この作品は、神経変性疾患 (DZNE) は、ドイツ連邦教育省および研究 (BMBF、Förderkennzeichen の zu ベルリンのフンボルト大学, 計算の神経科学のベルリンのための Bernstein の中心, ドイツ語センターによって支えられました。01GQ1001A)、NeuroCure とゴットフリート ・ ヴィルヘルム ・ ライプニッツ賞 DFG。優れたグラフィック デザインの平石山とユリアーネ Diederichs の優秀なテクニカル サポートに感謝します

すべての実験の手順は、ローカル倫理委員会 (LaGeSo) の監督の下で動物福祉に関するドイツのガイドラインに従って行われました。人間バット脳データはナウマンらから派生した、5雄 Wistar ラットに次の手順を実行 (ひずみ: RJHan:WI)。
1. 血流と脳領域抽出
注: 既存固定と血液-無料脳を得るために動物の transcardial 潅流推奨されています、残血は染色中に非特異的バック グラウンド信号を増加。それにもかかわらず、それも非灌流標本からフラットなセクションを取得し、それらを染色可能です。試料の取り扱いの容易さは、使用される定着剤の濃度によって異なります。あまり固定の平坦化、切削、高すぎる濃度平坦化のための柔軟性と染色の信号の品質を下げるしながら脳への損傷のリスクが高まります。
<ol><li>Transcardially は、23 G 針を使用して、動物を灌流します。詳細なガイドは、ゲージらを参照してください。9<ol>
<li>リン酸バッファー生理食塩水10 (PBS; 0.02 M; pH 7.4) 脳と動物の体から血を洗い流すために使用します。注入液が明確な少なくとも 150 ml の PBS 血管系を介して注入されて表示されるまで続行します。 注: 最良の結果が灌流されている動物の生理的血圧の範囲に類似した圧力で達成が (例えばラット: 120-130 mmHg)。必要に応じて、血液凝固11を避けるためにソリューションにヘパリン (10 U/mL) を追加します。</li>
		<li>脳を修正する transcardially を吹き込む 100 mL パラホルムアルデヒド12の最小値 (4 %pfa で 0.1 M のリン酸バッファー (PB)13) 動物の首が硬いまで。 注意: PFA は、潜在的な発がん性物質です。 注: 組織化学的活性染色、チトクロム酸化酵素などのように最高の結果を達成、2% を使用する場合 PFA。他の染色、免疫組織化学など 4 %pfa が好ましい。</li>
	</ol>
</li>
	<li>頭蓋骨から脳を抽出します。 注: 表示計ら詳細については9 。<ol>
<li>大きなはさみまたは骨鋏を使用して頭を分離します。</li>
		<li>良いはさみを使用して鼻に首から正中線に沿って皮膚をカットしました。頭蓋骨を公開する肌を離れて引っ張る。首と罰金のはさみを使用して筋を削除します。</li>
		<li>頭頂骨まで後頭から始まって interparietal の骨を切って正中線を作る。</li>
		<li>Interparietal 骨をはがすには、Rongeurs を使用します。矢状縫合線に沿って高級ハサミをスライドさせ、頭頂の後端から、頭骨の前方の端にカットします。</li>
		<li>頭頂と頭骨をはがす、Rongeurs を使用します。また、鉗子を使って骨を持ち上げて取り外します。スプーンを使用して、腹側神経索を切断して脳を外します。脳を PB (0.1 M; pH 7.4) に転送します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>4% 浸漬によって非灌流脳を修正 4 ° C で 1-3 h の PFA (脳の大きさとプローブによって: じゃじゃ馬: ~ 1 h、人間: 〜 3 h)。 : 注大規模な人間のような gyrencephalic 脳分離固定時間を減らすために関心のある領域を切り取ると。</li>
	<li>セクションで大きな皮質領域を得るためには、さらに後固定; する前に脳を平らにします。手順 2 に進みます。内側嗅のような領域に到達するための困難のセクションを取得する修正 4% 脳後手順 2 に進む前に 24 h の PFA。</li>
</ol>2. 脳の解剖と平坦化
<ol><li>かみそりの刃 (lissencephalic 頭脳) またはメス (gyrencephalic 脳) を使用して脳の半球を区切ります。 注: 脳を後解決されていない場合、処理による損傷を受けやすいです。</li>
	<li>以降のセクションの登録と収縮の推定を支援するための省略可能な手順:<ol>
