Finanziamenti per questo lavoro è stato indicato dall'Università di San Diego, la National Science Foundation Graduate Research Fellowship programma, NIH concede R01-HG007836 e dal ministero coreano della scienza, ICT e pianificazione del futuro.
Versioni precedenti di un parecchie figure furono pubblicate dapprima nel "Hoople, D. G. et al. Gel-seq: intero genoma e sequenziamento del trascrittoma di basso input del DNA e RNA libreria preparazione simultanea utilizzando barriere idrogel semi-permeabile. Laboratorio su un Chip 17, 2619-2630, doi:10.1039 / c7lc00430c (2017). " Laboratorio su un Chip ha sancito il riutilizzo delle figure in questa pubblicazione.

<ol>
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KZ è co-fondatore e consulente scientifico di Singlera Genomics Inc

Ci sono diversi passaggi critici connessi con la fabbricazione di dispositivi di Gel-seq, nonché il protocollo stesso. Durante la produzione, si consiglia di iniziare con gli spessori di strato prescritti per le varie regioni del gel. Abbiamo trascorso un tempo significativo fabbricazione differenti opzioni di test e il protocollo descritto qui produce i migliori dispositivi per le cassette elencati nella tabella materiali e reagenti. Se i ricercatori usano un sistema alternativo di cassetta, trovino necessario modificare i volumi utilizzati durante la creazione di dispositivi. La sfida principale nella fabbricazione è che se la regione di gel ad alta densità è troppo grande può delaminare dai bordi della cassetta e creare sacche d'aria all'interno della cassetta che altererà l'elettroforesi. Eseguendo il cast di numerose cassette con diversi volumi di livello diverso, i ricercatori dovrebbero essere in grado di determinare rapidamente la configurazione ottimale per il loro hardware specifico.
Il protocollo di Gel-seq ha anche diversi passaggi critici che possono essere convalidati prima che il protocollo sia completo. Un potenziale punto di errore è la separazione di gDNA e ibridi RNA/cDNA. Questo può essere convalidato mediante il dispositivo di Gel-seq di imaging dopo la separazione (vedere Figura 3B). In una serie di esperimenti, abbiamo trovato che il nostro approvvigionamento di laboratorio del buffer aveva contaminato con DNA e stava causando notevole autoflourescence nel nostro dispositivo (Vedi Figura 3D). Questo rendeva difficile determinare se la separazione aveva avvenuto. Formazione immagine fluorescente ci ha aiutato a identificare e risolvere il problema prima di utilizzare qualsiasi reagenti costosi per generare librerie di sequenziamento.
Un altro punto critico è passo 6.2, la qPCR l'amplificazione del cDNA dopo la separazione. I ricercatori devono prestare particolare attenzione a non overamplify in questo passaggio in quanto consentirà di ridurre la qualità dei dati RNA-seq. Questa considerazione non è univoco per Gel-seq, ma è un aspetto comune della preparazione libreria di basso input RNA-seq. L'amplificazione di PCR durante la sequenziazione preparazione libreria è spesso necessario, ma può introdurre distorsioni ed errori di sequenza. Il numero di cicli per la PCR dipende dalla complessità e quantità di campione. È generalmente consigliabile limitare il numero di cicli PCR al minimo necessario per produrre sufficiente clustering quando le librerie sono in sequenza. In teoria, un protocollo può essere ottimizzato per determinare il numero esatto ciclo che produce sufficiente numero di copia senza introdurre artefatti eccessivi. In pratica, tuttavia, incoerenze in qualità di campionamento, caricamento o al trattamento precoce nel protocollo possa influenzare notevolmente la distribuzione dei modelli molecolari disponibili per prep biblioteca PCR, che a sua volta influenza il numero ottimale di ciclo di PCR. La soluzione più generale abbiamo trovato per monitorare l'avanzamento delle reazioni di amplificazione utilizzando un colorante fluorescente, eseguire le reazioni in un termociclatore PCR in tempo reale e interrompere le reazioni all'esponenziale (lineare rispetto al numero di cicli) fase. Nella nostra esperienza, il monitoraggio in tempo reale è particolarmente rilevante quando in via di sviluppo, adattamento o l'adozione di un nuovo protocollo.
L'ultimo passaggio critico sta generando genomica e trascrittomica librerie. La chiave di questo passaggio consiste nell'impostare la concentrazione del campione iniziale per la reazione di preparazione libreria di DNA più vicino a 0,2 ng / µ l (totale 0,5 ng) come possibile. Questo è relativamente semplice per il cDNA di qPCR amplificato come di solito c'è un eccesso di cDNA, ma può essere più impegnativo per i campioni di gDNA. Abbiamo trovato attenzione attenzione per il passo di vacufuge è stato richiesto, mentre i campioni sono stati essere concentrati. Come previsto, in esperimenti con cellule di 1000, il passo di vacufuge potrebbe essere interrotto molto prima di quanto gli esperimenti con 100 cellule. Il numero di campioni nella vacufuge ha anche influenzato il tasso di evaporazione nei nostri esperimenti. Abbiamo scoperto che utilizzando un flourometer per convalidare il DNA contenuto midway attraverso il passo di concentrazione potrebbe essere utile quando si esegue il protocollo con campioni sconosciuti. Fortunatamente, se i ricercatori sopra concentrato un campione, nucleasi gratis acqua può essere aggiunto per diluire il campione. Teoricamente, è possibile utilizzare il vacufuge per asciugare il DNA e quindi esso risospendere nel volume desiderato; Tuttavia, si consiglia di evitare la completa evaporazione.
Consideriamo i tre metodi correnti per la generazione di librerie simultanee di DNA e RNA, Gel-seq7, G & T-seq8e DR-seq9, come omaggio. Gel-seq è ideale per campioni nell'intervallo di celle di 100-1000 e non richiede alcuna discesa obiettivi o la conoscenza a priori del genoma. Gli altri due metodi sono più adatti per applicazioni a singola cella. Uno dei nostri obiettivi nello sviluppo di Gel-seq era quello di creare un protocollo che poteva essere facilmente implementato da altri ricercatori. Abbiamo pertanto deciso di fabbricare dispositivi entro il fattore di forma standard di un vassoio del gel di poliacrilammide. Mentre la tecnica che abbiamo usato per definire le nostre diverse membrane è romanzo, maggior parte dei laboratori di genetica già tutta l'attrezzatura necessaria per fabbricare il dispositivo Gel-seq. Inoltre, il costo del dispositivo è banale - solo $5,25 per un dispositivo in grado di elaborare 12 campioni. Detto questo, come con qualsiasi protocollo di preparazione libreria utilizzando reagenti commerciali, il costo complessivo per la generazione di librerie rimane alto. Il nostro costo di reagente per esempio era $50 per l'intero-trascrizione amplificazione e $28 per la preparazione di libreria per RNA e DNA. Fortunatamente, il dispositivo Gel-seq è indipendente dal protocollo. Ad esempio, durante lo sviluppo abbiamo testato con successo il dispositivo utilizzando cellule di cultura e di un più vecchio RNA biblioteca amplificazione protocollo19, anche se abbiamo trovato che non era adatto per campioni di tessuto dai topi. Guardando al futuro, come alternative più economiche per la preparazione di libreria sono sviluppate, il nostro protocollo possa essere adattato per funzionare con queste nuove tecniche. Crediamo che i ricercatori potranno reperire semplici da implementare Gel-seq nei propri laboratori. Speriamo che questo faciliterà la rapida adozione della tecnologia.

