Este trabalho foi apoiado pela Humboldt-Universität zu Berlin, o centro de Bernstein para Berlim de neurociência computacional, o centro alemão para doenças neurodegenerativas (DZNE), o Ministério Federal alemão de educação e pesquisa (BMBF, Förderkennzeichen 01GQ1001A), NeuroCure e a Gottfried Wilhelm Leibniz prêmio da DFG. Agradecemos Shimpei Ishiyama para design gráfico excelente e Juliane Diederichs para assistência técnica excelente.

Todos os procedimentos experimentais foram realizados de acordo com as diretrizes alemãs sobre o bem-estar animal, sob a supervisão das comissões de ética locais (LaGeSo). Humano e morcego cérebro dados foram derivados de Naumann et al 5 o procedimento a seguir é realizado em um rato de Wistar adulto macho (estirpe: RJHan:WI).
1. perfusão e extração do cérebro
Nota: A fim de obter um cérebro homogênea fixo e livre de sangue, transcardial perfusão do animal é altamente incentivado, como sangue residual aumenta o sinal de fundo inespecíficos durante coloração. No entanto, também é possível obter seções achatadas do espécime un-perfundido e manchá-las. A facilidade de manipulação da amostra varia com a concentração de fixador usado. Fixação muito pouco aumenta o risco de manipulação danos ao cérebro durante o nivelamento e corte, enquanto também altas concentrações menor a flexibilidade para o achatamento e a qualidade do sinal de coloração.
<ol><li>Transcardially perfundir o animal, usando uma agulha 23G. Para um guia mais detalhado, ver Gage et al 9<ol>
<li>Use fosfato reserva o da salina10 (PBS, 0,02 M, pH 7,4) para retirar o sangue do cérebro e do corpo do animal. Continue até o líquido de infusão aparece claro, pelo menos 150 mL de PBS sendo infundido através do sistema vascular. Nota: Os melhores resultados são obtidos com uma pressão semelhante à faixa da pressão arterial fisiológica do animal sendo perfundido (por exemplo, rato: 120-130 mmHg). Opcionalmente, adicione a solução para evitar a coagulação de sangue11heparina (10 U/mL).</li>
		<li>Para corrigir o cérebro, transcardially infundir um mínimo de 100 mL paraformaldeído12 (PFA, 4%; em fosfato 0,1 M de buffer (PB)13) até o pescoço do animal é duro. Cuidado: PFA é um potencial cancerígeno. Nota: Melhor para a atividade histoquímicas de coloração, tais como para citocromo oxidase, resultado, quando usando 2% PFA. Para outras manchas, tais como a imuno-histoquímica, 4% PFA é preferencial.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Extraia o cérebro do crânio. Nota: Ver Gage et al 9 para mais detalhes.<ol>
<li>Isole a cabeça usando tesouras grandes ou tesouras do osso.</li>
		<li>Com uma boa tesoura, cortar a pele ao longo da linha mediana do pescoço ao nariz. Separe a pele para expor a caveira. Remova o pescoço e os músculos temporais usando tesouras bem.</li>
		<li>Faça uma linha média cortar através do osso interparietal a partir do forame magno até o osso parietal.</li>
		<li>Use ruginas para descascar o osso interparietal. Deslize a tesoura bem ao longo da sutura sagital e corte da extremidade posterior do parietal à extremidade anterior dos ossos frontal.</li>
		<li>Use ruginas para descascar o parietal e ossos frontais. Alternativamente, levante os ossos usando fórceps. Use uma colher para cortar cordas ventral do nervo e remover o cérebro. Transferi o cérebro para PB (0,1 M, pH 7,4).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Consertar o cérebro un-perfundido por imersão em 4% PFA para 1-3 h a 4 ° C (dependendo do tamanho do cérebro e da sonda: musaranho: ~ 1h, humanos: ~ 3 h). Nota: Para grandes e gyrencephalic cérebros como os humanos, isolar e cortar a área de interesse para reduzir o tempo de fixação.</li>
	<li>Para obter maiores áreas corticais em uma seção, achatar o cérebro antes da pós-fixação mais; Prossiga para a etapa 2. No entanto, para obter as seções da mais difícil de alcançar áreas como o córtex entorhinal medial, fixar o cérebro em 4% PFA para 24h antes de prosseguir para a etapa 2.</li>
</ol>2. dissecção e achatamento do cérebro
<ol><li>Separe os hemisférios do cérebro usando uma lâmina de barbear (lissencephalic brains) ou bisturi (gyrencephalic brains). Nota: O cérebro não foi pós-fixado, se suscetíveis a danos por manipulação.</li>
	<li>Passo opcional para ajudar seção subsequente registo e encolhimento da estimativa:<ol>
<li>Perfure o córtex em uma área de juros, com uma agulha de 35G normal à superfície cortical. Repita a etapa duas vezes em distâncias definidas ao longo da folha cortical. Para determinar a distância ao longo da folha cortical, usar um segmento pré-cortado em um comprimento fixo (por exemplo, 5 mm) e coloque-o ao longo da superfície cortical para determinar pontos de punção.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Cérebros Lissencephalic: remover estruturas subcorticais, usando uma espátula de dissecação. Crítica: Manter o cérebro húmido com PB (0,1 M, pH 7,4) durante todo o processo.<ol>
<li>Segure o cérebro, pelo cerebelo e insira cuidadosamente a espátula para abrir um avião de dissecação no corpo caloso. A ponta redonda da espátula deve apontar longe do córtex.</li>
		<li>Deslize a espátula ainda mais e puxe suavemente até a espátula é entre o tálamo e o córtex. Estruturas subcorticais separadas com movimentos de coçar.</li>
		<li>Inspecione o hemisfério para a espessura do mesmo. Nota: Quaisquer regiões desiguais podem resultar em um gradiente de trans-camada durante o corte. Para o corte tangencial, use um bisturi para fazer um corte limpo através do cérebro, paralela à superfície pial da região da qual tangenciais seções são desejadas.</li>
		<li>Etapas opcionais para melhorar a qualidade do nivelamento:<ol>
<li>Faça um corte limpo através do corpo estriado, núcleo accumbens e córtex orbitofrontal, uma vez que eles aumentam a espessura do córtex na região lateral. Além disso, adicione um alívio corte na base da região interna do córtex pré-frontal, que permite o desdobramento das porções medial do córtex.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Coloque o hemisfério (córtex virado para baixo) sobre uma lâmina de vidro. Prossiga para a etapa 2.6.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Cérebros Gyrencephalic: remover matéria branca para desdobrar corticais (para protocolos detalhados, consulte: Sincich et al 14. o; Tootell e Silverman15). Crítica: Uso PB (0,1 M, pH 7,4) para manter o cérebro húmida em todos os tempos.<ol>
<li>Colocar a área de interesse em um papel de filtro úmido em um grande prato de Petri, com o córtex virada para cima.</li>
		<li>Remova a membrana aracnoide e da pia, usando duas pinças.</li>
		<li>Utilize um cotonete úmido e inserir suavemente em cada sulco para desanexar aderências entre corticais.</li>
		<li>Vire o cérebro usando outro papel de filtro úmido.</li>
		<li>Use duas espátulas micro curvas para desdobrar o único corticais. Use o lado convexo das espátulas para arreliar pedaços de matéria branca até chegar perto do lado côncavo de giro do. Utilize um cotonete úmido e proceder com turbilhão moções para alcançar o lado côncavo do giro do.</li>
		<li>Tease separados único corticais. Se necessário, adicione aliviando pequenos cortes se a tensão é muito alta.</li>
		<li>Achate o cérebro desdobrado na prato de Petri ou um recipiente similar.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Opcionalmente, coloque uma esponja coberta de papel de filtro, para garantir que as regiões não secar cérebros maiores.</li>
	<li>Coloque dois pedaços de laminados de barro em ambos os lados. Crítica: Como a espessura da argila define quanto o hemisfério pode ser achatado, certifique-se de que a argila é 10-20% mais fino que o córtex un-achatado.</li>
	<li>Pressione suavemente um segundo slide de vidro/pequeno prato de Petri no córtex até o hemisfério é totalmente plano. Para obter os melhores resultados para a região desejada, coloque a lâmina de vidro, primeiro, na área respectiva. Para obter os melhores resultados para cérebros lissencephalic, coloque a lâmina de vidro tangencialmente na porção lateral primeiro e aplicar pressão concentrada nesta região.</li>
	<li>Coloque um peso (por exemplo, um vidro de relógio de cerâmico) sobre a corrediças de vidro/Petri e achatar o hemisfério para 3-5 h a 4 ° C em PB.</li>
	<li>Para fixação de pós, liberar a pressão e retire as lâminas de vidro. Colocar o hemisfério achatado em PFA (livre flutuante) por 24 h num agitador a 4 ° C. Nota: Os melhores resultados para colorações histoquímicas atividade são alcançados quando usando 1% PFA. Para outras colorações, tais como a imuno-histoquímica, un-perfundidos oca, 2% PFA pode ser usado.</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56992/56992fig1.jpg"> Figura 1: representação esquemática do fluxo de trabalho para o achatamento de um hemisfério cortical de rato e visualização de módulos no córtex somatossensorial. Após a perfusão de transcardial, o cérebro de um rato foi dissecado (A). Estruturas subcorticais foram removidas e córtex foi aplainado entre duas lâminas de vidro em tampão fosfato (B). Hemisfério achatado (C) foi pós-fixado, tangencialmente seccionado e manchado para atividade de citocromo oxidase (D). Barras de escala = 1 cm. r: Rostral, Caudal de c:, l: Lateral, Medial m:. Figura adaptada de Lauer et al 23 <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56992/56992fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