<li>35 G 針は皮質表面に垂直で、非金利部皮質を穿刺します。2 回皮質シートに沿って定義された距離で手順を繰り返します。皮質のシートに沿った距離を決定するため (例えば、5 mm) 固定長でカット済みスレッドを使用し、穿刺のポイントを決定する大脳皮質の表面に沿ってレイアウトします。</li>
	</ol>
</li>
	<li>Lissencephalic 脳: 解離性ヘラを使用して皮質下構造を削除します。重要: 脳の全体の手順中 PB (0.1 M; pH 7.4) と潤いを保ちます。<ol>
<li>小脳に脳を保持、脳梁で郭清の面を開くにヘラをゆっくり挿入します。ヘラの先丸は、大脳皮質から指摘しなければなりません。</li>
		<li>さらにヘラをスライドさせ、へらは視床と皮質の間まで丁寧に引き抜きます。動を傷の独立した皮質下構造。</li>
		<li>でも厚さの半球を検査します。 注: 任意の不均一な領域のトランス レイヤー グラデーションに断面中とあります。接線断面、脳をきれいにカットをする接線方向のセクションを希望する地域の軟膜表面に平行にメスを使用します。</li>
		<li>統合化の品質を改善するためにオプションの手順:<ol>
<li>横方向領域の皮質の厚さは増加するので、線条体、側坐核、眼窩前頭皮質、きれいにカットをします。また、皮質の内側部分の展開を可能にする前頭前野の内側の領域の基地で緩和のカットを追加します。</li>
		</ol>
</li>
		<li>スライド ガラスの半球 (前野下向き) を配置します。2.6 の手順に進みます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>Gyrencephalic 脳: 下前を展開する白質を削除 (詳細なプロトコルを参照してください: 染色ら14;Tootell、シルバーマンの15)。重要: 使用 PB (0.1 M; pH 7.4) 脳を湿った保つことすべての時。<ol>
<li>上向き皮質と大型ペトリ皿で湿らせたろ紙に関心のある分野を置きます。</li>
		<li>クモ膜と 2 つの鉗子を使用して pia を取り外します。</li>
		<li>湿った綿棒を使用して、優しく脳回の間の癒着をデタッチするそれぞれの溝に挿入します。</li>
		<li>別の湿らせたろ紙を使用して脳を好転します。</li>
		<li>1 つの脳回を展開するのに 2 つの湾曲したマイクロ ヘラを使用します。回の凹面の端に到達するまで離れて白質をいじめるにヘラの凸側を使用します。湿った綿棒を使用して、前回の凹面の端に達する旋回運動に進みます。</li>
		<li>離れて 1 つの脳回をいじめます。必要であれば、テンションが高すぎる場合にカット小さな緩和を追加します。</li>
		<li>ペトリ皿または類似のコンテナーに展開された脳を平らにします。</li>
	</ol>
</li>
	<li>地域乾かさないように、フィルター紙のスポンジに大きな脳を必要に応じて、配置します。</li>
	<li>両側に粘土の 2 つの圧延作品を配置します。重大: 粘土の厚さどのくらい半球を平坦化することが定義されているように、粘土が 10-20% である非平坦化された皮質よりも薄い。</li>
	<li>半球が完全にフラットになるまでに大脳皮質を軽く第 2 ガラス スライド/小さなシャーレを押してください。目的の地域の最高の結果を得るためには、それぞれの区域の最初ガラス スライドを配置します。Lissencephalic 脳の最良の結果を得るためには、まず外側部分にスライド ガラスを接線方向配置し、この地域に集中して圧力をかけます。</li>
	<li>ガラス スライド/シャーレに (例えば、セラミック時計ガラス) 体重をかけるし、PB の 4 ° C で 3-5 h の半球を平らに。</li>
	<li>ポスト固定圧力を解放し、ガラス スライドを削除します。4 ° C でシェーカーの PFA (浮遊) に 24 h の平たい半球を置く 注: 1% を使用する場合、組織化学的活性染色の最良の結果を達成、PFA。他の染色、免疫組織化学、非灌流脳、PFA を使用ことができます 2% など。</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56992/56992fig1.jpg"> 図 1: ラット大脳皮質半球と体性感覚野におけるモジュールの可視化の平坦化のためのワークフローの略図。マウスの脳の解剖 transcardial 潅流後 (A)。皮質下構造除去し、皮質のリン酸バッファー (B) の 2 つのガラス スライド間フラット化されました。平たい半球 (C) だった後固定、接線方向断面およびチトクロム酸化酵素活性 (D) のステンド グラスします。スケール バー = 1 cm。 r: c: Caudal Rostral l: 横、m: 内側。Lauer 氏らから適応図23<a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56992/56992fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
