>
			<td style="width:147px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:369px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">Acrylamide Monomer</td>
			<td style="width:147px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A8887-100G</td>
			<td style="width:369px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">Ammonium Persulfate</td>
			<td style="width:147px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A3678-25G</td>
			<td style="width:369px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:271px;">Ampure XP Beads</td>
			<td style="width:147px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:119px;">A63880</td>
			<td style="width:369px;">Referred to in the text as solid phase reversible immobilization (SPRI) beads</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:271px;">DNA Gel Loading Dye (6x)</td>
			<td style="width:147px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">R0611</td>
			<td style="width:369px;">Referred to in the text as 6X loading dye</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">Ethyl alcohol</td>
			<td style="width:147px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">E7023-500ML</td>
			<td style="width:369px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">KAPA SYBR FAST One-Step qRT-PCR Kits</td>
			<td style="width:147px;">Kapa BioSystems</td>
			<td style="width:119px;">7959613001</td>
			<td style="width:369px;">Referred to in the text as 2X qPCR mix</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">N,N&#8242;-Methylenebis(acrylamide)&#160;</td>
			<td style="width:147px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">146072-100G</td>
			<td style="width:369px;">Also known as bis-acrylamide</td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:271px;">NexteraXT DNA Library Preparation Kit (referred to in the text as library preparation kit)</td>
			<td style="width:147px;">Illumina</td>
			<td style="width:119px;">FC-131-1024</td>
			<td style="width:369px;">Includes: TD (referred to in the text as transposase buffer), ATM (referred to in the text as transposase), NT (referred to in the text as transposase stop buffer), and NPM (Referred to in the text as library prep PCR mix)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">Nuclease Free Water</td>
			<td style="width:147px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">3098</td>
			<td style="width:369px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">Protease</td>
			<td style="width:147px;">Qiagen</td>
			<td style="width:119px;">19155</td>
			<td style="width:369px;"></td>
		</tr>
		<tr height="189">
			<td height="189" style="height:189px;width:271px;">SMART-Seq v4 Kit (referred to in the text as whole-transcript amplification (WTA) kit)</td>
			<td style="width:147px;">Takara/Clontech</td>
			<td style="width:119px;">634888</td>
			<td style="width:369px;">Includes: Lysis buffer, RNase inhibitor, 3&#8217; SMART-Seq CDS Primer II A (referred to in the text as RT primer), 5X Ultra Low First Strand Buffer (referred to in the text as first strand buffer), SMART-Seq v4 Oligonucleotide (referred to in the text as template switch oligonucleotide (TSO)), SMART-Scribe Reverse Transcriptase (referred to in the text as reverse transcriptase), and PCR Primer II A (referred to in the text as cDNA PCR primer)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">Random hexamer with WTA adapter&#160;</td>
			<td style="width:147px;">IDT</td>
			<td style="width:119px;">n/a</td>
			<td>5&#8242;-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTAC-NNNNNN-3&#8242;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">Sucrose</td>
			<td style="width:147px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">S0389-500G</td>
			<td style="width:369px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">TEMED</td>
			<td style="width:147px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">T9281-25ML</td>
			<td style="width:369px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:271px;">DNA AWAY Surface Decontaminant</td>
			<td style="width:147px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">7010PK&#160;&#160;</td>
			<td style="width:369px;">Referred to in the text as DNA removal product</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:271px;">Tris-Borate-EDTA buffer (10X concentration)</td>
			<td style="width:147px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">T4415-1L</td>
			<td style="width:369px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:271px;">SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain (10,000X Concentrate in DMSO)</td>
			<td style="width:147px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">S11494</td>
			<td style="width:369px;">Referred to in the text as gel stain</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;"></td>
			<td style="width:147px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:369px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">Equipment</td>
			<td style="width:147px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:369px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:271px;">BD Precisionglide&#160;syringe needles, gauge 18</td>
			<td style="width:147px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">Z192554</td>
			<td style="width:369px;">Any equivalent hardware is acceptable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">Branson CPX series ultrasonic bath</td>
			<td style="width:147px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">Z769363</td>
			<td style="width:369px;">Any equivalent hardware is acceptable</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:271px;">Empty Gel Cassettes, mini, 1.0 mm</td>
			<td style="width:147px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">NC2010</td>
			<td style="width:369px;">Any equivalent hardware is acceptable</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:271px;">Mesh Filter Plate - Corning&#160;HTS Transwell 96 well permeable supports - 8.0 &#181;m pore size</td>
			<td style="width:147px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">CLS3374</td>
			<td style="width:369px;">Referred to in the text as 8 um mesh filter plate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">PowerPac HC Power Supply</td>
			<td style="width:147px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">1645052</td>
			<td style="width:369px;">Any equivalent hardware is acceptable</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:271px;">Qubit Fluorometer</td>
			<td style="width:147px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">Q33216</td>
			<td style="width:369px;">Any equivalent hardware is acceptable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">Vacufuge Concentrator</td>
			<td style="width:147px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">22822993</td>
			<td style="width:369px;">Any equivalent hardware is acceptable</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:271px;">XCell SureLock Mini-Cell system</td>
			<td style="width:147px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">EI0001</td>
			<td style="width:369px;">Any equivalent hardware is acceptable</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:271px;">Bio-Rad CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System</td>
			<td style="width:147px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">1855195&#160;</td>
			<td style="width:369px;">Any equivalent hardware is acceptable</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:271px;">Amersham UVC 500 Ultraviolet Crosslinker</td>
			<td style="width:147px;">GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td style="width:119px;">UVC500-115V</td>
			<td style="width:369px;">Discontinued, any equivalent hardware is acceptable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">Gel Doc XR+ Gel Documentation System</td>
			<td style="width:147px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">1708195</td>
			<td style="width:369px;">Referred to in the text as gel imager</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:271px;">Dark Reader Transilluminator</td>
			<td style="width:147px;">Clare Chemical Research</td>
			<td style="width:119px;">DR89</td>
			<td style="width:369px;">Referred to in the text as UV transilluminator</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">&#160;Ultrasonic&#160;Bath</td>
			<td style="width:147px;">Bransonic</td>
			<td style="width:119px;">1207K35</td>
			<td style="width:369px;">Any equivalent ultrasonic bath is acceptable.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