3. corte tangencial seções
Nota: Dependendo das exigências dos protocolos de coloração, o processo de corte e a espessura podem ser adaptados. Um vibratome foi usado para cortar os hemisférios para mais histochemical processamento (passo 3.2) em 80-150 µm. No entanto, para o processamento de imuno-histoquímica, seções mais finas são desejadas e um micrótomo de congelação foi usado para corte (passo 3.3), em 10-60 µm. Veja o vídeo 1.
<ol><li>Lave o hemisfério achatado em PB (0.1M; pH 7,4) por 15 min.</li>
	<li>Corte o hemisfério em uma vibratome.<ol>
<li>Lugar do hemisfério tangencialmente no suporte da corte. Opcionalmente, pressione novamente suavemente com uma lâmina de vidro antes de corrigi-lo em posição (por exemplo, com cola). Nota: Minimize a quantidade de cola utilizada, porque artefatos de corte podem resultar devido a pequena espessura dos hemisférios achatadas.</li>
		<li>Corte o hemisfério da extremidade mais grossa e mais estável no final mais fino (posterior para anterior, aqui) a densidade desejada. Prossiga para a etapa 3.4. Nota: Se foram utilizadas concentrações de baixa fixação, corte-o em uma velocidade lenta e uma grande amplitude.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Corte o hemisfério em um micrótomo de congelação.<ol>
<li>Crioproteção o cérebro por imersão em uma solução de sacarose a 30% (em PB) até que ele afunda. Nota: Dependendo do tamanho do tecido a ser cryoprotected, afundando na solução pode variar de algumas horas a alguns dias. Para cérebros maiores podem ser considerados métodos alternativos de cryoprotection (ver. Alessandro et al 16).</li>
		<li>Forma um base sobre o micrótomo de congelação para montar o cérebro de gelo. Construa o base de gelo por congelamento PB na face do bloco do micrótomo de congelação. Crítica: Certifique-se que a superfície da base de gelo é paralela à lâmina do micrótomo. Para fazer isso, corte o gelo vazio base usando a lâmina micrótomo para alinhar exactamente a base de gelo paralela à superfície de corte.</li>
		<li>Incorporar o cérebro no meio de congelação e montá-lo no rosto de bloco do micrótomo com a área de interesse paralelo à face do bloco. Enfrenta a superfície pial do cérebro para a face do bloco do micrótomo. Crítica: Ajustar a temperatura de congelamento dependendo do tamanho da amostra; temperaturas mais altas assegurar melhor integridade de seção ao seccionamento, mas seções maiores exigem temperaturas mais baixas para congelar amostra uniformemente.</li>
		<li>Corte o cérebro tangencialmente a densidade desejada (velocidades de corte mais lento e uniforme resultam em melhor qualidade de seção).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Lave as seções em PB por 15 min em uma coqueteleira.</li>
</ol><img alt="Video Snapshot" src="/files/ftp_upload/56992/56992video1.jpg"> Vídeo 1: vídeo esquemático de corte tangencial de um córtex de rato entorhinal medial e o layout dos módulos parasubicular e entorhinal. O córtex entorhinal medial de um cérebro de roedor situa-se na extremidade posterior do córtex e se inclina para o lado medial e ventral. Tangenciais seções são obtidas por orientar uma faca ao longo deste ângulo. Por conseguinte, apropriado do tipo de célula coloração específica revela estruturas modulares no córtex entorhinal medial e parasubiculum adjacente. Vídeo adaptado do Ray e Brecht8. <a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56992/Video_1_Tangential_Procedure_MEC.mp4" target="_blank">Por favor clique aqui para ver este vídeo. (Botão direito do mouse para fazer o download.)</a>
4. visualização de módulos corticais usando coloração citocromo Oxidase
Nota: Protocolos de coloração diferentes foram desenvolvidos para histochemical deteção da atividade de citocromo oxidase, por exemplo, primeiro por Wong-Riley17 e mais tarde modificados por Divac et al 18 este protocolo é baseado de Divac et al 18, desde que o uso de sulfato de níquel-amónio (NiAS) resulta em um maior contraste e melhor módulos definidos em áreas corticais manchadas.
<ol><li>Preparar o citocromo oxidase coloração solução (ver Divac et al 18). para 10 mL da solução, adicionar: tampão de 10ml HEPES (0,1 M, pH 7,4), sacarose 400 mg, 12,5 mg NiAS, citocromo 2mg C, 6mg diaminobenzidina (DAB). Cuidado: DAB e NiAS são cancerígenos. Nota: Adicione DAB apenas antes da incubação das seções.</li>
	<li>Lave as seções em tampão HEPES (0,1 M, pH 7,4) num agitador por 15 min.</li>
	<li>Incube as seções na solução de coloração, à temperatura ambiente em um shaker. Nota: Observe a velocidade da coloração. Se não houver nenhuma reação visível, alterar a incubação a 37 ° C. Dependendo da quantidade de fixação, coloração pode ser observada após 10 min ou em várias horas.</li>
	<li>Pare a reação adicionando 4% PFA; Isso impede que re-morrendo indesejados e aumento do sinal de fundo.</li>
	<li>Lave as seções três vezes usando tampão HEPES por 10 min.</li>
	<li>Montar e secar as seções sobre lâminas de vidro.</li>
	<li>Desidrata-se as seções com uma linha crescente de álcool:<ol>
<li>Lave as lâminas em etanol a 60% por 1 min. Lave os slides em etanol a 80% por 1 min. lavar as lâminas em etanol a 96% para 2 min. lavar as lâminas em etanol 100% por 3 min. lavar as lâminas em isopropanol por 5 min. Lave os slides em xilol por 5 min.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Imediatamente adicione um meio de endurecimento-montagem rápido e adicione uma lamela. Crítica: Não use meios de montagem à base de água, como NiAS vai ser lavado para fora e degradar a coloração.</li>
	<li>Manter as seções em 4 ° C para armazenamento a longo prazo.</li>
</ol>5. visualização de módulos corticais usando coloração imuno-histoquímica
Nota: Vários protocolos estão disponíveis para imuno-histoquímica, otimizado para a amostra e o tipo de sonda. Adaptações podem ser feitas conforme necessário, por diferentes concentrações de anticorpos, agentes permeabilizing e tempos de incubação. O protocolo seguinte leva a bons resultados para a detecção de uma grande variedade de anticorpos e visualização por sondas fluorescentes.
<ol><li>Lave as seções em PBS (0,1 M, pH 7,4) por 15 min.</li>
	<li>Opcional: Executar a recuperação do antígeno para desmascarar um epítopo usando um banho de água (baseado no Jiao et al 19. o; para métodos alternativos, consulte Pileri et al 20).<ol>
<li>Pré-aqueça o banho de água a 80 ° C. Preparar o tri-sódio citrato reserva19 (pH 8.0) e aqueça-o banho de água a 80 ° C.</li>
		<li>Transferi as seções para tampão de citrato de sódio-tri. Incubar as seções por 30 min a 80 ° C</li>
		<li>Fixe as seções até à temperatura</li>
		<li>Lave as seções em PBS por 15 min.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Lave as seções duas vezes em PBS-X (0,5% Triton-X, em PBS 0,1 M) por 15 min.</li>
	<li>Bloco epitopos inespecíficos incubando-se as seções em uma solução de albumina de soro bovino (BSA; 2,5%) e Triton-X (0,75%) em PBS por 2 h.</li>
	<li>Incubar as secções no anticorpo primário, por exemplo, muscular - D28k (1:5, 000, BSA 1% em PBS-X), por 2-3 dias num agitador a 4 ° C. Nota: A diluição ideal para o anticorpo primário depende o anticorpo específico usado. Consulte informações do fabricante para obter critérios de diluição de um anticorpo específico. Múltiplos anticorpos podem ser usados juntos, mas devem ser disparados contra diferentes espécies.</li>
	<li>Lave as seções três vezes em PBS por 15 min cada.</li>
	<li>Incube as secções pernoite no anticorpo secundário (1: 200, 1% de BSA em PBS) a 4 ° C, um agitador. Nota: Vários anticorpos secundários podem ser usados em diferentes espectros se vários anticorpos primários foram utilizados.</li>
	<li>Lave o anticorpo secundário lavando as seções três vezes em PBS por 10 min cada.</li>
	<li>Montar e secar as seções sobre uma lâmina de vidro para microscopia. Nota: As seções ainda devem estar úmidas antes de montar a lamela.</li>
	<li>Aplique meio de montagem adequado para fluorescência corantes sobre as seções de tecido e uma lamela.</li>
	<li>Seque as seções por 1h.</li>
	<li>Para armazenamento a longo prazo, selar a lamela usando esmaltes e manter no escuro a 4 ° C.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Brodmann, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Vergleichende Lokalisationslehre der Grosshirnrinde in ihren Prinzipien dargestellt auf Grund des Zellenbaues. , (1909).</li><li>Naumann, R. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+reptilian+brain.">The reptilian brain.</a> Curr Biol. 25 (8), R317-R321 (2015).</li><li>Kaas, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+columns,+modules,+and+domains+in+the+neocortex+of+primates.">Evolution of columns, modules, and domains in the neocortex of primates.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (Supplement 1), 10655-10660 (2012).</li><li>Woolsey, T. 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Os autores declaram que a pesquisa foi realizada na ausência de quaisquer relações comerciais ou financeiras que poderia ser interpretado como um potencial conflito de interesses.