3. 切削接線セクション
注: プロトコルを汚すの要件に応じて切削手順と厚み合わせることができます。80-150 μ m でさらに組織化学的処理 (手順 3.2) の半球をカットする、vibratome を使いました。ただし、免疫組織化学的処理薄いセクションが望まれ、凍結ミクロトームを用いて断面 (3.3) でステップ 10-60 μ m。ビデオ 1を参照してください。
<ol><li>PB でフラットな半球を洗う (0.1 m; pH 7.4) 15 分。</li>
	<li>Vibratome に半球をカットします。<ol>
<li>半球をスライス ホルダーに接線方向に配置します。必要に応じて、もう一度を押します (例えば、瞬間接着剤で) の位置に固定する前にスライド グラスで軽く。 注: は、平面的な半球の小さい厚さのため切削アイテム可能性がありますので接着剤の使用量を最小化します。</li>
		<li>必要な厚さに薄く終盤 (前方、後方はこちら) より厚くより安定した端から半球をカットします。3.4 の手順に進みます。 注: 固定の低濃度が使用された場合遅い速度と高振幅でカットします。</li>
	</ol>
</li>
	<li>凍結ミクロトームに半球をカットします。<ol>
<li>Cryoprotect まで (PB) で 30% ショ糖溶液に浸漬することによって脳は沈みます。 注: cryoprotected をされている組織のサイズ、に応じてソリューションに沈むまで数時間から数日。大きな脳の代替に対する凍害保護作用方法が考えられる (Roseneらを参照してください。16)。</li>
		<li>氷の脳をマウントする凍結ミクロトームの基本を形成します。凍結ミクロトームのブロックの顔に PB を凍結して氷の基本を構築します。重要: は、氷の基地の表面はミクロトームの刃に平行を確認します。これを行うには、空の氷をミクロトームの刃を使用して切削表面に平行氷の基地が正確に整列するは基本のカットに。</li>
		<li>凍結中の脳を埋め込み、ブロック面に平行の関心の領域にミクロトームのブロックの顔にそれをマウントします。ミクロトームのブロックの顔に向かって脳の軟膜表面に直面します。重要: サンプル サイズに応じて凍結温度を調整します。高い温度は、断面中より良いセクションの整合性を確保するが、大きいセクションには、サンプルを均一に固定するのには低温が必要があります。</li>
		<li>接線方向 (セクションの最高品質、低速かつ一定の切削速度) 必要な厚さで脳をカットします。</li>
	</ol>
</li>
	<li>PB のシェーカーで 15 分間のセクションを洗います。</li>
</ol><img alt="Video Snapshot" src="/files/ftp_upload/56992/56992video1.jpg"> ビデオ 1: 接線断面ラット内側嗅と parasubicular と嗅内皮質モジュールのレイアウトからのスケマティック ビデオ。齧歯動物の脳の内側嗅皮質の後部の端にある、内側と腹側に向かって傾いています。接線方向のセクションを取得するには、この角度でナイフを定位します。その結果、適切な細胞型特異染色内側嗅と隣接する parasubiculum のモジュラー構造を明らかにします。ビデオ レイとブレヒトの8から適応。<a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56992/Video_1_Tangential_Procedure_MEC.mp4" target="_blank">してくださいここをクリックしてこのビデオを表示します。(右クリックしてダウンロード)</a>
4. チトクロム酸化酵素染色を用いた皮質モジュールの可視化
注: 異なるプロトコルを汚すウォン ライリー17 例えば、チトクロム酸化酵素活性の組織化学的検出のため開発され Divacらによって後で変更18このプロトコル Divacらによるものに基づいて18、硫酸ニッケル アンモニウム (NiAS) を使用するのでより高いコントラストと汚された皮質領域でより良い定義されたモジュールの結果します。