Prossima generazione sequenziamento (NGS) ha avuto un profondo impatto sulla strada la ricerca genetica è condotta. Dove i ricercatori una volta concentrata sul sequenziamento del genoma di un'intera specie, ora è possibile sequenziare il genoma di un singolo tumore o anche una singola cella in un esperimento. 1 NGS ha anche reso conveniente per sequenziare i trascritti di RNA trovati all'interno di una cella, un insieme di dati noto come il trascrittoma. La capacità di amplificare e sequenza di DNA o RNA da piccoli campioni di partenza è stato raggiunto solo negli ultimi cinque anni. 2 , 3 , 4 purtroppo, protocolli standard sono incompatibili e i ricercatori devono decidere di sequenza di DNA o RNA per un dato campione. Quando un campione di partenza è abbastanza grande, può essere diviso a metà. Alle scale più piccole, tuttavia, perdita di materiale dovuto spaccare campioni può influire sulla qualità di biblioteca e pool di campioni possono media di interessanti variazioni fra le cellule. 5 inoltre, i ricercatori sono sempre più interessati ad esaminare i campioni che non possono essere suddivisi, come cellule singole o biopsie di piccolo tumore eterogeneo. 6
Per risolvere questo problema, tre protocolli sono stati recentemente sviluppati per RNA e DNA di sequenza dallo stesso campione iniziale: Gel-seq7, G & T-seq8e DR-seq9. Questo articolo presenta un protocollo dettagliato per Gel-seq, che può essere utilizzato per generare simultaneamente librerie di DNA e RNA da poco più di 100 celle a costi trascurabili aggiunto. L'aspetto di novità di Gel-seq è la capacità di separare DNA e RNA basata esclusivamente sulla dimensione utilizzando matrici di idrogel di basso costo. L'innovazione di nucleo del protocollo Gel-Seq è la separazione fisica del DNA da RNA. Questa separazione si ottiene elettroforeticamente utilizzando una combinazione di membrane di poliacrilammide che sfruttano le differenze di dimensioni tra queste molecole. Per mettere queste differenze di dimensione nel contesto, considera come DNA e RNA sono Imaging: mentre DNA esiste sulla micron-scala e possa essere visualizzato utilizzando microscopi tradizionali, RNA esiste su scala nanometrica e deve essere imaged utilizzando tecniche complesse come la cryo-elettrone microscopia. 10
L'approccio alla separazione del DNA e RNA in questo protocollo è illustrato nella Figura 1. Il pannello di sinistra mostra DNA e RNA gratis galleggianti in soluzione nei pressi di una membrana. Quando viene applicato un campo elettrico, come mostrato nel pannello di destra, DNA e RNA esperienza una forza elettroforetica che induce la migrazione attraverso la membrana. Regolando le proprietà della membrana, abbiamo creato una membrana semipermeabile che separa il DNA dal RNA. Le molecole di DNA vengono spinte contro la membrana, ma rimanere impigliate ai margini a causa delle loro grandi dimensioni. Piccole molecole di RNA, d'altra parte, possono riconfigurare e tessere la loro strada attraverso la membrana. Questo processo, noto come reptation, è simile a quello di che un serpente si muove attraverso l'erba. Alla fine queste molecole di RNA vengono fermate da una seconda membrana ad alta densità che è troppo difficile per i polimeri ancora più piccoli (> 200 paia di basi) a divincolarsi attraverso. Una volta fisicamente separato, DNA e RNA possono essere recuperati ed elaborati per generare informazioni sul genoma e il trascrittoma. Mentre possiamo separare DNA e RNA, abbiamo trovato risultati migliori si ottengono se il RNA è inverso trascritto in cDNA prima della separazione. Gli ibridi di cDNA/RNA sono più stabili di RNA da solo e possono ancora passare attraverso la membrana a bassa densità.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57315/57315fig1.jpg"> Figura 1 . Principio di funzionamento del gel-seq. Il principio sottostante utilizzato per separare fisicamente il DNA e RNA. In un campo elettrico applicato, piccole molecole di RNA migrano attraverso la membrana a bassa densità ma grandi molecole di DNA sono intrappolati sulla superficie. Questa figura è stata riprodotta da Ref. 7 con il permesso della Royal Society of Chemistry. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57315/57315fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Questo articolo descrive in dettaglio sia la fabbricazione del dispositivo Gel-seq e accoppiato il protocollo biologico per generare librerie di DNA e RNA. Una panoramica di entrambi è illustrata nella Figura 2. Il dispositivo è fabbricato da stratificazione tre differenti densità gel di poliacrilammide in cima a vicenda in un processo simile alla creazione di standard gel d'impilamento. 11 il protocollo biologico inizia con 100-1000 cellule sospese in PBS. Le cellule sono lisate e il RNA viene convertito in cDNA prima che il dispositivo viene utilizzato per separare il DNA genomico da ibridi cDNA/RNA. Dopo la separazione e recupero, genomica e trascrittomica librerie vengono preparate utilizzando un processo che segue da vicino il protocollo di kit di preparazione libreria standard intero genoma. Ulteriori dettagli sullo sviluppo e la convalida di Gel-seq possono essere letto in laboratorio su una pubblicazione di Chip "Gel-seq: intero genoma e sequenziamento del trascrittoma di basso input del DNA e RNA libreria preparazione simultanea utilizzando barriere semipermeabile idrogel ." 7 
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57315/57315fig2.jpg"> Figura 2 . Protocollo di gel-seq. Una panoramica dei passaggi per fabbricare il dispositivo Gel-seq e il protocollo generare coppia librerie di DNA e RNA. Porzioni di questa figura sono state riprodotte da Ref. 7 con il permesso della Royal Society of Chemistry. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57315/57315fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Per generare le librerie di DNA e RNA da cellule singole, i ricercatori dovrebbero considerare l'utilizzo di G & T-seq o DR-segg. G & T-Seq, come Gel-seq, si basa su una separazione fisica di RNA dal DNA genomico. Questo approccio si basa sul RNA messaggero (mRNA) 3 ′ poliadenilazione coda come una menu a discesa destinazione. il mRNA viene catturato il magnetic beads utilizzando un primer oligo-dT biotinilato. Una volta che il mRNA è stato catturato le perline sono tenute in posizione da un magnete e il supernatante contenente il DNA genomico può essere rimosso e trasferito in un'altra provetta. Dopo aver completata questa separazione fisica, librerie separate possono essere generate dal mRNA e DNA. 8 questo approccio funziona bene se il RNA di interesse è poliadenilazione, tuttavia non può essere utilizzato per studiare le trascrizioni non poliadenilazione, come RNA ribosomiale, tRNA o RNA da procarioti.
DR-seq si basa su un passaggio di pre-amplificazione dove sono amplificati sia DNA e cDNA derivate da RNA nello stesso tubo. Il campione è quindi diviso in due ed elaborato in parallelo per preparare librerie di DNA e RNA-seq. Per distinguere tra il DNA di genomic e il cDNA derivate da RNA, DR-seq adotta un approccio computazionale. Sequenze dove sono presenti solo esoni informaticamente vengono soppressi nei dati di DNA genomici, come quelli potrebbe avere avuto origine da DNA o RNA. 9 un vantaggio di questo approccio è che il DNA e cDNA/RNA bisogno di non essere fisicamente separate come avviene in Gel-seq e G & T-segg. Lo svantaggio, tuttavia, è che il DR-seq richiede conoscenza a priori del genoma e del trascrittoma (cioè, esoni e introni) e potrebbe non essere l'ideale per applicazioni come il sequenziamento dei nuclei, in cui molte trascrizioni non sono ancora completamente impiombato e contengono ancora gli introni. 12
L'aspetto di novità di Gel-seq è la capacità di separare il DNA ed il RNA in centinaia di celle basate esclusivamente sulla dimensione. Questo metodo richiede nessuna conoscenza aprioristicamente del genoma o del trascrittoma, è robusta contro splicing incompleta e non è limitata alle trascrizioni di poli-adenylated. Per le applicazioni dove un ricercatore può iniziare con almeno 100 cellule, Gel-seq fornisce un approccio diretto con materiali economici e ampiamente disponibili.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:905px;" width="906">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">Reagents</td>
			<td style="width:147px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:369px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">Acrylamide Monomer</td>