Modularidade no córtex cerebral foi identificada usando uma variedade de técnicas. Os primeiros estudos normalmente identificados cortical módulos ou visualizando célula regiões densas, ou uma ausência de fibras1. Utilizaram-se métodos subsequentes a presença de feixes dendríticas24, afferents de uma determinada região25, ou enriquecimento de neurotransmissores26. Aqui vamos demonstrar duas técnicas, coloração (ii) imuno-histoquímica e histoquímica de citocromo oxidase (i).
Citocromo oxidase mancha tem sido um dos métodos mais populares para visualizar módulos corticais e tem sido amplamente utilizada nos córtices sensoriais primários27,28. Ele visualiza módulos pela coloração mais escura para as áreas de maior atividade mitocondrial17, assim, agindo como um proxy para módulos anatômicos que eliciam respostas funcionais substanciais. Esse método tem sido usado para visualizar módulos corticais somatossensorial (Figura 2) e módulos corticais no córtex visual27.
Uma das desvantagens das técnicas histoquímicas tradicionais é que a sua visualização típica por microscopia de luz brilhante-campo limita o número de módulos que podem ser visualizadas simultaneamente. No entanto, métodos de imuno-histoquímica, em conjugação com sondas fluorescentes de visualização também podem ser utilizados para exibir as proteínas específicas e identificar módulos corticais. Por exemplo, talâmica afferents ao projeto de forma somatotopic córtices sensoriais. Assim, visualizando estes afferents, usando imunorreatividade VGluT2 pode também ser usado para visualizar os mapas do corpo no córtex somatossensorial primário que podemos ter visualizado usando a atividade de citocromo oxidase (Figura 2). Proteínas seletivas também podem ser usadas como marcadores celulares para identificar grupos de células geneticamente definidos. Usando a imuno-histoquímica, identificamos aglomerados de células piramidais no córtex entorhinal medial, expressando a proteína de ligação do cálcio, muscular6 (Figura 3) e determinou que os clusters de neste particular geneticamente determinado grupo de células são conservadas em toda evolução5, indicando os princípios comuns de microcircuito subjacente a sua função. Usando vários fluorophores, nós também delineados módulos complementares no córtex medial entorhinal26, demonstrando paralelos microcircuitos subjacentes a memória espacial.
Historicamente, o cérebro tem sido seccionado em um avião normal para a posição do corpo, em orientações sagitais, coronais ou horizontais. A identificação dos módulos corticais, como os campos de barril no córtex somatossensorial4 também solicitado a corte ao longo de um tangencial e, posteriormente, em preparações cortical achatadas29, embora fossem casos isolados de tal seccionamento observado muito anteriores30,31. Após a identificação do córtex barril, outros módulos corticais também foram identificados no córtex visual primário27, bem como a presença de um corpo completo mapa32 com uma representação somatotopic do corpo primário córtex somatossensorial. Seções achatadas do córtex visual de gato também revelaram a organização topográfica das colunas de orientação, sem a necessidade de reconstruções adicionais33. Modularidade cortical também tem sido demonstrada em córtices hipocampal, incluindo o presubiculum e parasubiculum26,34 e entorhinal medial córtex6. Achatamento tipicamente um objeto curvo induz distorções na topografia laminar - como pode ser observado pela multidão de projeções da superfície curvada da terra em um mapa plano35. Um método relativamente simplista para compensar parcialmente a essas distorções é com a introdução de pontos de referência em distâncias definidas antes de achatamento e então medir a distância entre eles após achatamento. Então estas marcas não só subserve em estimar quantitativamente distorções introduzidas pelo achatamento, mas também fornecem um ponto de referência fácil para alinhar as seções consecutivas. Mais aspectos cruciais para a preservação da fidelidade laminar incluem garantindo achatamento homogênea em toda a seção, e finalmente corte tangencial exatamente para o layout laminar para obter otimizado seções corticais laminares.
A visualização de módulos corticais nas seções tangenciais achatadas tem desempenhado um papel importante no revelando fascinantes relações estrutura-função no córtex cerebral. A representação topográfica das partes whisker e corpo no córtex somatossensorial primário e a presença de uma grade anatômica nos microcircuitos gerando células grade funcional nas seções corticais tangenciais achatadas revelar a intrincada microcircuitos detalhes que seriam difícil de compreender, de outras orientações. No entanto, nossas técnicas atuais fornecem apenas uma fatia bidimensional destes módulos essencialmente tridimensional. Usando técnicas de imunofluorescência e tecido limpando métodos36,37, seria possível visualizar estes módulos corticais como um todo e talvez revelar mais insights sobre nosso entendimento de mapas corticais e módulos.