<ol><li>チトクロム酸化酵素染色液の準備 (Divacらを参照してください。18). 溶液 10 mL、追加: 10 mL HEPES 緩衝液 (pH 7.4 0.1 M) 400 mg ショ糖、12.5 mg、ニアス 2 mg シトクロム C、6 mg ジアミノベンジジン (軽打)。 注意: DAB とニアス発癌性があります。 注: セクションの孵化直前に軽打を追加します。</li>
	<li>15 分のシェーカーに HEPES 緩衝液 (0.1 M、pH 7.4) のセクションを洗います。</li>
	<li>シェーカーで室温で染色液でセクションを孵化させなさい。 注: は、染色速度を観察します。目に見える反応がない場合は 37 ° C で培養に変更します。固定量に応じて染色観察できますまたはいくつかの時間で 10 分後。</li>
	<li>4% の追加によって反作用を停止 PFA;不要な再死ぬとバック グラウンド信号の増加がなくなります。</li>
	<li>HEPES 緩衝液を使用して 10 分の 3 つのセクションを洗います。</li>
	<li>マウントし、スライド ガラス上のセクションを乾燥します。</li>
	<li>増加のアルコール行とセクションを脱水します。<ol>
<li>80% エタノールで、96% のエタノールでスライドを洗う 1 分 2 分 3 分 5 分 5 分のキシレンでスライドを洗うためにイソプロパノールでスライドを洗うために 100% エタノールでスライドを洗うためのスライドを 1分間洗浄 60% エタノールでスライドに洗ってください。</li>
	</ol>
</li>
	<li>すぐに、迅速な硬化取付中と観察を追加します。重要: はニアスが洗い流される染色が低下すると、この水ベース マウント メディアは使用しないでください。</li>
	<li>長期的なストレージ 4 ° C でのセクションを保ちます。</li>
</ol>5. 免疫組織化学染色を用いた皮質モジュールの可視化
注: 複数のプロトコル、免疫組織化学、最適な試料とプローブの種類にことがあります。適応を行うことができます必要に応じて、さまざまな濃度の抗体、構造のエージェント、およびインキュベーション時間によって。次のプロトコルは、蛍光プローブによる抗体と可視化の広い範囲を検出するための良い結果に します。
<ol><li>15 分間 (0.1 M; pH 7.4) PBS のセクションを洗います。</li>
	<li>オプション: (焦らに基づく水槽を併用したエピトープの正体を暴露する抗原検索を実行します。19;代替方法は、Pileriらを参照してください。20)。<ol>
<li>80 ° C の水浴を予熱します。三ナトリウム クエン酸バッファー19 (pH 8.0) を準備し、80 ° C の水浴で予熱</li>
		<li>セクションをトライ ナトリウム クエン酸バッファーに転送します。80 ° C で 30 分のセクションを孵化させなさい</li>
		<li>部屋の温度の下にセクションを冷却します。</li>
		<li>15 分のための PBS でセクションを洗います。</li>
	</ol>
</li>
	<li>2 回で PBS X セクションを洗う (0.5 %0.1 M PBS でトリトン X) 15 分。</li>
	<li>2 h のウシ血清アルブミン (BSA; 2.5%) とトリトン X (0.75%) を PBS でのソリューションのセクションの孵化によって不明確なエピトープをブロックします。</li>
	<li>一次抗体を例えばカルビンジン-D28k のセクションを孵化させなさい (1:5, 000 PBS x 1 %bsa)、4 ° C でシェーカーの 2-3 日間 注: 一次抗体の希釈使用特定の抗体に依存します。特定の抗体の希釈条件を入手する製造元の情報を参照してください。複数の抗体は一緒に使用することができますが、別の種に対して提起する必要があります。</li>
	<li>3 回 15 分 PBS でセクションを洗います。</li>
	<li>二次抗体 (1: 200、PBS で 1 %bsa) シェーカーの 4 ° c で一晩セクションを孵化させなさい。 注: 複数の二次抗体は複数の一次抗体を使用した場合、異なるスペクトルで使用できます。</li>
	<li>3 回 10 分ずつの PBS でセクションを洗浄することにより二次抗体を洗浄します。</li>
	<li>マウント、顕微鏡用スライド ガラス上のセクションを乾燥します。 注: セクションは、coverslip をマウントする前に湿ったはずです。</li>
	<li>組織切片を蛍光染料に適したメディアをマウントを適用し、観察を適用します。</li>
	<li>1 h のセクションを乾燥させます。</li>
	<li>長期的なストレージ、マニキュアを使用 coverslip のシールし、4 ° C で暗闇の中で保持</li>
</ol>