gel-seq: a method for simultaneous sequencing library preparation of dna and rna using hydrogel matrices

A capacidade de amplificar e sequenciar o DNA ou RNA de pequenas amostras de partida só foi alcançada nos últimos cinco anos. Infelizmente, os protocolos padrão para gerar genômica ou transcriptomic bibliotecas são incompatíveis e pesquisadores devem escolher-se para sequenciar o DNA ou RNA para uma determinada amostra. Gel-seq resolve esse problema permitindo que pesquisadores preparar simultaneamente bibliotecas para DNA e RNA, começando com 100-1000 células usando um dispositivo simples de hidrogel. Este trabalho apresenta uma abordagem detalhada para a fabricação do dispositivo, bem como o protocolo biológico para gerar bibliotecas emparelhadas. Nós projetamos Gel-seq para que ele pode ser facilmente implementado por outros pesquisadores; muitos laboratórios de genética já tem o equipamento necessário para reproduzir a fabricação do dispositivo de Gel-seq. Nosso protocolo emprega comumente usados kits para ambos os todo-transcrição de amplificação (WTA) e preparação da biblioteca, que também são susceptíveis de ser familiar para os investigadores já versado na geração de genômica e transcriptomic bibliotecas. Nossa abordagem permite que os pesquisadores trazer para suportar o poder de sequenciamento de DNA e o RNA em uma única amostra sem divisão e com custo insignificante adicionado.