			<td style="width:147px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A8887-100G</td>
			<td style="width:369px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">Ammonium Persulfate</td>
			<td style="width:147px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A3678-25G</td>
			<td style="width:369px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:271px;">Ampure XP Beads</td>
			<td style="width:147px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:119px;">A63880</td>
			<td style="width:369px;">Referred to in the text as solid phase reversible immobilization (SPRI) beads</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:271px;">DNA Gel Loading Dye (6x)</td>
			<td style="width:147px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">R0611</td>
			<td style="width:369px;">Referred to in the text as 6X loading dye</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">Ethyl alcohol</td>
			<td style="width:147px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">E7023-500ML</td>
			<td style="width:369px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">KAPA SYBR FAST One-Step qRT-PCR Kits</td>
			<td style="width:147px;">Kapa BioSystems</td>
			<td style="width:119px;">7959613001</td>
			<td style="width:369px;">Referred to in the text as 2X qPCR mix</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">N,N&#8242;-Methylenebis(acrylamide)&#160;</td>
			<td style="width:147px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">146072-100G</td>
			<td style="width:369px;">Also known as bis-acrylamide</td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:271px;">NexteraXT DNA Library Preparation Kit (referred to in the text as library preparation kit)</td>
			<td style="width:147px;">Illumina</td>
			<td style="width:119px;">FC-131-1024</td>
			<td style="width:369px;">Includes: TD (referred to in the text as transposase buffer), ATM (referred to in the text as transposase), NT (referred to in the text as transposase stop buffer), and NPM (Referred to in the text as library prep PCR mix)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">Nuclease Free Water</td>
			<td style="width:147px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">3098</td>
			<td style="width:369px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">Protease</td>
			<td style="width:147px;">Qiagen</td>
			<td style="width:119px;">19155</td>
			<td style="width:369px;"></td>
		</tr>
		<tr height="189">
			<td height="189" style="height:189px;width:271px;">SMART-Seq v4 Kit (referred to in the text as whole-transcript amplification (WTA) kit)</td>
			<td style="width:147px;">Takara/Clontech</td>
			<td style="width:119px;">634888</td>
			<td style="width:369px;">Includes: Lysis buffer, RNase inhibitor, 3&#8217; SMART-Seq CDS Primer II A (referred to in the text as RT primer), 5X Ultra Low First Strand Buffer (referred to in the text as first strand buffer), SMART-Seq v4 Oligonucleotide (referred to in the text as template switch oligonucleotide (TSO)), SMART-Scribe Reverse Transcriptase (referred to in the text as reverse transcriptase), and PCR Primer II A (referred to in the text as cDNA PCR primer)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">Random hexamer with WTA adapter&#160;</td>
			<td style="width:147px;">IDT</td>
			<td style="width:119px;">n/a</td>
			<td>5&#8242;-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTAC-NNNNNN-3&#8242;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">Sucrose</td>
			<td style="width:147px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">S0389-500G</td>
			<td style="width:369px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">TEMED</td>
			<td style="width:147px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">T9281-25ML</td>
			<td style="width:369px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:271px;">DNA AWAY Surface Decontaminant</td>
			<td style="width:147px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">7010PK&#160;&#160;</td>
			<td style="width:369px;">Referred to in the text as DNA removal product</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:271px;">Tris-Borate-EDTA buffer (10X concentration)</td>
			<td style="width:147px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">T4415-1L</td>
			<td style="width:369px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:271px;">SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain (10,000X Concentrate in DMSO)</td>
			<td style="width:147px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">S11494</td>
			<td style="width:369px;">Referred to in the text as gel stain</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;"></td>
			<td style="width:147px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:369px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">Equipment</td>
			<td style="width:147px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:369px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:271px;">BD Precisionglide&#160;syringe needles, gauge 18</td>
			<td style="width:147px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">Z192554</td>
			<td style="width:369px;">Any equivalent hardware is acceptable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">Branson CPX series ultrasonic bath</td>
			<td style="width:147px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">Z769363</td>
			<td style="width:369px;">Any equivalent hardware is acceptable</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:271px;">Empty Gel Cassettes, mini, 1.0 mm</td>
			<td style="width:147px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">NC2010</td>
			<td style="width:369px;">Any equivalent hardware is acceptable</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:271px;">Mesh Filter Plate - Corning&#160;HTS Transwell 96 well permeable supports - 8.0 &#181;m pore size</td>
			<td style="width:147px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">CLS3374</td>
			<td style="width:369px;">Referred to in the text as 8 um mesh filter plate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">PowerPac HC Power Supply</td>
			<td style="width:147px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">1645052</td>
			<td style="width:369px;">Any equivalent hardware is acceptable</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:271px;">Qubit Fluorometer</td>
			<td style="width:147px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">Q33216</td>
			<td style="width:369px;">Any equivalent hardware is acceptable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">Vacufuge Concentrator</td>
			<td style="width:147px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">22822993</td>
			<td style="width:369px;">Any equivalent hardware is acceptable</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:271px;">XCell SureLock Mini-Cell system</td>
			<td style="width:147px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">EI0001</td>
			<td style="width:369px;">Any equivalent hardware is acceptable</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:271px;">Bio-Rad CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System</td>
			<td style="width:147px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">1855195&#160;</td>
			<td style="width:369px;">Any equivalent hardware is acceptable</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:271px;">Amersham UVC 500 Ultraviolet Crosslinker</td>
			<td style="width:147px;">GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td style="width:119px;">UVC500-115V</td>
			<td style="width:369px;">Discontinued, any equivalent hardware is acceptable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">Gel Doc XR+ Gel Documentation System</td>
			<td style="width:147px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">1708195</td>
			<td style="width:369px;">Referred to in the text as gel imager</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:271px;">Dark Reader Transilluminator</td>
			<td style="width:147px;">Clare Chemical Research</td>
			<td style="width:119px;">DR89</td>
			<td style="width:369px;">Referred to in the text as UV transilluminator</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">&#160;Ultrasonic&#160;Bath</td>
			<td style="width:147px;">Bransonic</td>
			<td style="width:119px;">1207K35</td>
			<td style="width:369px;">Any equivalent ultrasonic bath is acceptable.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

