מימון עבור עבודה זו היה בתנאי על-ידי באוניברסיטת סן דייגו, הלאומית למדע קרן בוגר מחקר תכנית העמיתים, NIH להעניק R01-HG007836, ועל ידי קוריאנית משרד המדע, ICT ותכנון העתיד.
גירסאות קודמות של כמה דמויות פורסמו לראשונה ב- "התקליט הזה, ג ד. et al. ג'ל-seq: הגנום כולו, רצף transcriptome על ידי סימולטני קלט נמוך-DNA ו- RNA ספריית הכנה באמצעות מחסומים הידרוג חדיר למחצה. מעבדה על שבב 17, מוריה ברטל-2630, doi:10.1039 / c7lc00430c (2017). " מעבדה על שבב וההתנהגותיים שימוש חוזר של דמויות בפרסום זה.

<ol>
	<li>Mawy, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+sequencing.">Single-cell sequencing.</a> Nat Methods. 11 (1), 18 (2014).</li><li>Gole, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Massively+parallel+polymerase+cloning+and+genome+sequencing+of+single+cells+using+nanoliter+microwells.">Massively parallel polymerase cloning and genome sequencing of single cells using nanoliter microwells.</a> Nat Biotech. 31 (12), 1126-1132 (2013).</li><li>Sasagawa, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quartz-Seq:+a+highly+reproducible+and+sensitive+single-cell+RNA-Seq+reveals+non-genetic+gene+expression+heterogeneity.">Quartz-Seq: a highly reproducible and sensitive single-cell RNA-Seq reveals non-genetic gene expression heterogeneity.</a> Genome Biol. 14 (4), 31 (2013).</li><li>Ramsk&#246;ld, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Full-length+mRNA-Seq+from+single-cell+levels+of+RNA+and+individual+circulating+tumor+cells.">Full-length mRNA-Seq from single-cell levels of RNA and individual circulating tumor cells.</a> Nat Biotechnol. 30 (8), 777-782 (2012).</li><li>Shapiro, E., Biezuner, T., Linnarsson, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+sequencing-based+technologies+will+revolutionize+whole-organism+science.">Single-cell sequencing-based technologies will revolutionize whole-organism science.</a> Nat Rev Genet. 14 (9), 618-630 (2013).</li><li>Navin, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour+evolution+inferred+by+single-cell+sequencing.">Tumour evolution inferred by single-cell sequencing.</a> Nature. 472 (7341), 90-94 (2011).</li><li>Hoople, G. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gel-seq:+whole-genome+and+transcriptome+sequencing+by+simultaneous+low-input+DNA+and+RNA+library+preparation+using+semi-permeable+hydrogel+barriers.">Gel-seq: whole-genome and transcriptome sequencing by simultaneous low-input DNA and RNA library preparation using semi-permeable hydrogel barriers.</a> Lab Chip. 17, 2619-2630 (2017).</li><li>Macaulay, I. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G&amp;T-seq:+parallel+sequencing+of+single-cell+genomes+and+transcriptomes.">G&amp;T-seq: parallel sequencing of single-cell genomes and transcriptomes.</a> Nat Methods. 12 (6), 519-522 (2015).</li><li>Dey, S. S., Kester, L., Spanjaard, B., Bienko, M., van Oudenaarden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrated+genome+and+transcriptome+sequencing+of+the+same+cell.">Integrated genome and transcriptome sequencing of the same cell.</a> Nat Biotechnol. 33 (3), 285-289 (2015).</li><li>Gopal, A., Zhou, Z. H., Knobler, C. M., Gelbart, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+large+RNA+molecules+in+solution.">Visualizing large RNA molecules in solution.</a> RNA. 18 (2), 284-299 (2012).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SDS-PAGE+Gel.">SDS-PAGE Gel.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2015 (7), 087908 (2015).</li><li>Lake, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+subtypes+and+diversity+revealed+by+single-nucleus+RNA+sequencing+of+the+human+brain.">Neuronal subtypes and diversity revealed by single-nucleus RNA sequencing of the human brain.</a> Science. 352 (6293), (2016).</li><li>Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. -. Y., Kim, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agarose+Gel+Electrophoresis+for+the+Separation+of+DNA+Fragments.">Agarose Gel Electrophoresis for the Separation of DNA Fragments.</a> J Vis Exp. (62), e3923 (2012).</li><li>Qubit 3.0 Fluorometer Manual. MAN0010866. Life Technologies Available from: <a target="_blank" href="https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/qubit_3_fluorometer_man.pd">https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/qubit_3_fluorometer_man.pd</a> (2017)</li><li>Vitak, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequencing+thousands+of+single-cell+genomes+with+combinatorial+indexing.">Sequencing thousands of single-cell genomes with combinatorial indexing.</a> Nat Methods. 14 (3), 302-308 (2017).</li><li>Illumina. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Nextera &#174; XT DNA Library Preparation Kit. , (2017).</li><li>Takara Bio USA Inc. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> SMART-Seq v4 Ultra Low Input RNA Kit for Sequencing User Manual. , (2016).</li><li>Kurimoto, K., Yabuta, Y., Ohinata, Y., Saitou, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+single-cell+cDNA+amplification+to+provide+a+template+for+representative+high-density+oligonucleotide+microarray+analysis.">Global single-cell cDNA amplification to provide a template for representative high-density oligonucleotide microarray analysis.</a> Nat Protoc. 2 (3), 739-752 (2007).</li></ol>

KZ הינו מייסד ומנכ ל מדעי יועץ של Singlera גנומיקה inc.