Algumas das alterações mais significativas na estrutura do cérebro através de filogenia podem ser observadas no córtex cerebral. Apesar de diferenças significativas, o córtex dos animais segue um padrão comum e pode ser dividido em duas maneiras distintas, por camadas e áreas1. Camadas corticais mentem paralelas à superfície do cérebro e variam em número de 3 camadas em reptiliano córtices2 a 6 camadas em mamíferos córtices1. Áreas corticais, por outro lado, são regiões distintas do córtex, que em grande parte correspondem às funcionalidades distintas, por exemplo, o córtex somatossensorial está envolvido com a sensação de toque ou o córtex visual no processamento visuais entradas. Estas áreas corticais podem muitas vezes ser subdivididas em patches ou módulos3, que são regularmente repetindo estruturas anatômicas, encontradas essencialmente paralelas à superfície pial do cérebro. Módulos corticais podem ser confinados a uma determinada camada4ou estendem através de várias camadas5.
Métodos de corte padrão do cérebro envolvem seções normais à superfície do cérebro, como coronal ou sagital. Enquanto estes métodos podem ser usados para visualizar os módulos corticais, uma multiplicidade de características interessantes pode ser revelada quando os módulos corticais são visualizados tangencialmente, em um plano paralelo à superfície do cérebro. Por exemplo, módulos somatossensorial do cérebro de roedor representando bigodes, aparecem como barris quando visualizado normal à superfície do cérebro, e, portanto, as regiões derivam o córtex de barril de nome. No entanto, na visualização dos barris em uma orientação tangencial, eles revelam whisker-mapa, com os barris sendo colocados para fora em uma orientação topográfica espelhamento o layout dos bigodes na superfície externa do corpo. Em certos casos, o arranjo modular escapou mesmo deteção por períodos consideráveis, quando visualizado de forma não-tangencial. O córtex entorhinal medial, é conhecida pela presença de grade de células, neurônios que dispara em um padrão hexagonal regular quando um animal está atravessando um ambiente. Mesmo que seja uma área fortemente investigada, até recentemente, a presença de manchas ou módulos de células no córtex entorhinal medial, que fisicamente são dispostas em um padrão hexagonal6, tinha escapado a deteção. A presença e a disposição destes módulos, em cérebro de ratos, foi facilitada pela fazendo seções tangenciais do córtex entorhinal medial e investigar a cytoarchitecture de forma layer-wise.
Logo após o corte, o aspecto particular de visualização de módulos corticais também pode ser realizado de várias formas. Classicamente, os estudos foram delineados módulos baseados em célula densidade ou fibra layout1. Outra abordagem popular é o uso da histoquímica de citocromo oxidase, que revela as áreas de maior atividade8. Abordagens mais recentes incluem a olhar para os tipos de células geneticamente determinada, distinguidos-se com base em sua proteína expressão perfis6,8.
Neste estudo, destaca-se métodos para isolar o córtex do cérebro de mamíferos, obter secções tangenciais achatadas e Visualizar corticais módulos baseados em citocromo oxidase histoquímica e imuno-histoquímica das proteínas específicas do tipo de célula.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cytochrome oxidase staining</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytochrome c from equine heart</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C2506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3,3&#39;Diaminobenzidine tetrahydrochloride hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5637</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D(+)-Saccharose</td>
			<td>Carl Roth&#160;</td>
			<td>4621.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium nickel(II) sulfate hexahydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A1827</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Carl Roth&#160;</td>
			<td>9105.4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antigen retrieval</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trisodium citrate dihydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S1804</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citric acid monohydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1909</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffer/phosphate-buffered saline/prefix/PFA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium dihydrogen phosphate</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3904.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>9265.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Di-Sodium hydrogen phosphate dihydrate</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>4984.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>0335.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRITON-X 100</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3051.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immunohistochemistry</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calbindin D-28k puriefied from chicken gut, Mouse monoclonal</td>
			<td>Swant</td>
			<td>RRID: AB_10000347</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calbindin D-28k from recombinant rat calbindin D-28k, Rabbit polyclonal</td>
			<td>Swant</td>
			<td>RRID: AB_10000340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumin Fraction V, biotin free</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>0163.4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting or freezing media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount (immunofluorescence)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F4680</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eukitt (histochemistry)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>03989</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue freezing medium</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>NC0696746</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcohol dehydration</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 100%</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>9065.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 96%</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>P075.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Propanol</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>6752.4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene substitute</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>78475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Devices/tools</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microm HM 650V</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Jung RM2035</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #55 Forceps - Inox</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11255-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 Forceps - Inox Biology Tip</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11252-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5SF Forceps - Inox Super Fine Tip</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11252-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bone Shears - 24 cm</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>16150-24</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Friedman Rongeur</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>16000-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blunt Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14000-18</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Scissors - Large Loops</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14101-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Scissors - Sharp-Blunt</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14001-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Iris Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14094-11</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualization of cortical modules in flattened mammalian cortices