gel-seq: a method for simultaneous sequencing library preparation of dna and rna using hydrogel matrices

La capacità di amplificare e sequenza di DNA o RNA da piccoli campioni di partenza è stato raggiunto solo negli ultimi cinque anni. Purtroppo, i protocolli standard per la generazione genomico o librerie di trascrittomica sono incompatibili e i ricercatori devono scegliere se sequenza DNA o RNA per un particolare campione. Gel-seq risolve questo problema consentendo ai ricercatori di preparare contemporaneamente le librerie per sia DNA che RNA a partire con 100-1000 cellule utilizzando un dispositivo semplice idrogel. Questa carta presenta un approccio dettagliato per la fabbricazione del dispositivo, nonché il protocollo biologico per generare librerie accoppiate. Abbiamo progettato di Gel-seq, così che potrebbe essere facilmente implementato da altri ricercatori; molti laboratori di genetica hanno già le attrezzature necessarie per riprodurre la fabbricazione di dispositivi di Gel-seq. Il nostro protocollo impiega Kit comunemente usati per l'amplificazione sia intero-trascrizione (WTA) e preparazione di biblioteca, che sono anche suscettibili di essere familiare ai ricercatori già esperto in generazione genomica e trascrittomica librerie. Il nostro approccio permette ai ricercatori di far per valere il potere di sequenziamento del DNA e di RNA su un singolo campione senza spaccare e con costo aggiuntivo trascurabile.