ישנם מספר שלבים קריטיים המשויך הזיוף התקן ג'ל-seq, כמו גם את הפרוטוקול עצמו. במהלך פבריקציה נוספת, אנו ממליצים החל עוביים השכבה שנקבעו עבור אזורים שונים של הג'ל. בילינו זמן משמעותי בדיקת אפשרויות ייצור שונה ומייצרת הפרוטוקול המתואר כאן ההתקנים הטוב ביותר עבור הקלטות המפורטים בטבלה של חומרים, ריאגנטים. אם חוקרים משתמשים מערכת חלופית קלטת, הם עשויים למצוא אותו צורך לעדן את אמצעי האחסון שמשמש בעת יצירת המכשירים. האתגר העיקרי ב פבריקציה נוספת היא שאם האזור ג'ל בצפיפות גבוהה גדול מדי זה יכול delaminate מקצות הקלטת וליצור כיסי אוויר על הפנים של קלטת שישבש אלקטרופורזה. ליהקנו מספר קלטות עם מספר כרכים שכבת שונה, חוקרים צריך להיות מסוגל לקבוע במהירות את התצורה המיטבית עבור חומרה מסוימת שלהם.
פרוטוקול ג'ל-seq יש גם מספר שלבים קריטיים הניתנים לאימות לפני השלמת הפרוטוקול. נקודת כשל פוטנציאלי אחד היא ההפרדה gDNA ו RNA/cDNA כלאיים. זה הניתנים לאימות על ידי הדמיה המכשיר ג'ל-seq לאחר ההפרדה (ראה איור 3ב). קבוצה אחת של ניסויים, מצאנו כי האספקה המעבדה של מאגר היה להיות מזוהמים עם ה-DNA, היה גורם משמעותי autoflourescence במכשיר שלנו (ראו איור 3ד'). זה היה קשה לקבוע אם ההפרדה שהתרחש. הדמיה פלורסנט עזר לנו לזהות ולפתור את הבעיה לפני השימוש בכל ריאגנטים יקר כדי ליצור רצף ספריות.
נקודה קריטית נוספת היא שלב 6.2, הגברה qPCR של cDNA לאחר ההפרדה. החוקרים צריכים לשים לב זהירה אל overamplify בשלב זה כפי שהוא יפחית את איכות הנתונים RNA-seq. שיקול זה אינו ייחודי ג'ל-seq, אך הוא היבט משותף של קלט נמוך-RNA-seq ספריית הכנה. PCR הגברה במהלך רצף ספריית הכנה הוא לעתים קרובות הכרחי, אבל זה יכול להציג רצף שגיאות של הטיות. המספר הנדרש של מחזורי עבור ה-PCR תלוי כמות הדגימה. בדרך כלל מומלץ להגביל את מספר מחזור PCR המינימום הנדרש כדי תשואה מספקת אשכולות כאשר הספריות הן וסודרו. באופן תיאורטי, ניתן למטב פרוטוקול כדי לקבוע את המספר המדויק מחזור המניבה מספר העותק מספיק ללא החדרת חפצים מוגזמת. בפועל, עם זאת, חוסר עקביות באיכות הדגימה, טעינה, או טיפול מוקדם בפרוטוקול יכול באופן דרמטי להשפיע על חלוקת מולקולרית התבניות הזמינות עבור הספרייה במכינה PCR, אשר בתורו משפיע על המספר האופטימלי של מחזור ה-PCR. הפתרון הכללי ביותר שמצאנו כדי לעקוב אחר ההתקדמות של תגובות הגברה באמצעות של הפלורסנט, להפעיל התגובות על thermocycler בזמן אמת PCR, ולהפסיק את התגובות ב המעריך (לינארית לעומת מחזור מספר) שלב. מניסיוננו, ניטור בזמן אמת היא רלבנטית במיוחד בעת פיתוח, הסתגלות או אימוץ נוהל חדש.
השלב הקריטי האחרון מייצר גנומית וספריות transcriptomic. המפתח שלב זה הוא להגדיר את הריכוז מדגם ההתחלה עבור התגובה הכנה של ספריית ה-DNA קרוב 0.2 ng/µL (ng 0.5 סה כ) ככל האפשר. זה פשוט למדי עבור cDNA qPCR הגביר בדרך כלל יש עודף של cDNA, אבל זה יכול להיות יותר מאתגר על הדגימות gDNA. . מצאנו זהיר תשומת לב לשלב vacufuge נדרשה בזמן הדגימות היו להיות מרוכז. כצפוי, בניסויים עם 1000 תאים, אפשר לשלב vacufuge לעצור הרבה מוקדם יותר מאשר ניסויים עם 100 תאים. מספר דוגמאות vacufuge השפיעו גם את קצב אידוי בניסויים שלנו. מצאנו את זה באמצעות flourometer כדי לאמת את הדנ א תוכן באמצע השלב ריכוז יכול להיות מועיל בעת ביצוע הפרוטוקול באמצעות דגימות לא מוכר. למרבה המזל, אם חוקרים מעל להתרכז לדוגמה, נוקלאז חינם מים יכול להתווסף כדי לדלל את הדגימה. תיאורטית, זה אפשרי להשתמש את vacufuge כדי לייבש את ה-DNA, אז resuspend זה באמצעי האחסון הרצוי; עם זאת, אנו ממליצים להימנע אידוי מוחלט.
אנו רואים שלוש שיטות ליצירת ספריות DNA ו- RNA בו זמנית, ג'ל-seq7, G & T-seq8ו ד ר-seq9, כמו ללא תשלום. ג'ל-seq הינו אידיאלי עבור דגימות בטווח התאים 100-1000 והוא דורש נפתחים מטרות או ידע א-פריורי של הגנום. שתי השיטות אחרים מתאימים יותר עבור יישומים תא בודד. אחת המטרות שלנו בפיתוח ג'ל-seq הייתה ליצור פרוטוקול זה יכול להיות מיושם בקלות על ידי חוקרים אחרים. לכן החלטנו לפברק התקנים בתוך מארז סטנדרטי של קלטת לזיהוי ג'ל. בעוד אנחנו המשמשת להגדרת ממברנות שונות שלנו הוא רומן, רוב מעבדות גנטיקה יש כבר את כל הציוד הנדרש כדי לפברק את המכשיר ג'ל-seq. יתר על כן, העלות של המכשיר הוא טריוויאלי - רק 5.25 $ עבור התקן זה יכול לעבד 12 דגימות. עם זאת, כמו עם כל ספריית הכנת פרוטוקול שימוש מסחרי ריאגנטים, העלות הכוללת ליצירת ספריות נותרת גבוהה. עלות ריאגנט שלנו עבור דגימה היה 50 דולר. עבור כל-תעתיק הגברה ו 28 דולר להכנה ספריית DNA ו- RNA. למרבה המזל, ההתקן ג'ל-seq עצמו הוא פרוטוקול אגנוסטיקן. לדוגמה, במהלך הפיתוח בהצלחה בדקנו את ההתקן באמצעות תאים של תרבות, של בוגרים RNA ספריית הגברה פרוטוקול19, אמנם מצאנו שזה לא מתאים דגימות רקמה של עכברים. מסתכל אל העתיד, כפי חלופות זול יותר להכנה ספריית מפותחים, פרוטוקול שלנו ניתן להתאים לעבודה עם טכניקות חדשות אלה. אנו מאמינים החוקרים תגלה את זה פשוט ליישם ג'ל-seq במעבדות שלהם. אנו מקווים שזה יקל על אימוצה המהיר של הטכנולוגיה.