<ol>
	<li>Brodmann, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Vergleichende Lokalisationslehre der Grosshirnrinde in ihren Prinzipien dargestellt auf Grund des Zellenbaues. , (1909).</li><li>Naumann, R. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+reptilian+brain.">The reptilian brain.</a> Curr Biol. 25 (8), R317-R321 (2015).</li><li>Kaas, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+columns,+modules,+and+domains+in+the+neocortex+of+primates.">Evolution of columns, modules, and domains in the neocortex of primates.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (Supplement 1), 10655-10660 (2012).</li><li>Woolsey, T. 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著者らは、調査した潜在的な利益相反として解釈される可能性が商業や金融関係の不在を宣言します。

大脳皮質のモジュールは、さまざまな技術を使用して識別されています。早いいずれかの可視化による研究通常識別される皮質モジュール セルの密集した地域または繊維1の不在。それ以降のメソッドは、有無樹状束24、25の特定の領域からの求心性神経の神経伝達物質26の充実に活用しています。ここで 2 つの技術、(i) チトクロム酸化酵素組織化学的研究 (ii) 免疫組織化学染色を示します。
チトクロム酸化酵素染色皮質モジュールを視覚化する最も人気のある方法のいずれかをされているし、一次感覚野27,28で広く使用されています。高いミトコンドリア活性17、それにより実質的な機能の反応を誘発する解剖学的モジュールのためのプロキシとしての領域のために暗いの汚損によってモジュールを可視化します。このメソッドは、体性感覚皮質モジュール (図 2) と大脳皮質視覚野27モジュールを視覚化するために使用されています。
伝統的な組織化学的手法の欠点の 1 つは、明視野光学顕微鏡検査によって彼らの典型的な可視化が同時に視覚化することができるモジュールの数を制限することです。ただし、蛍光可視化プローブとの抱合の免疫組織化学的方法は、特定のタンパク質や、大脳皮質のモジュールを特定するにも利用できます。例えば、求心系の視床感覚野へのシミュレーション方法でプロジェクトします。したがって、これらの求心性神経を可視化、VGluT2 陽性を使用しても使用できます我々 が可視化した一次体性感覚野における体表を視覚化するチトクロム酸化酵素活性 (図 2) を利用しました。遺伝的に定義されているセルのグループを識別するために、選択的蛋白質を細胞のマーカーとして使用もできます。免疫組織化学を使用して、我々 はカルビンジン6 (図 3) カルシウム結合蛋白質を表現する内側内嗅領皮質錐体細胞のクラスターを識別し、この特定のクラスターは遺伝的に決定を決定セルのグループは、進化5を示す彼らの機能の基礎となる共通の局所回路における原則の間で保存されます。複数の同時を使用して、我々 も区切られた内側嗅皮質26、補完的なモジュールの空間記憶の根底にある並列回路を示します。
歴史的に、脳は体は、矢状、冠状、または水平方向の位置に垂直な平面で切断されています。体性感覚野の4バレル フィールドのような皮質のモジュールの同定も求め、接線に沿って、その後平坦化された皮質製剤29、断面あったがこのような断面の孤立した症例多くの以前の30,31を観察しました。バレル野の同定後、他の皮質のモジュールはまた主の体部位再現表現完全体地図32の存在と同様、一次視覚野27、識別されました。体性感覚野は。ネコ視覚野の平坦化されたセクションには、追加再構成33を必要とせず方位選択性コラムの地形の組織も明らかにしました。皮質のモジュールは、海馬傍皮質、前海および parasubiculum26,34内側嗅皮質6などで実証されています。フラット マップ35に湾曲した地球の表面の突起の多数によって観察することができます - 層流地形の歪みを誘発する通常の曲線オブジェクトをフラット化します。フラット化し、平坦化した後それらの間の距離を測定する前に定義された距離で基準点を導入することは部分的にこれらの歪みを補正する比較的単純な方法です。これらのマークだけでなくフラット化によって導入された歪みの定量的推定に生後、連続したセクションを配置する参照しやすいポイントも提供します。さらに層流の忠実度を維持するための重要な側面、セクションを渡って均一な平坦化を確実に含めるし、皮質層流のセクションを最適化された最終的に取得する層流のレイアウトに丁度接線断面します。
接線方向の平坦化されたセクション内の皮質のモジュールの可視化は、大脳皮質の魅惑的な構造と機能の関係を明らかに重要な役割を果たしています。一次体性感覚野のひげや体の部分の地形表現と平面的な接線方向の皮質セクションで機能グリッド セルを生成する回路の解剖学的なグリッドの存在は、複雑な回路を明らかにします。詳細は他の方向から理解するは難しいだろう。しかし、私達の現在の技術は、これらの本質的に 3次元モジュールの二次元スライスのみを提供します。蛍光免疫測定法と組織法36,37をクリア使用して、それは全体としてこれらの皮質のモジュールを視覚化し、おそらくさらに皮質地図とモジュールの私達の理解への洞察力を明らかにすることが可能でしょう。