O córtex do cérebro dos mamíferos é parcellated em subestruturas distintas ou módulos. Módulos corticais normalmente mentem paralelos à folha cortical e podem ser delineados por certos métodos histoquímicos e imuno-histoquímica. Neste estudo, destaca-se um método para isolar o córtex do cérebro de mamíferos e achate-os para obter paralelo de seções para a folha de cortical. Nós ainda mais destaque selecionado histochemical e métodos de imuno-histoquímica para processar estas achatada tangenciais seções para visualizar módulos corticais. No córtex somatossensorial de vários mamíferos, realizamos a citocromo oxidase histoquímica para revelar o corpo mapas ou módulos corticais que representam diferentes partes do corpo do animal. No córtex entorhinal medial, uma área onde as células da grade são geradas, utilizamos métodos de imuno-histoquímica para destacar os módulos de neurônios geneticamente determinados, que estão dispostos em um padrão de grade na planilha de cortical através de várias espécies. No geral, nós fornecemos um quadro para isolar e preparar layer-wise achatado seções corticais e visualize corticais módulos usando histochemical e métodos de imuno-histoquímica em uma ampla variedade de cérebros de mamíferos.

Nós obtidos achatadas seções corticais do córtex somatossensorial em uma variedade de cérebros e processadas para citocromo oxidase histoquímica Visualizar os módulos de somatotopic que representam diferentes partes do corpo. Esta abordagem comparativa permite estudar as forças evolutivas que córtex de forma, por exemplo, mostrando a representação altamente conservada de vibrissae mystacial em roedores e lagomorfos como barris21 (Figura 2). Em contraste, outras partes do corpo como as patas e órgãos genitais mostram variações na sua parente tamanho e refletem a especialização para um nicho ecológico ou a seleção sexual22,23.
Para compreender a arquitetura do córtex entorhinal medial, obtivemos paralelo seções à superfície pial. Isto foi conseguido principalmente pela corte tangencial do córtex entorhinal medial em camundongos, ratos e morcegos egípcios. Em humanos, por causa do tamanho consideravelmente maior e mais ondulações no córtex entorhinal, nós achatada suavemente o córtex posterior fazendo um corte tangencial do córtex entorhinal. Posteriormente, todos os cérebros foram criopreservados e seccionados em um criostato a 60 µm. imuno-histoquímica foi realizada nas seções obtidas com um anticorpo antimuscular, para visualizar os módulos de célula piramidal muscular-positivo no entorhinal medial córtex5 (Figura 3). Os módulos-muscular no córtex entorhinal mostram uma notável periodicidade entre todos estes cérebros e variam em tamanho, por apenas um fator de 10 em ~ 20,000-fold variação no cérebro tamanhos5.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56992/56992fig2.jpg"> Figura 2: disposição topográfica dos módulos de córtex de barril em mamíferos identificados pelo citocromo oxidase histoquímica. Tangenciais seções de IV da camada do córtex somatossensorial do rato (A) gerbil da Mongólia (B), rato (C), Duarte (D), (E) hamster, coelho (F), mostrando barris como um somatotopic altamente conservada representação de vibrissae o mystacial. Escala de barras = 500 µm. m: Medial, Lateral l:, r: Rostral c: Caudal; Orientação na aplica-se também a B-E. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56992/56992fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56992/56992fig3.jpg"> Figura 3: layout periódica dos módulos do córtex entorhinal medial em mamíferos identificados por muscular imunorreatividade. Tangenciais seções da camada II do córtex entorhinal medial do rato (A), (B) rato, morcego egípcio (C) e (D) humana, mostrando um layout conservado periódico dos módulos de célula piramidal muscular-positivo. Escala de barras = 250 µm. m: Medial, Lateral l:, d: dorsais, ventrais v:, r: Rostral, c: Caudal; Orientação em D também se aplica a B, C. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56992/56992fig3large.jpg" target="_blank">por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Visualization of Cortical Modules in Flattened Mammalian Cortices