הדור הבא רצף (הגדרות) יש לו השפעה עמוקה על הדרך מתנהל מחקר גנטיקה. כאשר חוקרים התמקדו פעם רצף הגנום של זן שלם, עכשיו זה אפשרי את רצף הגנום של גידול יחיד או אפילו תא בודד בניסוי אחד. 1 הגדרות גם הפכה חסכוניות כדי רצף התרשימים RNA נמצא בתוך תא, אוסף של נתונים המכונה של transcriptome. היכולת להגביר את רצף ה-DNA או RNA מדגימות התחלה קטנה הושגה רק בחמש השנים האחרונות. 2 , 3 , 4 . למרבה הצער, פרוטוקולים סטנדרטיים אינם תואמים, חוקרים עליך לבחור אם רצף ה-DNA או RNA דגימה נתון. כאשר מדגם ההתחלתי הוא גדול מספיק, ניתן לפצל אותו לשניים. קשקשים קטנים יותר, עם זאת, אובדן של חומר עקב פיצול דגימות יכולים להשפיע על איכות ספריה ולאחר איגום של דגימות יכול ממוצעים גרסאות מעניינות בין תאים. 5 יתר על כן, החוקרים מעוניינים יותר ויותר בחינת והמדגמים יכולה להתפצל, כגון תאים בודדים או ביופסיות גידול קטן הטרוגנית. 6
כדי לטפל בבעיה זו, שלושה פרוטוקולים לאחרונה פותחו כדי רצף ה-DNA ו- RNA מדגם המוצא זהה: ג'ל-seq7, G & T-seq8ו ד ר-seq9. מאמר זה מציג פרוטוקול מפורט עבור ג'ל-seq, אשר יכול לשמש כדי בו-זמנית ליצור ספריות DNA ו- RNA מתוך כמה כתאי 100 זניח עלות נוספת. ההיבט הרומן של ג'ל-seq היא היכולת להפריד בין DNA ו- RNA המבוסס באופן בלעדי על גודל באמצעות מטריצות הידרוג בעלות נמוכה. החידוש הליבה של פרוטוקול ג'ל-Seq הוא ההפרדה הפיזית של ה-DNA מ- RNA. ההפרדה הזאת מושגת electrophoretically באמצעות שילוב של ממברנות לזיהוי לנצל גודל ההבדלים בין מולקולות אלה. כדי לשים את ההבדלים בגודל בהקשר, שקול כיצד DNA ו- RNA הם צילמו: בעוד דנ א קיים בסולם מיקרון ניתן להציג באמצעות מיקרוסקופים מסורתיים, RNA קיים בסולם ננומטר ולא חייב לדימות תוך שימוש בטכניקות מורכבות כגון אלקטרונים הקפאה מיקרוסקופ. 10
הגישה הפרדת DNA ו- RNA, פרוטוקול זה מוצג באיור1. החלונית השמאלית מציגה DNA ו- RNA חינם צף בפתרון בקרבת קרום. כאשר שדה חשמלי מוחל, כפי שמוצג בלוח הימני, DNA ו- RNA לחוות כוח electrophoretic שגורם העברה דרך הקרום. על-ידי כיוונון המאפיינים ממברנה, יצרנו קרום חדיר למחצה המפריד DNA RNA. מולקולות DNA יידחפו נגד הקרום, אבל להיות מסובכת בקצה בשל גודלם גדולים. מצד שני, מולקולות RNA קטנות, ניתן להגדיר מחדש, לארוג את דרכם דרך הקרום. תהליך זה, המכונה reptation, דומה לאופן בו שנחש עובר דשא. בסופו של דבר אלה מולקולות RNA מופסקים על ידי קרום השני, בצפיפות גבוהה זה קשה מדי עבור פולימרים אפילו קטנה יותר (> 200 זוגות בסיס) להתחמק על דרך. ברגע פיזית מחוזק, DNA ו- RNA יכול להיות התאושש לעבד להפיק מידע על הגנום והן transcriptome. בעוד נוכל להפריד DNA ו- RNA, מצאנו תוצאות טובות יותר מתקבלים אם ה-RNA היא הפוכה עיבד כדי cDNA לפני ההפרדה. היברידים רבים cDNA/RNA יציבים יותר RNA לבד, עדיין יכול לעבור דרך קרום בצפיפות נמוכה.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57315/57315fig1.jpg"> איור 1 . עקרון ההפעלה ג'ל-seq. העיקרון הבסיסי המשמש להפרדת פיזית של DNA ו- RNA. בשדה חשמלי יישומית, מולקולות RNA קטנות להעביר דרך קרום בצפיפות נמוכה אבל מולקולות DNA גדולות לכוד על פני השטח. איור זה שוחזר הפניה למעורר 7, ברשות החברה המלכותית לכימיה. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57315/57315fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
מאמר זה מתאר בפירוט בשני הזיוף של המכשיר ג'ל-seq, הפרוטוקול הביולוגי ליצירת לזווג ספריות DNA ו- RNA. סקירה כללית של שניהם מוצג באיור2. המכשיר מפוברק על ידי שכבות 3 צפיפות שונה לזיהוי ג'לים אחד על גבי השני בתהליך דומה ליצירת תקן ג'לים הערימה. 11 הפרוטוקול הביולוגי מתחיל עם תאים 100-1000 הושעו ב- PBS. התאים הם lysed, הרנ א מומר cDNA לפני המכשיר משמש להפריד את הדנ א כלאיים cDNA/RNA. לאחר ההפרדה, התאוששות, גנומית, transcriptomic ספריות מוכנות באמצעות תהליך זה מקרוב כדלקמן פרוטוקול ערכת הכנה הספרייה הגנום כולו. ניתן לקרוא פרטים נוספים על פיתוח, אימות של ג'ל-seq במעבדה על פרסום שבב "ג'ל-seq: הגנום כולו ורצף transcriptome על ידי סימולטני קלט נמוך-DNA ו- RNA ספריית הכנה באמצעות מחסומים הידרוג חדיר למחצה ." 7 
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57315/57315fig2.jpg"> איור 2 . פרוטוקול ג'ל-seq. מבט כולל על הצעדים כדי לפברק את המכשיר ג'ל-seq והפרוטוקול מחוללות לזווג ספריות DNA ו- RNA. חלקים של איור זה שוחזר הפניה למעורר 7, ברשות החברה המלכותית לכימיה. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57315/57315fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
כדי ליצור ספריות DNA ו- RNA מתוך תאים בודדים, חוקרים, כדאי שתשקול להשתמש או G & T-seq או ד ר-תת סעיף. G & T-Seq, כמו ג'ל-seq, מסתמך על הפרדה פיזית של רנ א מ- DNA גנומי. גישה זו נסמכת על messenger RNA (mRNA) 3′ polyadenylated זנב כמטרה נפתחים. ה-mRNA נלכד על חרוז מגנטי באמצעות פריימר oligo-dT biotinylated. ברגע mRNA כבר נתפס החרוזים הם שנערך במקום עם מגנט, תגובת שיקוע המכיל את הדנ א הגנומי יכול להיות הוסר, הועבר צינור אחר. בתום ההפרדה הפיזית הזאת, ספריות שונות ניתן להפיק מן ה-mRNA ו DNA. 8 גישה זו פועלת היטב אם הרנ א עניין polyadenylated, אולם אין אפשרות להשתמש ללמוד תעתיקים הלא-polyadenylated, כגון ribosomal RNA, tRNA, או RNA של אאוקריוטים.
ד ר-seq מסתמך על צעד הגברה מראש לאן דנ א והן cDNA נגזר מן ה-RNA הם מוגבר בצינור אותו. המדגם ואז לשתיים, מעובד במקביל להכין ספריות seq DNA ו- RNA. כדי להבחין בין DNA גנומי של cDNA נגזר מן ה-RNA, ד ר-seq מקבלת גישה חישובית. רצפים היכן נמצאים רק exons מדוכאים שהמפתחות בנתונים דנ א גנומי, כמו אלה יכול להיות שמקורם מן ה-DNA או RNA. 9 היתרון בגישה זו הוא כי ה-DNA ו cDNA/RNA צריך להיות פיזית מופרדים זאת על ג'ל-seq ו G & T-תת סעיף. החיסרון, לעומת זאת, היא ד ר-seq דורשת ידע א-פריורי של הגנום, transcriptome (כלומר, exons לעומת אינטרונים), לא יהיה אידיאלי עבור יישומים כגון רצף של גרעינים, שבו תעתיקים רבים עדיין אינם לגמרי משולבים, עדיין להכיל אינטרונים. 12
ההיבט הרומן של ג'ל-seq היא היכולת להפריד בין DNA ו- RNA מאות תאים המבוסס באופן בלעדי על גודל. שיטה זו דורשת שום ידע אפריורי של הגנום או transcriptome, היא חזקה נגד שחבור לא שלם, אינה מוגבלת תעתיקים פולי-adenylated. עבור יישומים שבהם חוקר יכול להתחיל עם תאים לפחות 100, ג'ל-seq מספקת גישה ישירה באמצעות חומרים נרחב זמין וזול.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:905px;" width="906">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">Reagents</td>
			<td style="width:147px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:369px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">Acrylamide Monomer</td>
			<td style="width:147px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A8887-100G</td>
			<td style="width:369px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">Ammonium Persulfate</td>
			<td style="width:147px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A3678-25G</td>
			<td style="width:369px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:271px;">Ampure XP Beads</td>
			<td style="width:147px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:119px;">A63880</td>
			<td style="width:369px;">Referred to in the text as solid phase reversible immobilization (SPRI) beads</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:271px;">DNA Gel Loading Dye (6x)</td>
			<td style="width:147px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">R0611</td>
			<td style="width:369px;">Referred to in the text as 6X loading dye</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">Ethyl alcohol</td>
			<td style="width:147px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">E7023-500ML</td>
			<td style="width:369px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">KAPA SYBR FAST One-Step qRT-PCR Kits</td>
			<td style="width:147px;">Kapa BioSystems</td>
			<td style="width:119px;">7959613001</td>
			<td style="width:369px;">Referred to in the text as 2X qPCR mix</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">N,N&#8242;-Methylenebis(acrylamide)&#160;</td>
			<td style="width:147px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">146072-100G</td>
			<td style="width:369px;">Also known as bis-acrylamide</td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:271px;">NexteraXT DNA Library Preparation Kit (referred to in the text as library preparation kit)</td>
			<td style="width:147px;">Illumina</td>
			<td style="width:119px;">FC-131-1024</td>
			<td style="width:369px;">Includes: TD (referred to in the text as transposase buffer), ATM (referred to in the text as transposase), NT (referred to in the text as transposase stop buffer), and NPM (Referred to in the text as library prep PCR mix)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">Nuclease Free Water</td>
			<td style="width:147px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">3098</td>
			<td style="width:369px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">Protease</td>
			<td style="width:147px;">Qiagen</td>
			<td style="width:119px;">19155</td>
			<td style="width:369px;"></td>
		</tr>
		<tr height="189">
			<td height="189" style="height:189px;width:271px;">SMART-Seq v4 Kit (referred to in the text as whole-transcript amplification (WTA) kit)</td>
			<td style="width:147px;">Takara/Clontech</td>
			<td style="width:119px;">634888</td>
			<td style="width:369px;">Includes: Lysis buffer, RNase inhibitor, 3&#8217; SMART-Seq CDS Primer II A (referred to in the text as RT primer), 5X Ultra Low First Strand Buffer (referred to in the text as first strand buffer), SMART-Seq v4 Oligonucleotide (referred to in the text as template switch oligonucleotide (TSO)), SMART-Scribe Reverse Transcriptase (referred to in the text as reverse transcriptase), and PCR Primer II A (referred to in the text as cDNA PCR primer)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">Random hexamer with WTA adapter&#160;</td>
			<td style="width:147px;">IDT</td>
			<td style="width:119px;">n/a</td>
			<td>5&#8242;-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTAC-NNNNNN-3&#8242;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">Sucrose</td>
			<td style="width:147px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">S0389-500G</td>
			<td style="width:369px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">TEMED</td>
			<td style="width:147px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">T9281-25ML</td>
			<td style="width:369px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:271px;">DNA AWAY Surface Decontaminant</td>
			<td style="width:147px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">7010PK&#160;&#160;</td>
			<td style="width:369px;">Referred to in the text as DNA removal product</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:271px;">Tris-Borate-EDTA buffer (10X concentration)</td>
			<td style="width:147px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">T4415-1L</td>
			<td style="width:369px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:271px;">SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain (10,000X Concentrate in DMSO)</td>
			<td style="width:147px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">S11494</td>
			<td style="width:369px;">Referred to in the text as gel stain</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;"></td>
			<td style="width:147px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:369px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">Equipment</td>
			<td style="width:147px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:369px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:271px;">BD Precisionglide&#160;syringe needles, gauge 18</td>
			<td style="width:147px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">Z192554</td>
			<td style="width:369px;">Any equivalent hardware is acceptable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">Branson CPX series ultrasonic bath</td>
			<td style="width:147px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">Z769363</td>
			<td style="width:369px;">Any equivalent hardware is acceptable</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:271px;">Empty Gel Cassettes, mini, 1.0 mm</td>
			<td style="width:147px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">NC2010</td>
			<td style="width:369px;">Any equivalent hardware is acceptable</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:271px;">Mesh Filter Plate - Corning&#160;HTS Transwell 96 well permeable supports - 8.0 &#181;m pore size</td>
			<td style="width:147px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">CLS3374</td>
			<td style="width:369px;">Referred to in the text as 8 um mesh filter plate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">PowerPac HC Power Supply</td>
			<td style="width:147px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">1645052</td>
			<td style="width:369px;">Any equivalent hardware is acceptable</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:271px;">Qubit Fluorometer</td>
			<td style="width:147px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">Q33216</td>
			<td style="width:369px;">Any equivalent hardware is acceptable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">Vacufuge Concentrator</td>
			<td style="width:147px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">22822993</td>
			<td style="width:369px;">Any equivalent hardware is acceptable</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:271px;">XCell SureLock Mini-Cell system</td>
			<td style="width:147px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">EI0001</td>
			<td style="width:369px;">Any equivalent hardware is acceptable</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:271px;">Bio-Rad CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System</td>
			<td style="width:147px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">1855195&#160;</td>
			<td style="width:369px;">Any equivalent hardware is acceptable</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:271px;">Amersham UVC 500 Ultraviolet Crosslinker</td>
			<td style="width:147px;">GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td style="width:119px;">UVC500-115V</td>
			<td style="width:369px;">Discontinued, any equivalent hardware is acceptable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">Gel Doc XR+ Gel Documentation System</td>
			<td style="width:147px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">1708195</td>
			<td style="width:369px;">Referred to in the text as gel imager</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:271px;">Dark Reader Transilluminator</td>
			<td style="width:147px;">Clare Chemical Research</td>
			<td style="width:119px;">DR89</td>
			<td style="width:369px;">Referred to in the text as UV transilluminator</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">&#160;Ultrasonic&#160;Bath</td>
			<td style="width:147px;">Bransonic</td>
			<td style="width:119px;">1207K35</td>
			<td style="width:369px;">Any equivalent ultrasonic bath is acceptable.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