A separação física dos híbridos gDNA e cDNA/RNA em Gel-seq dispositivo pode ser visualizada através de imagens de gel fluorescente; um resultado representativo é mostrado na Figura 3. Painel A mostra o dispositivo Gel-seq fabricado; falsa cor foi adicionada para distinguir as gel de diferentes regiões. Painel B aparece um close de quatro separações diferentes usadas para validação. A terceira pista, um controlo negativo, representa o plano de fundo e mostra que não há nenhum autoflourescence do gel para as interfaces. Nós carregamos as pistas de primeiras e segunda com escadas de DNA. Essas pistas mostram apenas uma banda escura na interface entre as membranas de baixa e alta densidade, revelando que pequenos fragmentos podem passar através do gel de baixa densidade. A quarta pista mostra o comportamento de uma amostra biológica de interesse: 500 células PC3. Nós carregamos pista quatro conforme descrito na etapa 3 do protocolo. A imagem mostra a separação de DNA genômico e híbridos de cDNA/RNA. Uma faixa escura na parte superior da membrana baixa densidade é megabase-escala DNA genômico, enquanto os híbridos de cDNA/RNA são empilhados na interface das regiões de baixas e alta densidade. Ao contrário das pistas carregadas com escada, há também várias bandas presentes dentro da região de alta densidade do gel. Estes fragmentos, menores do que 100 bp, são o alvo produtos gerados a partir de oligonucleotides cartilha durante a transcrição reversa. Painel C mostra uma imagem representativa de todo o dispositivo de uma experiência bem sucedida Gel-seq. Lanes rotulados RNA/cDNA foram processadas com o protocolo de Gel-seq, enquanto lanes rotulados RNA mostram uma separação de apenas gDNA e RNA. Painel D mostra uma experiência falhada com faixas pretas na parte superior de cada raia da membrana de baixa densidade. Isto foi causado por electroforese buffer contaminado com DNA fragmentado. Neste passo, os investigadores devem ser procurando ambos controles negativos limpo e duas faixas pretas distintas, indicando a presença de gDNA separado e híbridos de RNA/cDNA.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57315/57315fig3.jpg"> Figura 3 . Resultados de separação do gel-Seq. O dispositivo de Gel-seq (A) e uma imagem fluorescente, mostrando a separação dos híbridos de DNA e RNA/cDNA (B). Falsa cor foi adicionada para distinguir mais facilmente entre as diferentes regiões de densidade dentro do gel. (C e D) Imagens fluorescentes representativas de todo o dispositivo de uma bem sucedida (C) e a experiência falhada (D) Gel-seq. NTC = sem controle do modelo. Porções desta figura foram reproduzidas de ref. 7 com a permissão da Real Sociedade de química. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57315/57315fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Uma vez que os híbridos de DNA e RNA/cDNA foram separados e o restante do Gel-seq protocolo concluído, é possível gerar bibliotecas de sequenciamento. Para validar as bibliotecas preparadas, podemos executar um experimento de electroforese do gel de padrão (Figura 4) ou um bioanalyzer. Os resultados da Figura 4 mostram bibliotecas geradas a partir de 500 células PC3 e 750 células HeLa. A figura mostra as distribuições de fragmento para bibliotecas correspondentes geradas a partir de Gel-seq (rotulado 'Gel') em comparação com amostras incomparáveis geradas com protocolos padrão (rotulados 'Tube'). Os tamanhos do fragmento de Gel-seq aparecem entre 200 e 800 basepairs como esperado quando preparar bibliotecas usando o kit de preparação da biblioteca padrão do inteiro-genoma. Se os fragmentos de biblioteca não aparecem na faixa de tamanho correto nesta etapa, a preparação de biblioteca falhou.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57315/57315fig4.jpg"> Figura 4 . Comparação de tamanho de fragmento de biblioteca. Uma imagem de eletroforese de gel de fluorescente comparando a distribuição de tamanho de biblioteca entre Gel-seq (Gel) e controles padrão (tubo). Na faixa da esquerda contém uma baixa massa escada de DNA com fragmento tamanhos 100, 200, 400, 800, 1200 e 2000 basepairs. Os tamanhos de fragmento para todas as bibliotecas cair entre 200 e 800 basepairs, conforme o esperado para bibliotecas preparadas com este kit. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57315/57315fig4large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
A validação final do Gel-seq protocolo baseia-se na análise dos resultados do sequenciamento. Nós selecionamos PC3 células para nossos experimentos de validação, como estas células têm perfis de expressão homogénea que permitem amostras ser dividido e processados usando Gel-seq e métodos tradicionais; consulte a Figura 5. Uma comparação entre o DNA genômico para células PC3 é mostrada nas figuras 5A e 5B. Figura 5 A mostra uma comparação dos perfis de variação (CNV) cópia de genoma-largo números gerado a partir de PC3 usando Gel-seq ou uma reação de preparação de biblioteca padrão do inteiro-genoma (controle de tubo). Cada ponto é uma contagem média bin normalizado; escaninhos são definidos a partir de dados do genoma de referência tal que cada bin tem igual contagem esperada em uma célula diploide saudável, ou seja, uma linha plana, representando cópias iguais para cada região de tudo autossômica (excluindo o X e Y) cromossomos. PC3 contém várias cópias das mesmas regiões que aparecem como picos acima de um número de cópia do plano de fundo de dois. Gel-seq produz um perfil CNV qualitativamente semelhante como reação de tubo padrão. Acordo entre as duas parcelas pode ser avaliado quantitativamente por regressão linear, conforme mostrado no painel B. Uma correlação de Pearson r = 0,90 indica que dados genomic reunidos a partir de qualquer método são funcionalmente equivalentes.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57315/57315fig5.jpg"> Figura 5 . Validação de biblioteca. Gel-seq validação para a genômica (A e B) e transcriptomic (C, D e E) dados gerados de PC3 de células Hela. Painel A mostra uma comparação do genoma-largo CNV perfis gerados a partir de PC3 usando Gel-seq (Gel-seq) ou uma reação padrão (tubo). MAPD = mediana absoluta diferença emparelhadas. Painel B é uma regressão linear entre as duas amostras no painel A, com R = 0,90, indicando os dados genomic são funcionalmente equivalentes. Os eixos mostram que o bin normalizado log2 conta. Painéis C e D comparam dados de transcriptomic de células do PC3, com cada ponto, mostrando uma contagem em transcrições por mil por milhão (TPM). Os eixos mostram a comparação entre duas amostras como contagens de transcrição log2 normalizado. Painel C mostra uma comparação de técnicas repetições gerado usando Gel-seq e painel D mostra que uma comparação entre o Gel-seq e tradicional E de painel de RNA-Seq mostra que seq-Gel pode resolver o tipo de célula com base na expressão de RNA, usando uma análise de componentes principais. O eixo x que mostra as primeiras contas de componentes principais para 91,6% da variação entre as amostras, enquanto o eixo y mostra que as contas segunda componente principal apenas 6,5% da variância. Porções desta figura foram reproduzidas de ref. 7 com a permissão da Real Sociedade de química. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57315/57315fig5large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Da mesma forma, comparamos transcriptomic dados da nosso Gel-seq protocolo para o protocolo padrão do Smart-Seq no tubo. A Figura 5 mostra a correlação entre ambas as repetições técnicas Gel-seq (Figura 5-C) e entre Gel-seq e o método padrão (Figura 5-D). Cada ponto é uma contagem em transcrições por mil por milhão (TPM) para cada gene detectado no TPM > 5 em ambos os conjuntos de dados. As regressões lineares são mostradas como linhas vermelhas, e o coeficiente de correlação de Pearson é mostrado no canto superior esquerdo. Repetições de técnicas de Gel-seq (∼ R 0.8) de acordo, mas menos bem se correlacionam com o método padrão (R < 0,7). Isto sugere que o Gel-seq introduz um viés na contagem de gene. Felizmente, este preconceito é sistemático e, como pode ser visto na Figura 5Ea análise de componentes principais, conclusões significativas ainda podem ser estabelecidas entre diferentes amostras biológicas.