La separazione fisica degli ibridi gDNA e cDNA/RNA nel dispositivo Gel-seq possa essere visualizzata attraverso gel fluorescente per immagini; un risultato rappresentativo è illustrato nella Figura 3. Pannello A Mostra il dispositivo fabbricato di Gel-seq; falso colore è stata aggiunta per distinguere le regioni di diversi gel. Pannello B rivela una stretta di quattro separazioni differenti utilizzate per la convalida. La terza corsia, un controllo negativo, rappresenta sfondo e dimostra che non c'è nessun autoflourescence del gel alle interfacce. Abbiamo caricato le corsie prime e la seconda con scale del DNA. Queste corsie mostrano solo una banda scura all'interfaccia fra le membrane a bassa e alta densità, rivelando che piccoli frammenti possono passare attraverso il gel a bassa densità. La quarta corsia viene illustrato il comportamento di un campione biologico di interesse: 500 cellule PC3. Abbiamo caricato corsia quattro come descritto nel passaggio 3 del protocollo. L'immagine mostra la separazione di DNA genomic e ibridi cDNA/RNA. Una banda scura nella parte superiore della membrana a bassa densità è DNA genomic megabase-scala, mentre gli ibridi cDNA/RNA sono accatastati all'interfaccia delle regioni ad alta densità e basse. A differenza delle corsie caricate con scaletta, ci sono anche diverse bande presenti all'interno della regione ad alta densità del gel. Questi frammenti, più piccoli di 100 bp, sono fuori bersaglio prodotti generati da oligonucleotidi primer durante la trascrizione inversa. Pannello C Mostra un'immagine rappresentativa dell'intero apparecchio Gel-seq da un esperimento riuscito. Corsie con etichettate RNA/cDNA sono state elaborate con il protocollo di Gel-seq, mentre corsie etichettate RNA mostrano una separazione dei soli gDNA e RNA. Pannello D Mostra un esperimento fallito con bande nere nella parte superiore di ogni corsia della membrana a bassa densità. Questo è stato causato da buffer di elettroforesi contaminato con DNA frammentato. A questo punto, i ricercatori dovrebbero essere alla ricerca sia controlli pulito negativi e due distinte bande nere che indicano la presenza di gDNA separato e ibridi RNA/cDNA.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57315/57315fig3.jpg"> Figura 3 . Risultati di separazione del gel-Seq. Il dispositivo di Gel-seq (A) e un'immagine fluorescente Mostra la separazione di DNA e RNA/cDNA ibridi (B). Falso colore è stata aggiunta per distinguere più facilmente tra le diverse regioni di densità all'interno del gel. (C e D) Immagini fluorescenti rappresentative dell'intero apparecchio Gel-seq da un successo (C) e l'esperimento fallito (D). NTC non = nessun controllo del modello. Porzioni di questa figura sono state riprodotte da Ref. 7 con il permesso della Royal Society of Chemistry. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57315/57315fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Una volta che gli ibridi di DNA e RNA/cDNA sono stati separati e il resto del protocollo Gel-seq completato, è possibile generare sequenziamento librerie. Per convalidare le librerie preparate, abbiamo eseguito un esperimento di elettroforesi del gel di standard (Figura 4) o un bioanalyzer. I risultati in Figura 4 Visualizza librerie generate da cellule PC3 500 e 750 cellule HeLa. La figura mostra le distribuzioni di frammento per librerie abbinate generate da Gel-seq (etichettato 'Gel') rispetto ai campioni senza eguali generati con protocolli standard (etichettati 'Tube'). Le dimensioni del frammento per Gel-seq vengono visualizzati tra 200 e 800 basi come previsto durante la preparazione di librerie utilizzando il kit di preparazione di libreria standard intero genoma. Se i frammenti di libreria non vengono visualizzati nella gamma di dimensioni corrette in questo passaggio, preparazione di libreria non è riuscita.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57315/57315fig4.jpg"> Figura 4 . Confronto di dimensione del frammento di biblioteca. Un'immagine di elettroforesi su gel fluorescente confrontando la distribuzione delle dimensioni libreria tra Gel-seq (Gel) e controlli standard (tubo). La corsia di sinistra contiene una bassa massa DNA ladder con frammento dimensioni 100, 200, 400, 800, 1200 e 2000 basi. Le dimensioni del frammento per tutte le librerie cadono tra 200 e 800 basi, come previsto per le librerie preparate con questo kit. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57315/57315fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
La validazione finale del protocollo Gel-seq è basata sull'analisi dei risultati di sequenziamento. Abbiamo selezionato le cellule PC3 per i nostri esperimenti di convalida, in quanto queste cellule hanno profili di espressione omogenea che permettono che i campioni essere diviso ed elaborati utilizzando Gel-seq e metodi tradizionali; vedere la Figura 5. Un confronto tra il DNA di genomic per cellule PC3 è mostrato nelle figure 5A e 5B. Figura 5 A Mostra un confronto dei genoma copia numero variazione (CNV) profili generati da PC3 utilizzando Gel-seq o una reazione della preparazione della libreria standard intero genoma (controllo del tubo). Ogni punto è un conteggio medio normalizzato bin; bidoni sono definiti da dati del genoma di riferimento tale che ogni bin ha uguale conteggio previsto in una sana cellula diploide, cioè, una linea piatta, che rappresentano copie uguali per ogni regione di tutto autosomal (escluse X e Y) cromosomi. PC3 contiene più copie delle stesse regioni che appaiono come picchi sopra un numero di copia di sfondo di due. Gel-seq produce un profilo CNV qualitativamente simile come reazione di tubo standard. Accordo tra le due piazzole può essere valutata quantitativamente mediante regressione lineare, come mostrato nel pannello B. Una correlazione di Pearson r = 0.90 indica che i dati genomici raccolti da uno dei due metodi sono funzionalmente equivalenti.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57315/57315fig5.jpg"> Figura 5 . Convalida di biblioteca. Gel-seq convalida per la genomica (A e B) e dati di trascrittomica (C, D ed E) generati dalle cellule PC3 e Hela. Pannello A Mostra un confronto del genoma CNV profili generati da PC3 utilizzando Gel-seq (Gel-seq) o una reazione standard (tubo). MAPD = differenza Pairwise assoluta mediana. Pannello B è una regressione lineare tra i due campioni nel pannello A, con R = 0.90 che indica i dati genomici sono funzionalmente equivalenti. Gli assi mostrano che il bidone normalizzato log2 conta. Pannelli C e D confrontare dati di trascrittomica da cellule PC3, con ogni punto mostrando un conteggio in trascrizioni per kilobase per milione (TPM). Gli assi mostrano il confronto tra due campioni come log2 normalizzato trascrizione conteggi. Pannello C Mostra un confronto di tecniche replicati generato utilizzando Gel-seq, e D del pannello mostra che un confronto tra Gel-seq e tradizionale E del pannello di RNA-seq. evidenzia che Gel-seq può risolvere il tipo di cella basato sull'espressione di RNA usando un'analisi delle componenti principali. L'asse x che mostra i primi conti di componente principale per 91,6% della variazione tra i campioni mentre l'asse y indica che il secondo componente principale è responsabile solo il 6,5% della varianza. Porzioni di questa figura sono state riprodotte da Ref. 7 con il permesso della Royal Society of Chemistry. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57315/57315fig5large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Allo stesso modo, abbiamo confrontato Transcrittomica dati dal nostro protocollo di Gel-seq del protocollo di Smart-Seq in tubo standard. La figura 5 Mostra la correlazione tra entrambi replicati tecniche Gel-seq (Figura 5C) e tra Gel-seq e il metodo standard(Figura 5). Ogni punto è un conteggio in trascrizioni per kilobase per milione (TPM) per ogni gene rilevato al TPM > 5 in entrambi i set di dati. Le regressioni lineari sono indicate come linee rosse, e il coefficiente di correlazione di Pearson è mostrato in alto a sinistra. Tecnici replicati da Gel-seq d'accordo (R ∼ 0.8), ma meno bene di correlare con il metodo standard (R < 0,7). Ciò suggerisce che il Gel-seq introduce un bias nei conteggi di gene. Fortunatamente, questo pregiudizio è sistematico e, può essere visto dall'analisi delle componenti principali in Figura 5E, ancora possibile trarre conclusioni significative tra diversi campioni biologici.

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Gel-seq: A Method for Simultaneous Sequencing Library Preparation of DNA and RNA Using Hydrogel Matrices

Gel-seq consente ai ricercatori di preparare contemporaneamente le librerie per entrambi DNA - e RNA-seq trascurabile costo aggiunto a partire da 100-1000 cellule utilizzando un dispositivo semplice idrogel. Questa carta presenta un approccio dettagliato per la fabbricazione del dispositivo, nonché il protocollo biologico per generare librerie accoppiate.

Gel-seq: Un metodo per la preparazione di libreria simultanea di sequenziamento del DNA e RNA utilizzando matrici di idrogel

The ability to amplify and sequence either DNA or RNA from small starting samples has only been achieved in the last five years. Unfortunately, the ...

gel-seq-method-for-simultaneous-sequencing-library-preparation-dna

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Bioengineering

8.9K Views.  University of San Diego. Gel-seq consente ai ricercatori di preparare contemporaneamente le librerie per entrambi DNA - e RNA-seq trascurabile costo aggiunto a partire da 100-1000 cellule utilizzando un dispositivo semplice idrogel. Questa carta presenta un approccio dettagliato per la fabbricazione del dispositivo, nonché il protocollo biologico per generare librerie accoppiate.