gel-seq: a method for simultaneous sequencing library preparation of dna and rna using hydrogel matrices

היכולת להגביר את רצף ה-DNA או RNA מדגימות התחלה קטנה הושגה רק בחמש השנים האחרונות. למרבה הצער, פרוטוקולים סטנדרטיים עבור יצירת גנומית או ספריות transcriptomic אינם תואמים, חוקרים עליך לבחור אם רצף ה-DNA או RNA מדגם מסוים. ג'ל-seq פותר בעיה זו בכך שהוא מאפשר לחוקרים בו-זמנית להתכונן ספריות הן DNA ו- RNA החל מ 100-1000 תאים באמצעות מכשיר הידרוג פשוטה. המאמר מציג גישה מפורטת על הזיוף של המכשיר, כמו גם את הפרוטוקול הביולוגי כדי ליצור ספריות לזווג. עיצבנו ג'ל-seq. כך זה יכול להיות מיושם בקלות על ידי חוקרים אחרים; מעבדות גנטיקה רבים יש כבר את כל הציוד הדרוש כדי לשחזר את ייצור המכשיר ג'ל-seq. פרוטוקול שלנו מעסיקה נפוצות ערכות עבור שניהם הגברה שלם-תעתיק (של WTA), ספריית הכנה, אשר הם גם נוטים להיות מוכר חוקרים כבר שבקיאים גנומית ושוויונית transcriptomic ספריות. הגישה שלנו מאפשר לחוקרים להביא לשאת את הכוח של רצפי DNA ו- RNA על דוגמה אחת ללא פיצול ועם זניח בתוספת מחיר.