Este artigo descreve uma metodologia detalhada para obter secções tangenciais achatadas de mamíferos córtices e Visualizar módulos corticais usando histochemical e métodos de imuno-histoquímica.

Visualização de módulos corticais em córtices mamíferos achatadas

The cortex of mammalian brains is parcellated into distinct substructures or modules. Cortical modules typically lie parallel to the cortical sheet, and ...

visualization-of-cortical-modules-in-flattened-mammalian-cortices

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

12.7K visualizações.  Humboldt University of Berlin. Este artigo descreve uma metodologia detalhada para obter secções tangenciais achatadas de mamíferos córtices e Visualizar módulos corticais usando histochemical e métodos de imuno-histoquímica.

Vídeo: Visualization of Cortical Modules in Flattened Mammalian Cortices

Visualization of Larval Segmental Nerves in 3rd Instar Drosophila Larval Preparations

Drosophila melanogaster is emerging as a powerful model system for studying the development and function of the nervous system, particularly because of its convenient genetics and fully sequenced genome. Additionally, the larval nervous system is an ideal model system to study mechanisms of axonal transport as the larval segmental nerves contain bundles of axons with their cell bodies located within the brain and their nerve terminals ending along the length of the body. Here we describe the procedure for visualization of synaptic vesicle proteins within larval segmental nerves. If done correctly, all components of the nervous system, along with associated tissues such as muscles and NMJs, remain intact, undamaged, and ready to be visualized. 3rd instar larvae carrying various mutations are dissected, fixed, incubated with synaptic vesicle antibodies, visualized and compared to wild type larvae. This procedure can be adapted for several different synaptic or neuronal antibodies and changes in the distribution of a variety of proteins can be easily observed within larval segmental nerves.

Visualization of Larval Segmental Nerves in 3rd Instar Drosophila Larval Preparations

Drosophila melanogaster larvae provide an ideal model system to investigate the mechanisms of axonal transport within larval segmental nerves. Using this procedure, 3rd instar larvae carrying various mutations can be compared to wild type larvae.

Visualização de Larval Nervos segmentar em 3 Rd Instar Drosophila Preparações larval

Drosophila melanogaster is emerging as a powerful model system for studying the development and function of the nervous system, particularly because of ...

Neurociência

In vivo Visualization of Synaptic Vesicles Within Drosophila Larval Segmental Axons

Elucidating the mechanisms of axonal transport has shown to be very important in determining how defects in long distance transport affect different neurological diseases. Defects in this essential process can have detrimental effects on neuronal functioning and development. We have developed a dissection protocol that is designed to expose the Drosophila larval segmental nerves to view axonal transport in real time. We have adapted this protocol for live imaging from the one published by Hurd and Saxton (1996) used for immunolocalizatin of larval segmental nerves. Careful dissection and proper buffer conditions are critical for maximizing the lifespan of the dissected larvae. When properly done, dissected larvae have shown robust vesicle transport for 2-3 hours under physiological conditions. We use the UAS-GAL4 method 1 to express GFP-tagged APP or synaptotagmin vesicles within a single axon or many axons in larval segmental nerves by using different neuronal GAL4 drivers. Other fluorescently tagged markers, for example mitochrondria (MitoTracker) or lysosomes (LysoTracker), can be also applied to the larvae before viewing. GFP-vesicle movement and particle movement can be viewed simultaneously using separate wavelengths.

In vivo Visualization of Synaptic Vesicles Within Drosophila Larval Segmental Axons

This protocol discusses the live dissection of Drosophila larvae for the purpose of imaging the movement of GFP tagged axonal vesicles on microtubule tracks.

Em Visualization vivo das vesículas sinápticas Dentro Drosophila larval Axônios segmentar

Elucidating the mechanisms of axonal transport has shown to be very important in determining how defects in long distance transport affect different ...

Automated Interactive Video Playback for Studies of Animal Communication

Video playback is a widely-used technique for the controlled manipulation and presentation of visual signals in animal communication. In particular, parameter-based computer animation offers the opportunity to independently manipulate any number of behavioral, morphological, or spectral characteristics in the context of realistic, moving images of animals on screen. A major limitation of conventional playback, however, is that the visual stimulus lacks the ability to interact with the live animal. Borrowing from video-game technology, we have created an automated, interactive system for video playback that controls animations in response to real-time signals from a video tracking system. We demonstrated this method by conducting mate-choice trials on female swordtail fish, Xiphophorus birchmanni. Females were given a simultaneous choice between a courting male conspecific and a courting male heterospecific (X. malinche) on opposite sides of an aquarium. The virtual male stimulus was programmed to track the horizontal position of the female, as courting males do in the wild. Mate-choice trials on wild-caught X. birchmanni females were used to validate the prototype's ability to effectively generate a realistic visual stimulus.

Video playback is a widely used technique in animal behavior. We created and evaluated a program that applies rules-based, interactive playback of 3-D computer animations in response to real-time, automated data on subject behavior.

Reprodução de vídeo automatizada interativo para estudos da comunicação animal

Video playback is a widely-used technique for the controlled manipulation and presentation of visual signals in animal communication. In particular, ...