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Preparation of Complaint Matrices for Quantifying Cellular Contraction

The regulation of cellular adhesion to the extracellular matrix (ECM) is essential for cell migration and ECM remodeling. Focal adhesions are macromolecular assemblies that couple the contractile F-actin cytoskeleton to the ECM. This connection allows for the transmission of intracellular mechanical forces across the cell membrane to the underlying substrate. Recent work has shown the mechanical properties of the ECM regulate focal adhesion and F-actin morphology as well as numerous physiological processes, including cell differentiation, division, proliferation and migration. Thus, the use of cell culture substrates has become an increasingly prevalent method to precisely control and modulate ECM mechanical properties.
To quantify traction forces at focal adhesions in an adherent cell, compliant substrates are used in conjunction with high-resolution imaging and computational techniques in a method termed traction force microscopy (TFM). This technique relies on measurements of the local magnitude and direction of substrate deformations induced by cellular contraction. In combination with high-resolution fluorescence microscopy of fluorescently tagged proteins, it is possible to correlate cytoskeletal organization and remodeling with traction forces.
Here we present a detailed experimental protocol for the preparation of two-dimensional, compliant matrices for the purpose of creating a cell culture substrate with a well-characterized, tunable mechanical stiffness, which is suitable for measuring cellular contraction. These protocols include the fabrication of polyacrylamide hydrogels, coating of ECM proteins on such gels, plating cells on gels, and high-resolution confocal microscopy using a perfusion chamber. Additionally, we provide a representative sample of data demonstrating location and magnitude of cellular forces using cited TFM protocols.

In this video, we demonstrate the experimental techniques used to fabricate compliant, extracellular matrix (ECM) coated substrates suitable for cell culture, and which are amenable to traction force microscopy and observing effects of ECM stiffness on cell behavior.

Preparazione di matrici di reclamo per Quantificare Contrazione Cellular

The regulation of cellular adhesion to the extracellular matrix (ECM) is essential for cell migration and ECM remodeling.  Focal adhesions are ...

Ricerca

Bioingegneria

Constant Pressure-controlled Extrusion Method for the Preparation of Nano-sized Lipid Vesicles

Liposomes are artificially prepared vesicles consisting of natural and synthetic phospholipids that are widely used as a cell membrane mimicking platform to study protein-protein and protein-lipid interactions3, monitor drug delivery4,5, and encapsulation4. Phospholipids naturally create curved lipid bilayers, distinguishing itself from a micelle.6 Liposomes are traditionally classified by size and number of bilayers, i.e. large unilamellar vesicles (LUVs), small unilamellar vesicles (SUVs) and multilamellar vesicles (MLVs)7. In particular, the preparation of homogeneous liposomes of various sizes is important for studying membrane curvature that plays a vital role in cell signaling, endo- and exocytosis, membrane fusion, and protein trafficking8. Several groups analyze how proteins are used to modulate processes that involve membrane curvature and thus prepare liposomes of diameters &lt;100 - 400 nm to study their behavior on cell functions3. Others focus on liposome-drug encapsulation, studying liposomes as vehicles to carry and deliver a drug of interest9. Drug encapsulation can be achieved as reported during liposome formation9. Our extrusion step should not affect the encapsulated drug for two reasons, i.e. (1) drug encapsulation should be achieved prior to this step and (2) liposomes should retain their natural biophysical stability, securely carrying the drug in the aqueous core. These research goals further suggest the need for an optimized method to design stable sub-micron lipid vesicles.
Nonetheless, the current liposome preparation technologies (sonication10, freeze-and-thaw10, sedimentation) do not allow preparation of liposomes with highly curved surface (i.e. diameter &lt;100 nm) with high consistency and efficiency10,5, which limits the biophysical studies of an emerging field of membrane curvature sensing. Herein, we present a robust preparation method for a variety of biologically relevant liposomes.
Manual extrusion using gas-tight syringes and polycarbonate membranes10,5 is a common practice but heterogeneity is often observed when using pore sizes &lt;100 nm due to due to variability of manual pressure applied. We employed a constant pressure-controlled extrusion apparatus to prepare synthetic liposomes whose diameters range between 30 and 400 nm. Dynamic light scattering (DLS)10, electron microscopy11 and nanoparticle tracking analysis (NTA)12 were used to quantify the liposome sizes as described in our protocol, with commercial polystyrene (PS) beads used as a calibration standard. A near linear correlation was observed between the employed pore sizes and the experimentally determined liposomes, indicating high fidelity of our pressure-controlled liposome preparation method. Further, we have shown that this lipid vesicle preparation method is generally applicable, independent of various liposome sizes. Lastly, we have also demonstrated in a time course study that these prepared liposomes were stable for up to 16 hours. A representative nano-sized liposome preparation protocol is demonstrated below.

This protocol describes an extrusion method for preparing lipid vesicles of sub-micron sizes with a high degree of homogeneity. This method uses a pressure-controlled system with controlled nitrogen flow rates for liposome preparation. The lipid preparation1,2, liposome extrusion, and size characterization will be presented herein.

Costante pressione controllata metodo di estrusione per la preparazione del Nano di dimensioni vescicole lipidiche

Liposomes are artificially prepared vesicles consisting of natural and synthetic phospholipids that are widely used as a cell membrane mimicking platform ...

An Improved Method for the Preparation of Type I Collagen From Skin

Soluble type 1 collagen (COL1) is used extensively as an adhesive substrate for cell cultures and as a cellular scaffold for regenerative applications. Clinically, this protein is widely used for cosmetic surgery, dermal injections, bone grafting, and reconstructive surgery. The sources of COL1 for these procedures are commonly nonhuman, which increases the potential for inflammation and rejection as well as xenobiotic disease transmission. In view of this, a method to efficiently and quickly purify COL1 from limited quantities of autologously-derived tissues would circumvent many of these issues; however, standard isolation protocols are lengthy and often require large quantities of collagenous tissues. Here, we demonstrate an efficient COL1 extraction method that reduces the time needed to isolate and purify this protein from about 10 days to less than 3 hr. We chose the dermis as our tissue source because of its availability during many surgical procedures. This method uses traditional extraction buffers combined with forceful agitation and centrifugal filtration to obtain highly-pure, soluble COL1 from small amounts of corium. Briefly, dermal biopsies are washed thoroughly in ice-cold dH2O after removing fat, connective tissue, and hair. The skin samples are stripped of noncollagenous proteins and polysaccharides using 0.5 M sodium acetate and a high speed bench-top homogenizer. Collagen from residual solids is subsequently extracted with a 0.075 M sodium citrate buffer using the homogenizer. These extracts are purified using 100,000 MW cut-off centrifugal filters that yield COL1 preparations of comparable or superior quality to commercial products or those obtained using traditional procedures. We anticipate this method will facilitate the utilization of autologously-derived COL1 for a multitude of research and clinical applications.