ההפרדה הפיזית של מכוניות היברידיות gDNA הרנ"א/cDNA במכשיר ג'ל-seq להיות visualized באמצעות ג'ל פלורסנט הדמיה; תוצאה נציג מוצג באיור3. פאנל A מראה המכשיר ג'ל-seq והתחייה; הצבעים נוספה כדי להבחין בין האזורים השונים ג'ל. לוח ב' מופיע קרוב של ארבעה הפרדות שונות נעשה שימוש עבור אימות. במסלול השלישי, פקד שלילי, מייצג את הרקע ומראה שאין שום autoflourescence של הג'ל על הממשקים. אנו נטען המסלולים הראשון והשני עם ה-DNA סולמות. מסלולים אלה מראים רק להקה כהה. הממשק בין density נמוך וגבוה בקרום, חושף כי קטעים קטנים יכול לעבור דרך הג'ל בצפיפות נמוכה. הנתיב הרביעי מציג את אופן הפעולה של דגימה ביולוגית של עניין: 500 PC3 תאים. אנו נטען ליין 4 כפי שמתואר בשלב 3 של הפרוטוקול. התמונה מציגה הפרדת הדנ א cDNA/RNA כלאיים. להקה כהה בחלק העליון של קרום בצפיפות נמוכה נמצא megabase-סולם הדנ א כלאיים cDNA/RNA נערמים על הממשק של האזורים נמוך, צפיפות גבוהה. שלא כמו הסמטאות עמוסות הסולם, ישנם גם מספר להקות מתנה בתוך האזור בצפיפות גבוהה של הג'ל. אלה שברים, קטן מ- 100 bp, את המטרה מוצרים המופקים פריימר oligonucleotides במהלך שעתוק במהופך. החלונית ' C מציגה תמונת הנציגה של המכשיר ג'ל-seq כולו מניסוי יירוט מוצלח. מסלולים הנקרא RNA/cDNA עובדו עם פרוטוקול ג'ל-seq, בעוד מסלולים הנקרא RNA מציגים להפרדת רק gDNA ו- RNA. החלונית ' D מציגה ניסוי כושל עם רצועות שחורות בחלק העליון של כל ליין של קרום בצפיפות נמוכה. זה נגרם על-ידי מאגר אלקטרופורזה מזוהם עם DNA מפוצלים. בשלב זה, החוקרים צריכים לחפש את הפקדים נקי שלילי וגם שתי רצועות שחורות ברורים המעידים על המצאות של gDNA מופרדים ו RNA/cDNA כלאיים.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57315/57315fig3.jpg"> איור 3 . תוצאות פרידה ג'ל-Seq. המכשיר ג'ל-seq (א) ו תמונה פלורסנט מציג הפרדת כלאיים DNA ו RNA/cDNA (B). הצבעים נוספה להבחין בקלות רבה יותר בין האזורים השונים של צפיפות בתוך הג'ל. (C ו- D) תמונות פלורסנט נציג של המכשיר ג'ל-seq כולו מוצלח (ג), (ד) ניסוי כושל. NTC = שליטה תבנית. חלקים של איור זה שוחזר הפניה למעורר 7, ברשות החברה המלכותית לכימיה. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57315/57315fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
ברגע כלאיים DNA ו- RNA/cDNA הופרדו והשלים השארית של פרוטוקול seq ג'ל, זה אפשרי ליצור רצף ספריות. כדי לאמת את ספריות מוכן, נרוץ ניסוי אלקטרופורזה ג'ל רגיל (איור 4) או של bioanalyzer. התוצאות באיור 4 מציגות ספריות שנוצר מתוך 500 PC3 תאים ותאים הלה 750. האיור מציג את הפצות פרגמנט עבור ספריות בהתאמה המופקים ג'ל-seq (הנקראת "ג'ל") לעומת דגימות תחרות הנוצרת באמצעות פרוטוקולים סטנדרטיים (הנקראת 'צינור'). גודל המקטע עבור ג'ל-seq מופיעים בין 200 ל-800 basepairs כצפוי בעת הכנת ספריות באמצעות ערכת הכנה הספרייה הגנום כולו. אם השברים הספרייה לא מופיעות בטווח בגודל הנכון בשלב זה, הכנת ספריה נכשלה.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57315/57315fig4.jpg"> איור 4 . ספריית פרגמנט גודל השוואה. תמונת אלקטרופורזה ג'ל פלורסנט השוואת ספריית הפצה גודל בין ג'ל-seq (ג'ל) פקדים רגילים (צינור). הנתיב השמאלי מכיל סולם הדנ א מסה נמוכה עם פרגמנט בגדלים 100, 200, 400, 800, 1200 ו- 2000 basepairs. גודל המקטע עבור כל ספריות ליפול בין 200 ל-800 basepairs, כצפוי עבור ספריות מוכן עם ערכה זו. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57315/57315fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
התוקף החוקי האולטמטיבי של פרוטוקול ג'ל-seq מבוסס על הניתוח של רצף תוצאות. בחרנו PC3 תאים לניסויים שלנו אימות ', כמו תאים אלה יש ביטוי הומוגנית פרופילים המאפשרים דגימות להיות לפצל ומעובדים באמצעות ג'ל-seq והן שיטות מסורתיות; ראה איור 5. השוואה בין ה-DNA גנומי של תאים PC3 מוצג 5 דמויותA ו- 5B. איור 5 א מציגה השוואה של הגנום כולו העתק פרופילי וריאציה (CNV) מספר המופקים PC3 באמצעות ג'ל-seq או לתגובה הכנה הספרייה הגנום כולו (פקד tube). כל נקודה היא ספירה סל מנורמל רשע; פחי מוגדרים מנתונים הגנום התייחסות כזאת לכל סל יש ספירת הצפוי שווה תא דיפלואידי בריא, כלומר, קו שטוח, המייצג עותקים שווה לכל אזור של כל כרומוזומים (למעט X ו- Y) כרומוזומים. PC3 מכילה עותקים מרובים של האזורים זהה אשר יופיע כמו קוצים מעל רקע עותק מספר שתיים. ג'ל-seq התשואות פרופיל CNV איכותית דומה כמו צינור סטנדרטי התגובה. הסכם בין החלקות שני יכול להיות מוערך באופן כמותי על ידי רגרסיה ליניארית, כפי שמוצג בלוח ב' מתאם פירסון של R = 0.90 מציין כי גנומית נתונים שנאספו אחת מהשיטות מקבילה לפעולתה.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57315/57315fig5.jpg"> איור 5 . ספריית אימות. ג'ל-seq אימות עבור גנומית (A ו- B) ואת transcriptomic (C, D ו- E) הנתונים שהופקו מתאי PC3 ו הלה. פאנל A מציגה השוואה של הגנום כולו CNV פרופילים המופקים PC3 באמצעות ג'ל-seq (ג'ל-seq) או תגובה רגילה (צינור). MAPD = חציון ההבדל Pairwise מוחלטת. החלונית B היא רגרסיה ליניארית בין בשתי הדגימות בלוח A, עם R = 0.90 המציין הנתונים גנומית מקבילים. צירי הצג שסל מנורמל log2 נחשב. לוחות C ו- D להשוות נתונים transcriptomic מתאי PC3, עם כל נקודה מראה ספירה תעתיקים לכל kilobase לכל מיליון (TPM). הצירים מציגים השוואה בין שני מדגמים כמניין התעתיק log2 מנורמל. לוח ג מציגה השוואה של משכפל טכנית שנוצר באמצעות ג'ל-seq ומראה D לוח שהשוואה בין ג'ל-seq RNA-תת סעיף. לוח אלקטרוני מראה כי ג'ל-seq ניתן לפתור סוג התא מבוסס על הביטוי RNA באמצעות ניתוח גורמים ראשיים. ציר x מראה כי החשבונות גורמים ראשיים הראשון 91.6% של וריאציה בין הדגימות בזמן ציר y מראה כי החשבונות גורמים ראשיים השני רק 6.5% של השונות. חלקים של איור זה שוחזר הפניה למעורר 7, ברשות החברה המלכותית לכימיה. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57315/57315fig5large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
באופן דומה, אנחנו לעומת transcriptomic נתונים מפרוטוקול שלנו ג'ל-seq הפרוטוקול הסטנדרטי של חכמים-Seq בשפופרת. איור 5 מראה את המתאם בין שני ג'ל-seq טכני משכפל (איור 5C) ובין ג'ל-seq את השיטה הרגילה (איור 5D). כל נקודה היא ספירה של תעתיקים לכל kilobase לכל מיליון (TPM) עבור כל ג'ין שזוהו ב- TPM > 5 ב שני נתונים (datasets). Regressions לינארי מוצגים כקווים אדומים, מקדם המתאם פירסון מוצג בפינה השמאלית העליונה. משכפל טכני של ג'ל-seq מסכים (R ∼ 0.8), אבל פחות טוב בהתאמה השיטה הרגילה (R < 0.7). הדבר מצביע על ג'ל-seq מציגה דעה קדומה של ג'ין ספירות. למרבה המזל, הנטיה הזו היא שיטתית ו, כפי שניתן לראות על ידי ניתוח גורמים ראשיים איור 5E, בעל משמעות מסקנות עדיין ניתן להסיק בין דגימות ביולוגיות שונות.