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Gel-seq: A Method for Simultaneous Sequencing Library Preparation of DNA and RNA Using Hydrogel Matrices

Gel-seq permite aos investigadores simultaneamente preparar bibliotecas para ambos DNA - e RNA-seq insignificante custo adicionado a partir de 100-1000 células usando um dispositivo simples de hidrogel. Este trabalho apresenta uma abordagem detalhada para a fabricação do dispositivo, bem como o protocolo biológico para gerar bibliotecas emparelhadas.

Gel-seq: Um método para a preparação de biblioteca simultânea de sequenciamento de DNA e RNA usando matrizes de hidrogel

The ability to amplify and sequence either DNA or RNA from small starting samples has only been achieved in the last five years. Unfortunately, the ...

gel-seq-method-for-simultaneous-sequencing-library-preparation-dna

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Bioengineering

8.9K visualizações.  University of San Diego. Gel-seq permite aos investigadores simultaneamente preparar bibliotecas para ambos DNA - e RNA-seq insignificante custo adicionado a partir de 100-1000 células usando um dispositivo simples de hidrogel. Este trabalho apresenta uma abordagem detalhada para a fabricação do dispositivo, bem como o protocolo biológico para gerar bibliotecas emparelhadas.

Vídeo: Gel-seq: A Method for Simultaneous Sequencing Library Preparation of DNA and RNA Using Hydrogel Matrices

Preparation of Complaint Matrices for Quantifying Cellular Contraction

The regulation of cellular adhesion to the extracellular matrix (ECM) is essential for cell migration and ECM remodeling. Focal adhesions are macromolecular assemblies that couple the contractile F-actin cytoskeleton to the ECM. This connection allows for the transmission of intracellular mechanical forces across the cell membrane to the underlying substrate. Recent work has shown the mechanical properties of the ECM regulate focal adhesion and F-actin morphology as well as numerous physiological processes, including cell differentiation, division, proliferation and migration. Thus, the use of cell culture substrates has become an increasingly prevalent method to precisely control and modulate ECM mechanical properties.
To quantify traction forces at focal adhesions in an adherent cell, compliant substrates are used in conjunction with high-resolution imaging and computational techniques in a method termed traction force microscopy (TFM). This technique relies on measurements of the local magnitude and direction of substrate deformations induced by cellular contraction. In combination with high-resolution fluorescence microscopy of fluorescently tagged proteins, it is possible to correlate cytoskeletal organization and remodeling with traction forces.
Here we present a detailed experimental protocol for the preparation of two-dimensional, compliant matrices for the purpose of creating a cell culture substrate with a well-characterized, tunable mechanical stiffness, which is suitable for measuring cellular contraction. These protocols include the fabrication of polyacrylamide hydrogels, coating of ECM proteins on such gels, plating cells on gels, and high-resolution confocal microscopy using a perfusion chamber. Additionally, we provide a representative sample of data demonstrating location and magnitude of cellular forces using cited TFM protocols.