Functional Calcium Imaging in Developing Cortical Networks

A hallmark pattern of activity in developing nervous systems is spontaneous, synchronized network activity. Synchronized activity has been observed in intact spinal cord, brainstem, retina, cortex and dissociated neuronal culture preparations. During periods of spontaneous activity, neurons depolarize to fire single or bursts of action potentials, activating many ion channels. Depolarization activates voltage-gated calcium channels on dendrites and spines that mediate calcium influx. Highly synchronized electrical activity has been measured from local neuronal networks using field electrodes. This technique enables high temporal sampling rates but lower spatial resolution due to integrated read-out of multiple neurons at one electrode. Single cell resolution of neuronal activity is possible using patch-clamp electrophysiology on single neurons to measure firing activity. However, the ability to measure from a network is limited to the number of neurons patched simultaneously, and typically is only one or two neurons. The use of calcium-dependent fluorescent indicator dyes has enabled the measurement of synchronized activity across a network of cells. This technique gives both high spatial resolution and sufficient temporal sampling to record spontaneous activity of the developing network.
A key feature of newly-forming cortical and hippocampal networks during pre- and early postnatal development is spontaneous, synchronized neuronal activity (Katz &amp; Shatz, 1996; Khaziphov &amp; Luhmann, 2006). This correlated network activity is believed to be essential for the generation of functional circuits in the developing nervous system (Spitzer, 2006). In both primate and rodent brain, early electrical and calcium network waves are observed pre- and postnatally in vivo and in vitro (Adelsberger et al., 2005; Garaschuk et al., 2000; Lamblin et al., 1999). These early activity patterns, which are known to control several developmental processes including neuronal differentiation, synaptogenesis and plasticity (Rakic &amp; Komuro, 1995; Spitzer et al., 2004) are of critical importance for the correct development and maturation of the cortical circuitry.
In this JoVE video, we demonstrate the methods used to image spontaneous activity in developing cortical networks. Calcium-sensitive indicators, such as Fura 2-AM ester diffuse across the cell membrane where intracellular esterase activity cleaves the AM esters to leave the cell-impermeant form of indicator dye. The impermeant form of indicator has carboxylic acid groups which are able to then detect and bind calcium ions intracellularly.. The fluorescence of the calcium-sensitive dye is transiently altered upon binding to calcium. Single or multi-photon imaging techniques are used to measure the change in photons being emitted from the dye, and thus indicate an alteration in intracellular calcium. Furthermore, these calcium-dependent indicators can be combined with other fluorescent markers to investigate cell types within the active network.

Spontaneous activity of developing neuronal networks can be measured using AM-ester forms of calcium-sensitive indicator dyes. Changes in intracellular calcium, indicating neuronal activation, are detected as transient changes in indicator fluorescence with one- or two-photon imaging. This protocol can be adapted for a range of developmentally-dependent neuronal networks in vitro.

Imagem de cálcio funcional em desenvolvimento de redes Cortical

A hallmark pattern of activity in developing nervous systems is spontaneous, synchronized network activity. Synchronized activity has been observed in ...

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other insects proprioception is provided by specialized sensory organs termed chordotonal organs (ChOs) 2. Like many other organs in Drosophila, ChOs develop twice during the life cycle of the fly. First, the larval ChOs develop during embryogenesis. Then, the adult ChOs start to develop in the larval imaginal discs and continue to differentiate during metamorphosis.
The development of larval ChOs during embryogenesis has been studied extensively 10,11,13,15,16. The centerpiece of each ChO is a sensory unit composed of a neuron and a scolopale cell. The sensory unit is stretched between two types of accessory cells that attach to the cuticle via specialized epidermal attachment cells 1,9,14. When a fly larva moves, the relative displacement of the epidermal attachment cells leads to stretching of the sensory unit and consequent opening of specific transient receptor potential vanilloid (TRPV) channels at the outer segment of the dendrite 8,12. The elicited signal is then transferred to the locomotor central pattern generator circuit in the central nervous system.
Multiple ChOs have been described in the adult fly 7. These are located near the joints of the adult fly appendages (legs, wings and halters) and in the thorax and abdomen. In addition, several hundreds of ChOs collectively form the Johnston's organ in the adult antenna that transduce acoustic to mechanical energy 3,5,17,4.
In contrast to the extensive knowledge about the development of ChOs in embryonic stages, very little is known about the morphology of these organs during larval stages. Moreover, with the exception of femoral ChOs 18 and Johnston's organ, our knowledge about the development and structure of ChOs in the adult fly is very fragmentary.
Here we describe a method for staining and visualizing ChOs in third instar larvae and pupae. This method can be applied together with genetic tools to better characterize the morphology and understand the development of the various ChOs in the fly.

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

A method to immunostain and visualize chordotonal organs in larvae and pupae of Drosophila melanogaster is described.

Visualização de Propriocepção em<em&gt; Drosophila</em&gt; As larvas e pupas

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other ...

Isolation and Culture of Mouse Cortical Astrocytes

Astrocytes are an abundant cell type in the mammalian brain, yet much remains to be learned about their molecular and functional characteristics. In vitro astrocyte cell culture systems can be used to study the biological functions of these glial cells in detail. This video protocol shows how to obtain pure astrocytes by isolation and culture of mixed cortical cells of mouse pups. The method is based on the absence of viable neurons and the separation of astrocytes, oligodendrocytes and microglia, the three main glial cell populations of the central nervous system, in culture. Representative images during the first days of culture demonstrate the presence of a mixed cell population and indicate the timepoint, when astrocytes become confluent and should be separated from microglia and oligodendrocytes. Moreover, we demonstrate purity and astrocytic morphology of cultured astrocytes using immunocytochemical stainings for well established and newly described astrocyte markers. This culture system can be easily used to obtain pure mouse astrocytes and astrocyte-conditioned medium for studying various aspects of astrocyte biology.

Astrocytes have been recognized to be versatile cells participating in fundamental biological processes that are essential for normal brain development and function, and central nervous system repair. Here we present a rapid procedure to obtain pure mouse astrocyte cultures to study the biology of this major class of central nervous system cells.

Isolamento e Cultura de astrócitos corticais de rato

Astrocytes  are an abundant cell type in the mammalian brain, yet much remains to be  learned about their molecular and functional characteristics. In ...