Watch this Scientific Journal Video about Gel-seq: A Method for Simultaneous Sequencing Library Preparation of DNA and RNA Using Hydrogel Matrices at JoVE.com

Gel-seq: A Method for Simultaneous Sequencing Library Preparation of DNA and RNA Using Hydrogel Matrices

ג'ל-seq מאפשר חוקרים להכין בו זמנית ספריות עבור שניהם הדנ א - ו RNA-seq זניח עלות נוספת החל מ- 100-1000 תאים באמצעות מכשיר הידרוג פשוטה. המאמר מציג גישה מפורטת על הזיוף של המכשיר, כמו גם את הפרוטוקול הביולוגי כדי ליצור ספריות לזווג.

ג'ל-seq: שיטת הכנת ספריה סימולטני רצף DNA ו- RNA באמצעות מטריצות הידרוג

The ability to amplify and sequence either DNA or RNA from small starting samples has only been achieved in the last five years. Unfortunately, the ...

gel-seq-method-for-simultaneous-sequencing-library-preparation-dna

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Bioengineering

8.9K Views.  University of San Diego. ג'ל-seq מאפשר חוקרים להכין בו זמנית ספריות עבור שניהם הדנ א - ו RNA-seq זניח עלות נוספת החל מ- 100-1000 תאים באמצעות מכשיר הידרוג פשוטה. המאמר מציג גישה מפורטת על הזיוף של המכשיר, כמו גם את הפרוטוקול הביולוגי כדי ליצור ספריות לזווג.

Video: Gel-seq: A Method for Simultaneous Sequencing Library Preparation of DNA and RNA Using Hydrogel Matrices

Preparation of Complaint Matrices for Quantifying Cellular Contraction

The regulation of cellular adhesion to the extracellular matrix (ECM) is essential for cell migration and ECM remodeling. Focal adhesions are macromolecular assemblies that couple the contractile F-actin cytoskeleton to the ECM. This connection allows for the transmission of intracellular mechanical forces across the cell membrane to the underlying substrate. Recent work has shown the mechanical properties of the ECM regulate focal adhesion and F-actin morphology as well as numerous physiological processes, including cell differentiation, division, proliferation and migration. Thus, the use of cell culture substrates has become an increasingly prevalent method to precisely control and modulate ECM mechanical properties.
To quantify traction forces at focal adhesions in an adherent cell, compliant substrates are used in conjunction with high-resolution imaging and computational techniques in a method termed traction force microscopy (TFM). This technique relies on measurements of the local magnitude and direction of substrate deformations induced by cellular contraction. In combination with high-resolution fluorescence microscopy of fluorescently tagged proteins, it is possible to correlate cytoskeletal organization and remodeling with traction forces.
Here we present a detailed experimental protocol for the preparation of two-dimensional, compliant matrices for the purpose of creating a cell culture substrate with a well-characterized, tunable mechanical stiffness, which is suitable for measuring cellular contraction. These protocols include the fabrication of polyacrylamide hydrogels, coating of ECM proteins on such gels, plating cells on gels, and high-resolution confocal microscopy using a perfusion chamber. Additionally, we provide a representative sample of data demonstrating location and magnitude of cellular forces using cited TFM protocols.

In this video, we demonstrate the experimental techniques used to fabricate compliant, extracellular matrix (ECM) coated substrates suitable for cell culture, and which are amenable to traction force microscopy and observing effects of ECM stiffness on cell behavior.

הכנת מטריצות תלונה לכימות התכווצות נייד

The regulation of cellular adhesion to the extracellular matrix (ECM) is essential for cell migration and ECM remodeling.  Focal adhesions are ...

Constant Pressure-controlled Extrusion Method for the Preparation of Nano-sized Lipid Vesicles

Liposomes are artificially prepared vesicles consisting of natural and synthetic phospholipids that are widely used as a cell membrane mimicking platform to study protein-protein and protein-lipid interactions3, monitor drug delivery4,5, and encapsulation4. Phospholipids naturally create curved lipid bilayers, distinguishing itself from a micelle.6 Liposomes are traditionally classified by size and number of bilayers, i.e. large unilamellar vesicles (LUVs), small unilamellar vesicles (SUVs) and multilamellar vesicles (MLVs)7. In particular, the preparation of homogeneous liposomes of various sizes is important for studying membrane curvature that plays a vital role in cell signaling, endo- and exocytosis, membrane fusion, and protein trafficking8. Several groups analyze how proteins are used to modulate processes that involve membrane curvature and thus prepare liposomes of diameters &lt;100 - 400 nm to study their behavior on cell functions3. Others focus on liposome-drug encapsulation, studying liposomes as vehicles to carry and deliver a drug of interest9. Drug encapsulation can be achieved as reported during liposome formation9. Our extrusion step should not affect the encapsulated drug for two reasons, i.e. (1) drug encapsulation should be achieved prior to this step and (2) liposomes should retain their natural biophysical stability, securely carrying the drug in the aqueous core. These research goals further suggest the need for an optimized method to design stable sub-micron lipid vesicles.
Nonetheless, the current liposome preparation technologies (sonication10, freeze-and-thaw10, sedimentation) do not allow preparation of liposomes with highly curved surface (i.e. diameter &lt;100 nm) with high consistency and efficiency10,5, which limits the biophysical studies of an emerging field of membrane curvature sensing. Herein, we present a robust preparation method for a variety of biologically relevant liposomes.
Manual extrusion using gas-tight syringes and polycarbonate membranes10,5 is a common practice but heterogeneity is often observed when using pore sizes &lt;100 nm due to due to variability of manual pressure applied. We employed a constant pressure-controlled extrusion apparatus to prepare synthetic liposomes whose diameters range between 30 and 400 nm. Dynamic light scattering (DLS)10, electron microscopy11 and nanoparticle tracking analysis (NTA)12 were used to quantify the liposome sizes as described in our protocol, with commercial polystyrene (PS) beads used as a calibration standard. A near linear correlation was observed between the employed pore sizes and the experimentally determined liposomes, indicating high fidelity of our pressure-controlled liposome preparation method. Further, we have shown that this lipid vesicle preparation method is generally applicable, independent of various liposome sizes. Lastly, we have also demonstrated in a time course study that these prepared liposomes were stable for up to 16 hours. A representative nano-sized liposome preparation protocol is demonstrated below.