In this video, we demonstrate the experimental techniques used to fabricate compliant, extracellular matrix (ECM) coated substrates suitable for cell culture, and which are amenable to traction force microscopy and observing effects of ECM stiffness on cell behavior.

Preparação de Matrizes Reclamação para Quantificar contração celular

The regulation of cellular adhesion to the extracellular matrix (ECM) is essential for cell migration and ECM remodeling.  Focal adhesions are ...

Bioengenharia

Constant Pressure-controlled Extrusion Method for the Preparation of Nano-sized Lipid Vesicles

Liposomes are artificially prepared vesicles consisting of natural and synthetic phospholipids that are widely used as a cell membrane mimicking platform to study protein-protein and protein-lipid interactions3, monitor drug delivery4,5, and encapsulation4. Phospholipids naturally create curved lipid bilayers, distinguishing itself from a micelle.6 Liposomes are traditionally classified by size and number of bilayers, i.e. large unilamellar vesicles (LUVs), small unilamellar vesicles (SUVs) and multilamellar vesicles (MLVs)7. In particular, the preparation of homogeneous liposomes of various sizes is important for studying membrane curvature that plays a vital role in cell signaling, endo- and exocytosis, membrane fusion, and protein trafficking8. Several groups analyze how proteins are used to modulate processes that involve membrane curvature and thus prepare liposomes of diameters &lt;100 - 400 nm to study their behavior on cell functions3. Others focus on liposome-drug encapsulation, studying liposomes as vehicles to carry and deliver a drug of interest9. Drug encapsulation can be achieved as reported during liposome formation9. Our extrusion step should not affect the encapsulated drug for two reasons, i.e. (1) drug encapsulation should be achieved prior to this step and (2) liposomes should retain their natural biophysical stability, securely carrying the drug in the aqueous core. These research goals further suggest the need for an optimized method to design stable sub-micron lipid vesicles.
Nonetheless, the current liposome preparation technologies (sonication10, freeze-and-thaw10, sedimentation) do not allow preparation of liposomes with highly curved surface (i.e. diameter &lt;100 nm) with high consistency and efficiency10,5, which limits the biophysical studies of an emerging field of membrane curvature sensing. Herein, we present a robust preparation method for a variety of biologically relevant liposomes.
Manual extrusion using gas-tight syringes and polycarbonate membranes10,5 is a common practice but heterogeneity is often observed when using pore sizes &lt;100 nm due to due to variability of manual pressure applied. We employed a constant pressure-controlled extrusion apparatus to prepare synthetic liposomes whose diameters range between 30 and 400 nm. Dynamic light scattering (DLS)10, electron microscopy11 and nanoparticle tracking analysis (NTA)12 were used to quantify the liposome sizes as described in our protocol, with commercial polystyrene (PS) beads used as a calibration standard. A near linear correlation was observed between the employed pore sizes and the experimentally determined liposomes, indicating high fidelity of our pressure-controlled liposome preparation method. Further, we have shown that this lipid vesicle preparation method is generally applicable, independent of various liposome sizes. Lastly, we have also demonstrated in a time course study that these prepared liposomes were stable for up to 16 hours. A representative nano-sized liposome preparation protocol is demonstrated below.

This protocol describes an extrusion method for preparing lipid vesicles of sub-micron sizes with a high degree of homogeneity. This method uses a pressure-controlled system with controlled nitrogen flow rates for liposome preparation. The lipid preparation1,2, liposome extrusion, and size characterization will be presented herein.

Método de extrusão constante pressão controlada para a Preparação de vesículas lipídicas nanométricas

Liposomes are artificially prepared vesicles consisting of natural and synthetic phospholipids that are widely used as a cell membrane mimicking platform ...