Traditional procedures for the isolation of soluble type 1 collagen (COL1) require about 10 days from start to finish because of lengthy buffer incubations and laborious resuspensions of fibrils. Here, we describe a means to purify COL1 from small dermal biopsies in less than 3 hr.

Un metodo migliore per la preparazione di tipo I collagene della pelle

Soluble type 1 collagen (COL1) is used extensively as an adhesive substrate for cell cultures and as a cellular scaffold for regenerative applications. ...

Synthesis of an Intein-mediated Artificial Protein Hydrogel

We present the synthesis of a highly stable protein hydrogel mediated by a split-intein-catalyzed protein trans-splicing reaction. The building blocks of this hydrogel are two protein block-copolymers each containing a subunit of a trimeric protein that serves as a crosslinker and one half of a split intein. A highly hydrophilic random coil is inserted into one of the block-copolymers for water retention. Mixing of the two protein block copolymers triggers an intein trans-splicing reaction, yielding a polypeptide unit with crosslinkers at either end that rapidly self-assembles into a hydrogel. This hydrogel is very stable under both acidic and basic conditions, at temperatures up to 50 &#176;C, and in organic solvents. The hydrogel rapidly reforms after shear-induced rupture. Incorporation of a &#34;docking station peptide&#34; into the hydrogel building block enables convenient incorporation of &#34;docking protein&#34;-tagged target proteins. The hydrogel is compatible with tissue culture growth media, supports the diffusion of 20 kDa molecules, and enables the immobilization of bioactive globular proteins. The application of the intein-mediated protein hydrogel as an organic-solvent-compatible biocatalyst was demonstrated by encapsulating the horseradish peroxidase enzyme and corroborating its activity.

We present the synthesis of a split-intein-mediated protein hydrogel. The building blocks of this hydrogel are two protein copolymers each containing a subunit of a trimeric protein that serves as a crosslinker and one half of a split intein. Mixing of the two protein copolymers triggers an intein trans-splicing reaction, yielding a polypeptide unit that self-assembles into a hydrogel. This hydrogel is highly pH- and temperature-stable, compatible with organic solvents, and easily incorporates functional globular proteins.

Sintesi di una proteina artificiale mediata da inteina Hydrogel

We present the synthesis of a highly stable protein hydrogel mediated by a split-intein-catalyzed protein trans-splicing reaction. The building blocks of ...

Hydrogel Nanoparticle Harvesting of Plasma or Urine for Detecting Low Abundance Proteins

Novel biomarker discovery plays a crucial role in providing more sensitive and specific disease detection. Unfortunately many low-abundance biomarkers that exist in biological fluids cannot be easily detected with mass spectrometry or immunoassays because they are present in very low concentration, are labile, and are often masked by high-abundance proteins such as albumin or immunoglobulin. Bait containing poly(N-isopropylacrylamide) (NIPAm) based nanoparticles are able to overcome these physiological barriers. In one step they are able to capture, concentrate and preserve biomarkers from body fluids. Low-molecular weight analytes enter the core of the nanoparticle and are captured by different organic chemical dyes, which act as high affinity protein baits. The nanoparticles are able to concentrate the proteins of interest by several orders of magnitude. This concentration factor is sufficient to increase the protein level such that the proteins are within the detection limit of current mass spectrometers, western blotting, and immunoassays. Nanoparticles can be incubated with a plethora of biological fluids and they are able to greatly enrich the concentration of low-molecular weight proteins and peptides while excluding albumin and other high-molecular weight proteins. Our data show that a 10,000 fold amplification in the concentration of a particular analyte can be achieved, enabling mass spectrometry and immunoassays to detect previously undetectable biomarkers.

Several pathological biomarkers cannot be easily detected by current techniques because of their low concentration in biological fluids, the presence of degrading enzymes, and large amounts of high molecular weight proteins. Chemically functionalized hydrogel nanoparticles can harvest, preserve and concentrate low abundance proteins enabling the detection of previously undetectable biomarkers.

Hydrogel nanoparticelle raccolta di plasma o nelle urine per il rilevamento di proteine ​​a basso Abbondanza

Novel biomarker discovery plays a crucial role in providing more sensitive and specific disease detection. Unfortunately many low-abundance biomarkers ...

Bioprinting Cellularized Constructs Using a Tissue-specific Hydrogel Bioink

Bioprinting has emerged as a versatile biofabrication approach for creating tissue engineered organ constructs. These constructs have potential use as organ replacements for implantation in patients, and also, when created on a smaller size scale as model "organoids" that can be used in in vitro systems for drug and toxicology screening.
Despite development of a wide variety of bioprinting devices, application of bioprinting technology can be limited by the availability of materials that both expedite bioprinting procedures and support cell viability and function by providing tissue-specific cues. Here we describe a versatile hyaluronic acid (HA) and gelatin-based hydrogel system comprised of a multi-crosslinker, 2-stage crosslinking protocol, which can provide tissue specific biochemical signals and mimic the mechanical properties of in vivo tissues. 
Biochemical factors are provided by incorporating tissue-derived extracellular matrix materials, which include potent growth factors. Tissue mechanical properties are controlled combinations of PEG-based crosslinkers with varying molecular weights, geometries (linear or multi-arm), and functional groups to yield extrudable bioinks and final construct shear stiffness values over a wide range (100 Pa to 20 kPa). Using these parameters, hydrogel bioinks were used to bioprint primary liver spheroids in a liver-specific bioink to create in vitro liver constructs with high cell viability and measurable functional albumin and urea output. This methodology provides a general framework that can be adapted for future customization of hydrogels for biofabrication of a wide range of tissue construct types.

We describe a set of protocols that together provide a tissue-mimicking hydrogel bioink with which functional and viable 3-D tissue constructs can be bioprinted for use in in vitro screening applications.

Bioprinting Cellularized Costruisce Utilizzando un tessuto-specifici idrogel Bioink

Bioprinting has emerged as a versatile biofabrication approach for creating tissue engineered organ constructs. These constructs have potential use as ...