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety of brain disorders1,2. To better understand the mechanisms by which brain circuits react to an animal's experience requires the ability to monitor the experience-dependent molecular changes in a given set of neurons, over a prolonged period of time, in the live animal. While experience and associated neural activity is known to trigger gene expression changes in neurons1,2, most of the methods to detect such changes do not allow repeated observation of the same neurons over multiple days or do not have sufficient resolution to observe individual neurons3,4. Here, we describe a method that combines in vivo two-photon microscopy with a genetically encoded fluorescent reporter to track experience-dependent gene expression changes in individual cortical neurons over the course of day-to-day experience. 
One of the well-established experience-dependent genes is Activity-regulated cytoskeletal associated protein (Arc)5,6. The transcription of Arc is rapidly and highly induced by intensified neuronal activity3, and its protein product regulates the endocytosis of glutamate receptors and long-term synaptic plasticity7. The expression of Arc has been widely used as a molecular marker to map neuronal circuits involved in specific behaviors3. In most of those studies, Arc expression was detected by in situ hybridization or immunohistochemistry in fixed brain sections. Although those methods revealed that the expression of Arc was localized to a subset of excitatory neurons after behavioral experience, how the cellular patterns of Arc expression might change with multiple episodes of repeated or distinctive experiences over days was not investigated. 
In vivo two-photon microscopy offers a powerful way to examine experience-dependent cellular changes in the living brain8,9. To enable the examination of Arc expression in live neurons by two-photon microscopy, we previously generated a knock-in mouse line in which a GFP reporter is placed under the control of the endogenous Arc promoter10. This protocol describes the surgical preparations and imaging procedures for tracking experience-dependent Arc-GFP expression patterns in neuronal ensembles in the live animal. In this method, chronic cranial windows were first implanted in Arc-GFP mice over the cortical regions of interest. Those animals were then repeatedly imaged by two-photon microscopy after desired behavioral paradigms over the course of several days. This method may be generally applicable to animals carrying other fluorescent reporters of experience-dependent molecular changes4.

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

Experience-dependent molecular changes in neurons are essential for the brain's ability to adapt in response to behavioral challenges. An in vivo two-photon imaging method is described here that allows the tracking of such molecular changes in individual cortical neurons through genetically encoded reporters.

Vivo em dois fótons de imagem de experiência dependentes de alterações moleculares em neurônios corticais

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety ...

Subtype-selective Electroporation of Cortical Interneurons

The study of central nervous system (CNS) maturation relies on genetic targeting of neuronal populations. However, the task of restricting the expression of genes of interest to specific neuronal subtypes has proven remarkably challenging due to the relative scarcity of specific promoter elements. GABAergic interneurons constitute a neuronal population with extensive genetic and morphological diversity. Indeed, more than 11 different subtypes of GABAergic interneurons have been characterized in the mouse cortex1. Here we present an adapted protocol for selective targeting of GABAergic populations. We achieved subtype selective targeting of GABAergic interneurons by using the enhancer element of the homeobox transcription factors Dlx5 and Dlx6, homologues of the Drosophila distal-less (Dll) gene2,3, to drive the expression of specific genes through in utero electroporation.

This procedure shows how to target interneurons in the developing mouse forebrain by means of in utero electroporation. This technique was particularly efficient to achieve selective gene expression in interneuron subtypes destined to the superficial layers of the cortex.

Subtipo seletivo Eletroporação de Cortical Interneurônios

The study of central nervous system (CNS) maturation relies on genetic targeting of neuronal populations. However, the task of restricting the expression ...

Quantification of Filamentous Actin (F-actin) Puncta in Rat Cortical Neurons

Filamentous actin protein (F-actin) plays a major role in spinogenesis, synaptic plasticity, and synaptic stability. Changes in dendritic F-actin rich structures suggest alterations in synaptic integrity and connectivity. Here we provide a detailed protocol for culturing primary rat cortical neurons, Phalloidin staining for F-actin puncta, and subsequent quantification techniques. First, the frontal cortex of E18 rat embryos are dissociated into low-density cell culture, then the neurons grown in vitro for at least 12-14 days. Following experimental treatment, the cortical neurons are stained with AlexaFluor 488 Phalloidin (to label the dendritic F-actin puncta) and microtubule-associated protein 2 (MAP2; to validate the neuronal cells and dendritic integrity). Finally, specialized software is used to analyze and quantify randomly selected neuronal dendrites. F-actin rich structures are identified on second order dendritic branches (length range 25-75 &#181;m) with continuous MAP2 immunofluorescence. The protocol presented here will be a useful method for investigating changes in dendritic synapse structures subsequent to experimental treatments.

Quantification of Filamentous Actin F-actin Puncta in Rat Cortical Neurons

Filamentous actin (F-actin) plays an important role in spinogenesis, synaptic plasticity, and synaptic stability. Quantification of F-actin puncta is therefore a useful tool to study the integrity of synaptic structures. This protocol describes the procedures of quantifying F-actin puncta labeled with Phalloidin in low-density primary cortical neuronal cultures.

Quantificação de filamentosas actina (F-actina) puncta no Rat neurônios corticais

Filamentous actin protein (F-actin) plays a major role in spinogenesis, synaptic plasticity, and synaptic stability. Changes in dendritic F-actin rich ...

Visualization of Thalamocortical Axon Branching and Synapse Formation in Organotypic Cocultures

Axon branching and synapse formation are crucial processes for establishing precise neuronal circuits. During development, sensory thalamocortical (TC) axons form branches and synapses in specific layers of the cerebral cortex. Despite the obvious spatial correlation between axon branching and synapse formation, the causal relationship between them is poorly understood. To address this issue, we recently developed a method for simultaneous imaging of branching and synapse formation of individual TC axons in organotypic cocultures.
This protocol describes a method which consists of a combination of an organotypic coculture and electroporation. Organotypic cocultures of the thalamus and cerebral cortex facilitate gene manipulation and observation of axonal processes, preserving characteristic structures such as laminar configuration. Two distinct plasmids encoding DsRed and EGFP-tagged synaptophysin (SYP-EGFP) were co-transfected into a small number of thalamic neurons by an electroporation technique. This method allowed us to visualize individual axonal morphologies of TC neurons and their presynaptic sites simultaneously. The method also enabled long-term observation which revealed the causal relationship between axon branching and synapse formation.

This protocol describes a method for simultaneous imaging of thalamocortical axon branching and synapse formation in organotypic cocultures of the thalamus and cerebral cortex. Individual thalamocortical axons and their presynaptic terminals are visualized by a single cell electroporation technique with DsRed and GFP-tagged synaptophysin.

Visualização do axônio Thalamocortical ramificação e sinapse formação em Organotypic Cocultures

Axon branching and synapse formation are crucial processes for establishing precise neuronal circuits. During development, sensory thalamocortical (TC) ...