An Improved Method for the Preparation of Type I Collagen From Skin

Soluble type 1 collagen (COL1) is used extensively as an adhesive substrate for cell cultures and as a cellular scaffold for regenerative applications. Clinically, this protein is widely used for cosmetic surgery, dermal injections, bone grafting, and reconstructive surgery. The sources of COL1 for these procedures are commonly nonhuman, which increases the potential for inflammation and rejection as well as xenobiotic disease transmission. In view of this, a method to efficiently and quickly purify COL1 from limited quantities of autologously-derived tissues would circumvent many of these issues; however, standard isolation protocols are lengthy and often require large quantities of collagenous tissues. Here, we demonstrate an efficient COL1 extraction method that reduces the time needed to isolate and purify this protein from about 10 days to less than 3 hr. We chose the dermis as our tissue source because of its availability during many surgical procedures. This method uses traditional extraction buffers combined with forceful agitation and centrifugal filtration to obtain highly-pure, soluble COL1 from small amounts of corium. Briefly, dermal biopsies are washed thoroughly in ice-cold dH2O after removing fat, connective tissue, and hair. The skin samples are stripped of noncollagenous proteins and polysaccharides using 0.5 M sodium acetate and a high speed bench-top homogenizer. Collagen from residual solids is subsequently extracted with a 0.075 M sodium citrate buffer using the homogenizer. These extracts are purified using 100,000 MW cut-off centrifugal filters that yield COL1 preparations of comparable or superior quality to commercial products or those obtained using traditional procedures. We anticipate this method will facilitate the utilization of autologously-derived COL1 for a multitude of research and clinical applications.

Traditional procedures for the isolation of soluble type 1 collagen (COL1) require about 10 days from start to finish because of lengthy buffer incubations and laborious resuspensions of fibrils. Here, we describe a means to purify COL1 from small dermal biopsies in less than 3 hr.

Um método aperfeiçoado para a preparação de colágeno tipo I Da Pele

Soluble type 1 collagen (COL1) is used extensively as an adhesive substrate for cell cultures and as a cellular scaffold for regenerative applications. ...

Synthesis of an Intein-mediated Artificial Protein Hydrogel

We present the synthesis of a highly stable protein hydrogel mediated by a split-intein-catalyzed protein trans-splicing reaction. The building blocks of this hydrogel are two protein block-copolymers each containing a subunit of a trimeric protein that serves as a crosslinker and one half of a split intein. A highly hydrophilic random coil is inserted into one of the block-copolymers for water retention. Mixing of the two protein block copolymers triggers an intein trans-splicing reaction, yielding a polypeptide unit with crosslinkers at either end that rapidly self-assembles into a hydrogel. This hydrogel is very stable under both acidic and basic conditions, at temperatures up to 50 &#176;C, and in organic solvents. The hydrogel rapidly reforms after shear-induced rupture. Incorporation of a &#34;docking station peptide&#34; into the hydrogel building block enables convenient incorporation of &#34;docking protein&#34;-tagged target proteins. The hydrogel is compatible with tissue culture growth media, supports the diffusion of 20 kDa molecules, and enables the immobilization of bioactive globular proteins. The application of the intein-mediated protein hydrogel as an organic-solvent-compatible biocatalyst was demonstrated by encapsulating the horseradish peroxidase enzyme and corroborating its activity.

We present the synthesis of a split-intein-mediated protein hydrogel. The building blocks of this hydrogel are two protein copolymers each containing a subunit of a trimeric protein that serves as a crosslinker and one half of a split intein. Mixing of the two protein copolymers triggers an intein trans-splicing reaction, yielding a polypeptide unit that self-assembles into a hydrogel. This hydrogel is highly pH- and temperature-stable, compatible with organic solvents, and easily incorporates functional globular proteins.

Síntese de uma proteína artificial intein mediada Hidrogel

We present the synthesis of a highly stable protein hydrogel mediated by a split-intein-catalyzed protein trans-splicing reaction. The building blocks of ...

Hydrogel Nanoparticle Harvesting of Plasma or Urine for Detecting Low Abundance Proteins

Novel biomarker discovery plays a crucial role in providing more sensitive and specific disease detection. Unfortunately many low-abundance biomarkers that exist in biological fluids cannot be easily detected with mass spectrometry or immunoassays because they are present in very low concentration, are labile, and are often masked by high-abundance proteins such as albumin or immunoglobulin. Bait containing poly(N-isopropylacrylamide) (NIPAm) based nanoparticles are able to overcome these physiological barriers. In one step they are able to capture, concentrate and preserve biomarkers from body fluids. Low-molecular weight analytes enter the core of the nanoparticle and are captured by different organic chemical dyes, which act as high affinity protein baits. The nanoparticles are able to concentrate the proteins of interest by several orders of magnitude. This concentration factor is sufficient to increase the protein level such that the proteins are within the detection limit of current mass spectrometers, western blotting, and immunoassays. Nanoparticles can be incubated with a plethora of biological fluids and they are able to greatly enrich the concentration of low-molecular weight proteins and peptides while excluding albumin and other high-molecular weight proteins. Our data show that a 10,000 fold amplification in the concentration of a particular analyte can be achieved, enabling mass spectrometry and immunoassays to detect previously undetectable biomarkers.