大脳皮質における系統間の頭脳の構造の最も重要な変更のいくつかを観察できます。重要な違いにもかかわらず動物の大脳皮質共通パターンに従います、レイヤーとエリア1では 2 つの異なる方法で大きく分類されます。皮質層はそこに脳の表面に平行と哺乳類の皮質1で 6 層に爬虫類野2の 3 レイヤーの数が異なります。皮質は一方で主など個別の機能に対応する大脳皮質の異なる領域、体性感覚野はタッチや視覚入力の処理の視覚皮質の感覚に関与します。これらの皮質頻繁に分割できますパッチまたはモジュール3、解剖学的構造は、基本的に脳の軟膜の表面に平行を見つけては繰り返し定期的にします。皮質モジュールが特定のレイヤー4に限られることがあります。 またはいくつかのレイヤー5に 。
脳の標準断面方法は、コロナや矢のような脳の表面に正常のセクションを含みます。皮質モジュールを可視化するこれらのメソッドを使用できますが、皮質のモジュールは、脳の表面に平行な平面で接線方向、視覚化されたときは、興味深い機能の多くを明らかになることができます。例えば、脳表面に垂直に視覚化されたときバレルとしてひげを表す齧歯動物の脳の体性感覚のモジュールが表示され、従って地域派生名バレル皮質。ただし、接線方向にバレルの視覚化の彼らは外部の体表面のひげの正確なレイアウトをミラーリング地形向きで配置されてバレルとウィスカ マップを明らかに。特定のケースでモジュール式の配置はかなりの期間のための検出をエスケープも非接線方法で視覚化されたとき。内側嗅は、グリッド セル、動物が環境を走査するとき規則的な六角形パターンで発射するニューロンの存在を知られています。にもかかわらず、最近では、パッチの有無や内側嗅細胞のモジュールまで大きく調査エリアは、6の六角形のパターンでレイアウトする物理的に検出を逃れていた。プレゼンスおよびラット脳におけるこれらのモジュールの配置は、内側嗅の接線方向のセクションを作ると、細胞構築を層ごとに調査によって促進されました。
断面後、皮質モジュールの可視化の特定の側面は、複数の方法で実現できます。従来、研究細胞密度や繊維レイアウト1に基づいてモジュールの輪郭を描いた。高い活動8の領域を明らかにするチトクロム酸化酵素組織化学を使用する人気のある方法です。新しいアプローチは、遺伝的に決定細胞型のタンパク質発現プロファイル6,8に基づいて区別を見ています。
この研究では、哺乳類の脳の皮質を分離、平面的な接線方向のセクションを取得およびチトクロム酸化酵素組織化学および細胞型特定の蛋白質の免疫組織化学に基づいて大脳皮質のモジュールを可視化する方法を強調表示します。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cytochrome oxidase staining</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytochrome c from equine heart</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C2506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3,3&#39;Diaminobenzidine tetrahydrochloride hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5637</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D(+)-Saccharose</td>
			<td>Carl Roth&#160;</td>
			<td>4621.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium nickel(II) sulfate hexahydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A1827</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Carl Roth&#160;</td>
			<td>9105.4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antigen retrieval</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trisodium citrate dihydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S1804</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citric acid monohydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1909</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffer/phosphate-buffered saline/prefix/PFA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium dihydrogen phosphate</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3904.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>9265.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Di-Sodium hydrogen phosphate dihydrate</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>4984.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>0335.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRITON-X 100</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3051.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immunohistochemistry</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calbindin D-28k puriefied from chicken gut, Mouse monoclonal</td>
			<td>Swant</td>
			<td>RRID: AB_10000347</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calbindin D-28k from recombinant rat calbindin D-28k, Rabbit polyclonal</td>
			<td>Swant</td>
			<td>RRID: AB_10000340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumin Fraction V, biotin free</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>0163.4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting or freezing media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount (immunofluorescence)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F4680</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eukitt (histochemistry)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>03989</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue freezing medium</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>NC0696746</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcohol dehydration</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 100%</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>9065.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 96%</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>P075.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Propanol</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>6752.4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene substitute</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>78475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Devices/tools</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microm HM 650V</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Jung RM2035</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #55 Forceps - Inox</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11255-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 Forceps - Inox Biology Tip</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11252-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5SF Forceps - Inox Super Fine Tip</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11252-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bone Shears - 24 cm</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>16150-24</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Friedman Rongeur</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>16000-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blunt Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14000-18</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Scissors - Large Loops</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14101-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Scissors - Sharp-Blunt</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14001-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Iris Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14094-11</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualization of cortical modules in flattened mammalian cortices