This protocol describes an extrusion method for preparing lipid vesicles of sub-micron sizes with a high degree of homogeneity. This method uses a pressure-controlled system with controlled nitrogen flow rates for liposome preparation. The lipid preparation1,2, liposome extrusion, and size characterization will be presented herein.

שחול קבוע לחץ שבשליטת שיטה להכנת בגודל ננו שלפוחית ​​שומנים

Liposomes are artificially prepared vesicles consisting of natural and synthetic phospholipids that are widely used as a cell membrane mimicking platform ...

An Improved Method for the Preparation of Type I Collagen From Skin

Soluble type 1 collagen (COL1) is used extensively as an adhesive substrate for cell cultures and as a cellular scaffold for regenerative applications. Clinically, this protein is widely used for cosmetic surgery, dermal injections, bone grafting, and reconstructive surgery. The sources of COL1 for these procedures are commonly nonhuman, which increases the potential for inflammation and rejection as well as xenobiotic disease transmission. In view of this, a method to efficiently and quickly purify COL1 from limited quantities of autologously-derived tissues would circumvent many of these issues; however, standard isolation protocols are lengthy and often require large quantities of collagenous tissues. Here, we demonstrate an efficient COL1 extraction method that reduces the time needed to isolate and purify this protein from about 10 days to less than 3 hr. We chose the dermis as our tissue source because of its availability during many surgical procedures. This method uses traditional extraction buffers combined with forceful agitation and centrifugal filtration to obtain highly-pure, soluble COL1 from small amounts of corium. Briefly, dermal biopsies are washed thoroughly in ice-cold dH2O after removing fat, connective tissue, and hair. The skin samples are stripped of noncollagenous proteins and polysaccharides using 0.5 M sodium acetate and a high speed bench-top homogenizer. Collagen from residual solids is subsequently extracted with a 0.075 M sodium citrate buffer using the homogenizer. These extracts are purified using 100,000 MW cut-off centrifugal filters that yield COL1 preparations of comparable or superior quality to commercial products or those obtained using traditional procedures. We anticipate this method will facilitate the utilization of autologously-derived COL1 for a multitude of research and clinical applications.

Traditional procedures for the isolation of soluble type 1 collagen (COL1) require about 10 days from start to finish because of lengthy buffer incubations and laborious resuspensions of fibrils. Here, we describe a means to purify COL1 from small dermal biopsies in less than 3 hr.

שיטה משופרת להכנת סוג I קולגן מעור

Soluble type 1 collagen (COL1) is used extensively as an adhesive substrate for cell cultures and as a cellular scaffold for regenerative applications. ...

Synthesis of an Intein-mediated Artificial Protein Hydrogel

We present the synthesis of a highly stable protein hydrogel mediated by a split-intein-catalyzed protein trans-splicing reaction. The building blocks of this hydrogel are two protein block-copolymers each containing a subunit of a trimeric protein that serves as a crosslinker and one half of a split intein. A highly hydrophilic random coil is inserted into one of the block-copolymers for water retention. Mixing of the two protein block copolymers triggers an intein trans-splicing reaction, yielding a polypeptide unit with crosslinkers at either end that rapidly self-assembles into a hydrogel. This hydrogel is very stable under both acidic and basic conditions, at temperatures up to 50 &#176;C, and in organic solvents. The hydrogel rapidly reforms after shear-induced rupture. Incorporation of a &#34;docking station peptide&#34; into the hydrogel building block enables convenient incorporation of &#34;docking protein&#34;-tagged target proteins. The hydrogel is compatible with tissue culture growth media, supports the diffusion of 20 kDa molecules, and enables the immobilization of bioactive globular proteins. The application of the intein-mediated protein hydrogel as an organic-solvent-compatible biocatalyst was demonstrated by encapsulating the horseradish peroxidase enzyme and corroborating its activity.

We present the synthesis of a split-intein-mediated protein hydrogel. The building blocks of this hydrogel are two protein copolymers each containing a subunit of a trimeric protein that serves as a crosslinker and one half of a split intein. Mixing of the two protein copolymers triggers an intein trans-splicing reaction, yielding a polypeptide unit that self-assembles into a hydrogel. This hydrogel is highly pH- and temperature-stable, compatible with organic solvents, and easily incorporates functional globular proteins.

סינתזה של חלבון מלאכותי בתיווך intein Hydrogel

We present the synthesis of a highly stable protein hydrogel mediated by a split-intein-catalyzed protein trans-splicing reaction. The building blocks of ...

Hydrogel Nanoparticle Harvesting of Plasma or Urine for Detecting Low Abundance Proteins

Novel biomarker discovery plays a crucial role in providing more sensitive and specific disease detection. Unfortunately many low-abundance biomarkers that exist in biological fluids cannot be easily detected with mass spectrometry or immunoassays because they are present in very low concentration, are labile, and are often masked by high-abundance proteins such as albumin or immunoglobulin. Bait containing poly(N-isopropylacrylamide) (NIPAm) based nanoparticles are able to overcome these physiological barriers. In one step they are able to capture, concentrate and preserve biomarkers from body fluids. Low-molecular weight analytes enter the core of the nanoparticle and are captured by different organic chemical dyes, which act as high affinity protein baits. The nanoparticles are able to concentrate the proteins of interest by several orders of magnitude. This concentration factor is sufficient to increase the protein level such that the proteins are within the detection limit of current mass spectrometers, western blotting, and immunoassays. Nanoparticles can be incubated with a plethora of biological fluids and they are able to greatly enrich the concentration of low-molecular weight proteins and peptides while excluding albumin and other high-molecular weight proteins. Our data show that a 10,000 fold amplification in the concentration of a particular analyte can be achieved, enabling mass spectrometry and immunoassays to detect previously undetectable biomarkers.

Several pathological biomarkers cannot be easily detected by current techniques because of their low concentration in biological fluids, the presence of degrading enzymes, and large amounts of high molecular weight proteins. Chemically functionalized hydrogel nanoparticles can harvest, preserve and concentrate low abundance proteins enabling the detection of previously undetectable biomarkers.

הידרוג&#39;ל Nanoparticle קציר של פלזמה או שתן לגילוי חלבונים שפע נמוך

Novel biomarker discovery plays a crucial role in providing more sensitive and specific disease detection. Unfortunately many low-abundance biomarkers ...

Bioprinting Cellularized Constructs Using a Tissue-specific Hydrogel Bioink

Bioprinting has emerged as a versatile biofabrication approach for creating tissue engineered organ constructs. These constructs have potential use as organ replacements for implantation in patients, and also, when created on a smaller size scale as model "organoids" that can be used in in vitro systems for drug and toxicology screening.
Despite development of a wide variety of bioprinting devices, application of bioprinting technology can be limited by the availability of materials that both expedite bioprinting procedures and support cell viability and function by providing tissue-specific cues. Here we describe a versatile hyaluronic acid (HA) and gelatin-based hydrogel system comprised of a multi-crosslinker, 2-stage crosslinking protocol, which can provide tissue specific biochemical signals and mimic the mechanical properties of in vivo tissues. 
Biochemical factors are provided by incorporating tissue-derived extracellular matrix materials, which include potent growth factors. Tissue mechanical properties are controlled combinations of PEG-based crosslinkers with varying molecular weights, geometries (linear or multi-arm), and functional groups to yield extrudable bioinks and final construct shear stiffness values over a wide range (100 Pa to 20 kPa). Using these parameters, hydrogel bioinks were used to bioprint primary liver spheroids in a liver-specific bioink to create in vitro liver constructs with high cell viability and measurable functional albumin and urea output. This methodology provides a general framework that can be adapted for future customization of hydrogels for biofabrication of a wide range of tissue construct types.