Fabricating a Kidney Cortex Extracellular Matrix-Derived Hydrogel

Extracellular matrix (ECM) provides important biophysical and biochemical cues to maintain tissue homeostasis. Current synthetic hydrogels offer robust mechanical support for in vitro cell culture but lack the necessary protein and ligand composition to elicit physiological behavior from cells. This manuscript describes a fabrication method for a kidney cortex ECM-derived hydrogel with proper mechanical robustness and supportive biochemical composition. The hydrogel is fabricated by mechanically homogenizing and solubilizing decellularized human kidney cortex ECM. The matrix preserves native kidney cortex ECM protein ratios while also enabling gelation to physiological mechanical stiffnesses. The hydrogel serves as a substrate upon which kidney cortex-derived cells can be maintained under physiological conditions. Furthermore, the hydrogel composition can be manipulated to model a diseased environment which enables the future study of kidney diseases.

Here we present a protocol to fabricate a kidney cortex extracellular matrix-derived hydrogel to retain the native kidney extracellular matrix (ECM) structural and biochemical composition. The fabrication process and its applications are described. Finally, a perspective on using this hydrogel to support kidney-specific cellular and tissue regeneration and bioengineering is discussed.

Fabbricando un rene corteccia extracellulare Matrix-derivato idrogel

Extracellular matrix (ECM) provides important biophysical and biochemical cues to maintain tissue homeostasis. Current synthetic hydrogels offer robust ...

Ultra-long Read Sequencing for Whole Genomic DNA Analysis

Third generation single-molecule DNA sequencing technologies offer significantly longer read length that can facilitate the assembly of complex genomes and analysis of complex structural variants. Nanopore platforms perform single-molecule sequencing by directly measuring the current changes mediated by DNA passage through the pores and can generate hundreds of kilobase (kb) reads with minimal capital cost. This platform has been adopted by many researchers for a variety of applications. Achieving longer sequencing read lengths is the most critical factor to leverage the value of nanopore sequencing platforms. To generate ultra-long reads, special consideration is required to avoid DNA breakages and gain efficiency to generate productive sequencing templates. Here, we provide the detailed protocol of ultra-long DNA sequencing including high molecular weight (HMW) DNA extraction from fresh or frozen cells, library construction by mechanical shearing or transposase fragmentation, and sequencing on a nanopore device. From 20-25 &#181;g of HMW DNA, the method can achieve N50 read length of 50-70 kb with mechanical shearing and N50 of 90-100 kb read length with transposase mediated fragmentation. The protocol can be applied to DNA extracted from mammalian cells to perform whole genome sequencing for the detection of structural variants and genome assembly. Additional improvements on the DNA extraction and enzymatic reactions will further increase the read length and expand its utility.

Long-read sequences greatly facilitate the assembly of complex genomes and characterization of structural variation. We describe a method to generate ultra-long sequences by nanopore-based sequencing platforms. The approach adopts an optimized DNA extraction followed by modified library preparations to generate hundreds of kilobase reads with moderate coverage from human cells.

Sequenziamento di lettura ultra-lungo per analisi di DNA Genomic intero

Third generation single-molecule DNA sequencing technologies offer significantly longer read length that can facilitate the assembly of complex genomes ...

High Throughput Yeast Strain Phenotyping with Droplet-Based RNA Sequencing

The powerful tools available to edit yeast genomes have made this microbe a valuable platform for engineering. While it is now possible to construct libraries of millions of genetically distinct strains, screening for a desired phenotype remains a significant obstacle. With existing screening techniques, there is a tradeoff between information output and throughput, with high-throughput screening typically being performed on one product of interest. Therefore, we present an approach to accelerate strain screening by adapting single cell RNA sequencing to isogenic picoliter colonies of genetically engineered yeast strains. To address the unique challenges of performing RNA sequencing on yeast cells, we culture isogenic yeast colonies within hydrogels and spheroplast prior to performing RNA sequencing. The RNA sequencing data can be used to infer yeast phenotypes and sort out engineered pathways. The scalability of our method addresses a critical obstruction in microbial engineering.

A bottleneck in the &#8216;design-build-test&#8217; cycle of microbial engineering is the speed at which we can perform functional screens of strains. We describe a high-throughput method for strain screening applied to hundreds to thousands of yeast cells per experiment that utilizes droplet-based RNA sequencing.

Phenotipizzazione del ceppo di lievito ad alta velocità effettiva con sequenziamento dell'RNA basato su droplet

The powerful tools available to edit yeast genomes have made this microbe a valuable platform for engineering. While it is now possible to construct ...

Simultaneous Quantification of Selected Kynurenines Analyzed by Liquid Chromatography-Mass Spectrometry in Medium Collected from Cancer Cell Cultures

The kynurenine pathway and the tryptophan catabolites called kynurenines have received increased attention for their involvement in immune regulation and cancer biology. An in vitro cell culture assay is often used to learn about the contribution of different tryptophan catabolites in a disease mechanism and for testing therapeutic strategies. Cell culture medium that is rich in secreted metabolites and signaling molecules reflects the status of tryptophan metabolism and other cellular events. New protocols for the reliable quantification of multiple kynurenines in the complex cell culture medium are desired to allow for a reliable and quick analysis of multiple samples. This can be accomplished with liquid chromatography coupled with mass spectrometry. This powerful technique is employed in many clinical and research laboratories for the quantification of metabolites and can be used for measuring kynurenines.
Presented here is the use of liquid chromatography coupled with single quadrupole mass spectrometry (LC-SQ) for the simultaneous determination of four kynurenines, i.e., kynurenine, 3-hydroxykynurenine, 3-hydroxyanthranilic, and xanthurenic acid in the medium collected from in vitro cultured cancer cells. SQ detector is simple to use and less expensive compared to other mass spectrometers. In the SQ-MS analysis, multiple ions from the sample are generated and separated according to their specific mass-to-charge ratio (m/z), followed by the detection using a Single Ion Monitoring (SIM) mode.
This paper draws the attention on the advantages of the reported method and indicates some weak points. It is focused on critical elements of LC-SQ analysis including sample preparation along with chromatography and mass spectrometry analysis. The quality control, method calibration conditions and matrix effect issues are also discussed. We described a simple application of 3-nitrotyrosine as one analog standard for all target analytes. As confirmed by experiments with human ovary and breast cancer cells, the proposed LC-SQ method&#160;generates reliable results and can be further applied to other in vitro cellular models.

Described here is a protocol for the determination of four different tryptophan metabolites generated in the kynurenine pathway (kynurenine, 3-hydroxykynurenine, xanthurenic acid, 3-hydroxyanthranilic acid) in the medium collected from cancer cell cultures analyzed by liquid chromatography coupled with a single quadrupole mass spectrometry.

Quantificazione simultanea di kynurenine selezionate analizzate dalla cromatografia liquida-spettrometria di massa in mezzo raccolto da colture cellulari tumorali

The kynurenine pathway and the tryptophan catabolites called kynurenines have received increased attention for their involvement in immune regulation and ...