哺乳類の大脳皮質は異なる部分やモジュールに parcellated です。皮質モジュールは通常そこに皮質のシートを平行し特定の組織化学的および免疫組織化学的方法で線引きすることができます。この研究では、哺乳類の脳の皮質を分離し、皮質のシートに平行にセクションを取得するそれらを平坦化する方法を強調表示します。さらに、組織化学的選択したハイライト、これらを処理する免疫組織化学的方法は、皮質モジュールを可視化する接線方向のセクションを平坦化します。各種哺乳動物の体性感覚皮質では、体表や動物の体のさまざまな部分を表す皮質モジュールを明らかにするチトクロム酸化酵素組織化学的研究を実行します。内側内嗅領皮質、グリッド セルの生成場所、領域は皮質のシートにグリッド パターンのいくつかの種の間で整理される遺伝のニューロンのモジュールを強調表示する免疫組織化学的方法を駆使します。全体的にみて、分離し、layer-wise を準備するためのフレームワーク皮質のセクションを平坦化、化学を用いた皮質モジュールとさまざまな哺乳類の脳での免疫組織化学的方法を視覚化を提供いたします。

様々 な脳の体性感覚野の皮質のセクションを平らを, チトクロム酸化酵素組織化学別の身体の部分を表現するシミュレーション モジュールを可視化するためにそれらを処理します。この比較のアプローチにより、その形状野、例えば、齧歯動物および兎のバレル21 (図 2) mystacial ヒゲの非常に節約された表現を示す進化の力を勉強します。対照的に、足と性器など他の体の部分を示し、彼らの親類のバリエーション サイズ生態学的ニッチまたは性選択22,23特殊化を反映します。
内側嗅のアーキテクチャを理解するには、軟膜表面に平行なセクションを得た。これは主に、マウス、ラット、およびエジプトのフルーツ バットの内側嗅の接線断面によって達成されました。ヒトでは、かなり大きなサイズと内嗅領皮質より起伏のため優しくを平らにした後嗅皮質の接した切口を作る皮質。その後、すべての脳を凍結保存され、60 のクライオスタットの断面 μ m. 免疫抗カルビンジン抗体、内側嗅内皮質にカルビンジン正ピラミッド型電池モジュールを可視化すると得られたセクションに行った野5 (図 3)。内嗅領皮質カルビンジン モジュールはこれらすべての脳の間で顕著な周期性を示し全体で 10 の要因だけでサイズが変化 ~ 脳の 20,000-fold 変異のサイズ5。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56992/56992fig2.jpg"> 図 2: チトクロム酸化酵素組織化学によって識別される哺乳類の間でバレル皮質モジュールの地形のレイアウト。非常に節約されたシミュレーションとしてバレルを示す層 IV (A) マウス、スナネズミ (B)、(C) ラット、(D) degu、ハムスター (E)、(F) ウサギの体性感覚野からの接線方向のセクションmystacial ヒゲの表現。スケール バー = 500 μ m. m: c: Caudal; r: Rostral, l: 外側内側A の方向は B e. にも適用されます。<a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56992/56992fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56992/56992fig3.jpg"> 図 3: 内側嗅皮質モジュール カルビンジン免疫によって識別される哺乳類間での定期的なレイアウトします。(A) マウス、ラット (B)、(C) エジプトのフルーツ バット、(D) 人間、カルビンジン正ピラミッド型電池モジュールの保存された定期的なレイアウトを示すの内側嗅の II 層から接線方向のセクション。スケール バー = 250 μ m. m: 内側、l: 横、d: 背, v: 腹、r: Rostral、c: Caudal;ニ方向は、B、C にも適用されます<a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56992/56992fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。

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Visualization of Cortical Modules in Flattened Mammalian Cortices

この記事では、哺乳類の皮質から接線方向の平坦化されたセクションを取得し、皮質モジュールによる組織化学的および免疫組織化学的方法を視覚化する詳細な方法について説明します。

平坦化された哺乳類の皮質皮質モジュールの可視化

The cortex of mammalian brains is parcellated into distinct substructures or modules. Cortical modules typically lie parallel to the cortical sheet, and ...

visualization-of-cortical-modules-in-flattened-mammalian-cortices

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

12.7K ビュー.  Humboldt University of Berlin. この記事では、哺乳類の皮質から接線方向の平坦化されたセクションを取得し、皮質モジュールによる組織化学的および免疫組織化学的方法を視覚化する詳細な方法について説明します。

ビデオ: Visualization of Cortical Modules in Flattened Mammalian Cortices

Visualization of Larval Segmental Nerves in 3rd Instar Drosophila Larval Preparations

Drosophila melanogaster is emerging as a powerful model system for studying the development and function of the nervous system, particularly because of its convenient genetics and fully sequenced genome. Additionally, the larval nervous system is an ideal model system to study mechanisms of axonal transport as the larval segmental nerves contain bundles of axons with their cell bodies located within the brain and their nerve terminals ending along the length of the body. Here we describe the procedure for visualization of synaptic vesicle proteins within larval segmental nerves. If done correctly, all components of the nervous system, along with associated tissues such as muscles and NMJs, remain intact, undamaged, and ready to be visualized. 3rd instar larvae carrying various mutations are dissected, fixed, incubated with synaptic vesicle antibodies, visualized and compared to wild type larvae. This procedure can be adapted for several different synaptic or neuronal antibodies and changes in the distribution of a variety of proteins can be easily observed within larval segmental nerves.

Visualization of Larval Segmental Nerves in 3rd Instar Drosophila Larval Preparations

Drosophila melanogaster larvae provide an ideal model system to investigate the mechanisms of axonal transport within larval segmental nerves. Using this procedure, 3rd instar larvae carrying various mutations can be compared to wild type larvae.

3の幼虫分節神経の可視化 RD齢ショウジョウバエ幼虫準備

Drosophila melanogaster is emerging as a powerful model system for studying the development and function of the nervous system, particularly because of ...