Several pathological biomarkers cannot be easily detected by current techniques because of their low concentration in biological fluids, the presence of degrading enzymes, and large amounts of high molecular weight proteins. Chemically functionalized hydrogel nanoparticles can harvest, preserve and concentrate low abundance proteins enabling the detection of previously undetectable biomarkers.

Hidrogel nanopartículas colheita de plasma ou urina para detectar proteínas de baixa abundância

Novel biomarker discovery plays a crucial role in providing more sensitive and specific disease detection. Unfortunately many low-abundance biomarkers ...

Bioprinting Cellularized Constructs Using a Tissue-specific Hydrogel Bioink

Bioprinting has emerged as a versatile biofabrication approach for creating tissue engineered organ constructs. These constructs have potential use as organ replacements for implantation in patients, and also, when created on a smaller size scale as model "organoids" that can be used in in vitro systems for drug and toxicology screening.
Despite development of a wide variety of bioprinting devices, application of bioprinting technology can be limited by the availability of materials that both expedite bioprinting procedures and support cell viability and function by providing tissue-specific cues. Here we describe a versatile hyaluronic acid (HA) and gelatin-based hydrogel system comprised of a multi-crosslinker, 2-stage crosslinking protocol, which can provide tissue specific biochemical signals and mimic the mechanical properties of in vivo tissues. 
Biochemical factors are provided by incorporating tissue-derived extracellular matrix materials, which include potent growth factors. Tissue mechanical properties are controlled combinations of PEG-based crosslinkers with varying molecular weights, geometries (linear or multi-arm), and functional groups to yield extrudable bioinks and final construct shear stiffness values over a wide range (100 Pa to 20 kPa). Using these parameters, hydrogel bioinks were used to bioprint primary liver spheroids in a liver-specific bioink to create in vitro liver constructs with high cell viability and measurable functional albumin and urea output. This methodology provides a general framework that can be adapted for future customization of hydrogels for biofabrication of a wide range of tissue construct types.

We describe a set of protocols that together provide a tissue-mimicking hydrogel bioink with which functional and viable 3-D tissue constructs can be bioprinted for use in in vitro screening applications.

Bioprinting celularizado Constrói Usando um específico do tecido Hidrogel Bioink

Bioprinting has emerged as a versatile biofabrication approach for creating tissue engineered organ constructs. These constructs have potential use as ...

Fabricating a Kidney Cortex Extracellular Matrix-Derived Hydrogel

Extracellular matrix (ECM) provides important biophysical and biochemical cues to maintain tissue homeostasis. Current synthetic hydrogels offer robust mechanical support for in vitro cell culture but lack the necessary protein and ligand composition to elicit physiological behavior from cells. This manuscript describes a fabrication method for a kidney cortex ECM-derived hydrogel with proper mechanical robustness and supportive biochemical composition. The hydrogel is fabricated by mechanically homogenizing and solubilizing decellularized human kidney cortex ECM. The matrix preserves native kidney cortex ECM protein ratios while also enabling gelation to physiological mechanical stiffnesses. The hydrogel serves as a substrate upon which kidney cortex-derived cells can be maintained under physiological conditions. Furthermore, the hydrogel composition can be manipulated to model a diseased environment which enables the future study of kidney diseases.

Here we present a protocol to fabricate a kidney cortex extracellular matrix-derived hydrogel to retain the native kidney extracellular matrix (ECM) structural and biochemical composition. The fabrication process and its applications are described. Finally, a perspective on using this hydrogel to support kidney-specific cellular and tissue regeneration and bioengineering is discussed.

Fabricando um rim córtex Extracellular Matrix-derivado hidrogel

Extracellular matrix (ECM) provides important biophysical and biochemical cues to maintain tissue homeostasis. Current synthetic hydrogels offer robust ...

Ultra-long Read Sequencing for Whole Genomic DNA Analysis

Third generation single-molecule DNA sequencing technologies offer significantly longer read length that can facilitate the assembly of complex genomes and analysis of complex structural variants. Nanopore platforms perform single-molecule sequencing by directly measuring the current changes mediated by DNA passage through the pores and can generate hundreds of kilobase (kb) reads with minimal capital cost. This platform has been adopted by many researchers for a variety of applications. Achieving longer sequencing read lengths is the most critical factor to leverage the value of nanopore sequencing platforms. To generate ultra-long reads, special consideration is required to avoid DNA breakages and gain efficiency to generate productive sequencing templates. Here, we provide the detailed protocol of ultra-long DNA sequencing including high molecular weight (HMW) DNA extraction from fresh or frozen cells, library construction by mechanical shearing or transposase fragmentation, and sequencing on a nanopore device. From 20-25 &#181;g of HMW DNA, the method can achieve N50 read length of 50-70 kb with mechanical shearing and N50 of 90-100 kb read length with transposase mediated fragmentation. The protocol can be applied to DNA extracted from mammalian cells to perform whole genome sequencing for the detection of structural variants and genome assembly. Additional improvements on the DNA extraction and enzymatic reactions will further increase the read length and expand its utility.