We describe a set of protocols that together provide a tissue-mimicking hydrogel bioink with which functional and viable 3-D tissue constructs can be bioprinted for use in in vitro screening applications.

Bioprinting Cellularized בונה בעזרת רקמות ספציפיות הידרוג&#39;ל Bioink

Bioprinting has emerged as a versatile biofabrication approach for creating tissue engineered organ constructs. These constructs have potential use as ...

Fabricating a Kidney Cortex Extracellular Matrix-Derived Hydrogel

Extracellular matrix (ECM) provides important biophysical and biochemical cues to maintain tissue homeostasis. Current synthetic hydrogels offer robust mechanical support for in vitro cell culture but lack the necessary protein and ligand composition to elicit physiological behavior from cells. This manuscript describes a fabrication method for a kidney cortex ECM-derived hydrogel with proper mechanical robustness and supportive biochemical composition. The hydrogel is fabricated by mechanically homogenizing and solubilizing decellularized human kidney cortex ECM. The matrix preserves native kidney cortex ECM protein ratios while also enabling gelation to physiological mechanical stiffnesses. The hydrogel serves as a substrate upon which kidney cortex-derived cells can be maintained under physiological conditions. Furthermore, the hydrogel composition can be manipulated to model a diseased environment which enables the future study of kidney diseases.

Here we present a protocol to fabricate a kidney cortex extracellular matrix-derived hydrogel to retain the native kidney extracellular matrix (ECM) structural and biochemical composition. The fabrication process and its applications are described. Finally, a perspective on using this hydrogel to support kidney-specific cellular and tissue regeneration and bioengineering is discussed.

בדיית כליות קורטקס חוץ-תאית מטריקס-Derived הידרוג

Extracellular matrix (ECM) provides important biophysical and biochemical cues to maintain tissue homeostasis. Current synthetic hydrogels offer robust ...

Ultra-long Read Sequencing for Whole Genomic DNA Analysis

Third generation single-molecule DNA sequencing technologies offer significantly longer read length that can facilitate the assembly of complex genomes and analysis of complex structural variants. Nanopore platforms perform single-molecule sequencing by directly measuring the current changes mediated by DNA passage through the pores and can generate hundreds of kilobase (kb) reads with minimal capital cost. This platform has been adopted by many researchers for a variety of applications. Achieving longer sequencing read lengths is the most critical factor to leverage the value of nanopore sequencing platforms. To generate ultra-long reads, special consideration is required to avoid DNA breakages and gain efficiency to generate productive sequencing templates. Here, we provide the detailed protocol of ultra-long DNA sequencing including high molecular weight (HMW) DNA extraction from fresh or frozen cells, library construction by mechanical shearing or transposase fragmentation, and sequencing on a nanopore device. From 20-25 &#181;g of HMW DNA, the method can achieve N50 read length of 50-70 kb with mechanical shearing and N50 of 90-100 kb read length with transposase mediated fragmentation. The protocol can be applied to DNA extracted from mammalian cells to perform whole genome sequencing for the detection of structural variants and genome assembly. Additional improvements on the DNA extraction and enzymatic reactions will further increase the read length and expand its utility.

Long-read sequences greatly facilitate the assembly of complex genomes and characterization of structural variation. We describe a method to generate ultra-long sequences by nanopore-based sequencing platforms. The approach adopts an optimized DNA extraction followed by modified library preparations to generate hundreds of kilobase reads with moderate coverage from human cells.

רצף קריאה ארוכים במיוחד עבור ניתוח הדנ א הגנומי לגמרי

Third generation single-molecule DNA sequencing technologies offer significantly longer read length that can facilitate the assembly of complex genomes ...

High Throughput Yeast Strain Phenotyping with Droplet-Based RNA Sequencing

The powerful tools available to edit yeast genomes have made this microbe a valuable platform for engineering. While it is now possible to construct libraries of millions of genetically distinct strains, screening for a desired phenotype remains a significant obstacle. With existing screening techniques, there is a tradeoff between information output and throughput, with high-throughput screening typically being performed on one product of interest. Therefore, we present an approach to accelerate strain screening by adapting single cell RNA sequencing to isogenic picoliter colonies of genetically engineered yeast strains. To address the unique challenges of performing RNA sequencing on yeast cells, we culture isogenic yeast colonies within hydrogels and spheroplast prior to performing RNA sequencing. The RNA sequencing data can be used to infer yeast phenotypes and sort out engineered pathways. The scalability of our method addresses a critical obstruction in microbial engineering.

A bottleneck in the &#8216;design-build-test&#8217; cycle of microbial engineering is the speed at which we can perform functional screens of strains. We describe a high-throughput method for strain screening applied to hundreds to thousands of yeast cells per experiment that utilizes droplet-based RNA sequencing.

תפוקה גבוהה שמרים להתאמץ פנוטיפים עם רצפי רנ א מבוססי Droplet

The powerful tools available to edit yeast genomes have made this microbe a valuable platform for engineering. While it is now possible to construct ...

Simultaneous Quantification of Selected Kynurenines Analyzed by Liquid Chromatography-Mass Spectrometry in Medium Collected from Cancer Cell Cultures

The kynurenine pathway and the tryptophan catabolites called kynurenines have received increased attention for their involvement in immune regulation and cancer biology. An in vitro cell culture assay is often used to learn about the contribution of different tryptophan catabolites in a disease mechanism and for testing therapeutic strategies. Cell culture medium that is rich in secreted metabolites and signaling molecules reflects the status of tryptophan metabolism and other cellular events. New protocols for the reliable quantification of multiple kynurenines in the complex cell culture medium are desired to allow for a reliable and quick analysis of multiple samples. This can be accomplished with liquid chromatography coupled with mass spectrometry. This powerful technique is employed in many clinical and research laboratories for the quantification of metabolites and can be used for measuring kynurenines.
Presented here is the use of liquid chromatography coupled with single quadrupole mass spectrometry (LC-SQ) for the simultaneous determination of four kynurenines, i.e., kynurenine, 3-hydroxykynurenine, 3-hydroxyanthranilic, and xanthurenic acid in the medium collected from in vitro cultured cancer cells. SQ detector is simple to use and less expensive compared to other mass spectrometers. In the SQ-MS analysis, multiple ions from the sample are generated and separated according to their specific mass-to-charge ratio (m/z), followed by the detection using a Single Ion Monitoring (SIM) mode.
This paper draws the attention on the advantages of the reported method and indicates some weak points. It is focused on critical elements of LC-SQ analysis including sample preparation along with chromatography and mass spectrometry analysis. The quality control, method calibration conditions and matrix effect issues are also discussed. We described a simple application of 3-nitrotyrosine as one analog standard for all target analytes. As confirmed by experiments with human ovary and breast cancer cells, the proposed LC-SQ method&#160;generates reliable results and can be further applied to other in vitro cellular models.

Described here is a protocol for the determination of four different tryptophan metabolites generated in the kynurenine pathway (kynurenine, 3-hydroxykynurenine, xanthurenic acid, 3-hydroxyanthranilic acid) in the medium collected from cancer cell cultures analyzed by liquid chromatography coupled with a single quadrupole mass spectrometry.

כימות בו זמני של קינורנינים נבחרים שנותחו על ידי ספקטרומטריית כרומטוגרפיה-מסה נוזלית במדיום שנאסף מתרביות תאים סרטניים

The kynurenine pathway and the tryptophan catabolites called kynurenines have received increased attention for their involvement in immune regulation and ...