Long-read sequences greatly facilitate the assembly of complex genomes and characterization of structural variation. We describe a method to generate ultra-long sequences by nanopore-based sequencing platforms. The approach adopts an optimized DNA extraction followed by modified library preparations to generate hundreds of kilobase reads with moderate coverage from human cells.

Sequenciamento de leitura ultralonga para análise de DNA genômico completo

Third generation single-molecule DNA sequencing technologies offer significantly longer read length that can facilitate the assembly of complex genomes ...

High Throughput Yeast Strain Phenotyping with Droplet-Based RNA Sequencing

The powerful tools available to edit yeast genomes have made this microbe a valuable platform for engineering. While it is now possible to construct libraries of millions of genetically distinct strains, screening for a desired phenotype remains a significant obstacle. With existing screening techniques, there is a tradeoff between information output and throughput, with high-throughput screening typically being performed on one product of interest. Therefore, we present an approach to accelerate strain screening by adapting single cell RNA sequencing to isogenic picoliter colonies of genetically engineered yeast strains. To address the unique challenges of performing RNA sequencing on yeast cells, we culture isogenic yeast colonies within hydrogels and spheroplast prior to performing RNA sequencing. The RNA sequencing data can be used to infer yeast phenotypes and sort out engineered pathways. The scalability of our method addresses a critical obstruction in microbial engineering.

A bottleneck in the &#8216;design-build-test&#8217; cycle of microbial engineering is the speed at which we can perform functional screens of strains. We describe a high-throughput method for strain screening applied to hundreds to thousands of yeast cells per experiment that utilizes droplet-based RNA sequencing.

Fenotipagem de tensão de levedura de alta produtividade com sequenciamento de RNA baseado em gotículas

The powerful tools available to edit yeast genomes have made this microbe a valuable platform for engineering. While it is now possible to construct ...

Simultaneous Quantification of Selected Kynurenines Analyzed by Liquid Chromatography-Mass Spectrometry in Medium Collected from Cancer Cell Cultures

The kynurenine pathway and the tryptophan catabolites called kynurenines have received increased attention for their involvement in immune regulation and cancer biology. An in vitro cell culture assay is often used to learn about the contribution of different tryptophan catabolites in a disease mechanism and for testing therapeutic strategies. Cell culture medium that is rich in secreted metabolites and signaling molecules reflects the status of tryptophan metabolism and other cellular events. New protocols for the reliable quantification of multiple kynurenines in the complex cell culture medium are desired to allow for a reliable and quick analysis of multiple samples. This can be accomplished with liquid chromatography coupled with mass spectrometry. This powerful technique is employed in many clinical and research laboratories for the quantification of metabolites and can be used for measuring kynurenines.
Presented here is the use of liquid chromatography coupled with single quadrupole mass spectrometry (LC-SQ) for the simultaneous determination of four kynurenines, i.e., kynurenine, 3-hydroxykynurenine, 3-hydroxyanthranilic, and xanthurenic acid in the medium collected from in vitro cultured cancer cells. SQ detector is simple to use and less expensive compared to other mass spectrometers. In the SQ-MS analysis, multiple ions from the sample are generated and separated according to their specific mass-to-charge ratio (m/z), followed by the detection using a Single Ion Monitoring (SIM) mode.
This paper draws the attention on the advantages of the reported method and indicates some weak points. It is focused on critical elements of LC-SQ analysis including sample preparation along with chromatography and mass spectrometry analysis. The quality control, method calibration conditions and matrix effect issues are also discussed. We described a simple application of 3-nitrotyrosine as one analog standard for all target analytes. As confirmed by experiments with human ovary and breast cancer cells, the proposed LC-SQ method&#160;generates reliable results and can be further applied to other in vitro cellular models.

Described here is a protocol for the determination of four different tryptophan metabolites generated in the kynurenine pathway (kynurenine, 3-hydroxykynurenine, xanthurenic acid, 3-hydroxyanthranilic acid) in the medium collected from cancer cell cultures analyzed by liquid chromatography coupled with a single quadrupole mass spectrometry.

Quantificação simultânea de kynureninas selecionadas analisadas por espectrometria de cromatografia líquida-massa em média coletada de culturas celulares cancerosas

The kynurenine pathway and the tryptophan catabolites called kynurenines have received increased attention for their involvement in immune regulation and ...