神経科学

In vivo Visualization of Synaptic Vesicles Within Drosophila Larval Segmental Axons

Elucidating the mechanisms of axonal transport has shown to be very important in determining how defects in long distance transport affect different neurological diseases. Defects in this essential process can have detrimental effects on neuronal functioning and development. We have developed a dissection protocol that is designed to expose the Drosophila larval segmental nerves to view axonal transport in real time. We have adapted this protocol for live imaging from the one published by Hurd and Saxton (1996) used for immunolocalizatin of larval segmental nerves. Careful dissection and proper buffer conditions are critical for maximizing the lifespan of the dissected larvae. When properly done, dissected larvae have shown robust vesicle transport for 2-3 hours under physiological conditions. We use the UAS-GAL4 method 1 to express GFP-tagged APP or synaptotagmin vesicles within a single axon or many axons in larval segmental nerves by using different neuronal GAL4 drivers. Other fluorescently tagged markers, for example mitochrondria (MitoTracker) or lysosomes (LysoTracker), can be also applied to the larvae before viewing. GFP-vesicle movement and particle movement can be viewed simultaneously using separate wavelengths.

In vivo Visualization of Synaptic Vesicles Within Drosophila Larval Segmental Axons

This protocol discusses the live dissection of Drosophila larvae for the purpose of imaging the movement of GFP tagged axonal vesicles on microtubule tracks.

ショウジョウバエ幼虫分節軸索内ではシナプス小胞の in vivo可視化で

Elucidating the mechanisms of axonal transport has shown to be very important in determining how defects in long distance transport affect different ...

Automated Interactive Video Playback for Studies of Animal Communication

Video playback is a widely-used technique for the controlled manipulation and presentation of visual signals in animal communication. In particular, parameter-based computer animation offers the opportunity to independently manipulate any number of behavioral, morphological, or spectral characteristics in the context of realistic, moving images of animals on screen. A major limitation of conventional playback, however, is that the visual stimulus lacks the ability to interact with the live animal. Borrowing from video-game technology, we have created an automated, interactive system for video playback that controls animations in response to real-time signals from a video tracking system. We demonstrated this method by conducting mate-choice trials on female swordtail fish, Xiphophorus birchmanni. Females were given a simultaneous choice between a courting male conspecific and a courting male heterospecific (X. malinche) on opposite sides of an aquarium. The virtual male stimulus was programmed to track the horizontal position of the female, as courting males do in the wild. Mate-choice trials on wild-caught X. birchmanni females were used to validate the prototype's ability to effectively generate a realistic visual stimulus.

Video playback is a widely used technique in animal behavior. We created and evaluated a program that applies rules-based, interactive playback of 3-D computer animations in response to real-time, automated data on subject behavior.

アニマルコミュニケーションの研究のための自動化されたインタラクティブなビデオ再生

Video playback is a widely-used technique for the controlled manipulation and presentation of visual signals in animal communication. In particular, ...

Functional Calcium Imaging in Developing Cortical Networks

A hallmark pattern of activity in developing nervous systems is spontaneous, synchronized network activity. Synchronized activity has been observed in intact spinal cord, brainstem, retina, cortex and dissociated neuronal culture preparations. During periods of spontaneous activity, neurons depolarize to fire single or bursts of action potentials, activating many ion channels. Depolarization activates voltage-gated calcium channels on dendrites and spines that mediate calcium influx. Highly synchronized electrical activity has been measured from local neuronal networks using field electrodes. This technique enables high temporal sampling rates but lower spatial resolution due to integrated read-out of multiple neurons at one electrode. Single cell resolution of neuronal activity is possible using patch-clamp electrophysiology on single neurons to measure firing activity. However, the ability to measure from a network is limited to the number of neurons patched simultaneously, and typically is only one or two neurons. The use of calcium-dependent fluorescent indicator dyes has enabled the measurement of synchronized activity across a network of cells. This technique gives both high spatial resolution and sufficient temporal sampling to record spontaneous activity of the developing network.
A key feature of newly-forming cortical and hippocampal networks during pre- and early postnatal development is spontaneous, synchronized neuronal activity (Katz &amp; Shatz, 1996; Khaziphov &amp; Luhmann, 2006). This correlated network activity is believed to be essential for the generation of functional circuits in the developing nervous system (Spitzer, 2006). In both primate and rodent brain, early electrical and calcium network waves are observed pre- and postnatally in vivo and in vitro (Adelsberger et al., 2005; Garaschuk et al., 2000; Lamblin et al., 1999). These early activity patterns, which are known to control several developmental processes including neuronal differentiation, synaptogenesis and plasticity (Rakic &amp; Komuro, 1995; Spitzer et al., 2004) are of critical importance for the correct development and maturation of the cortical circuitry.
In this JoVE video, we demonstrate the methods used to image spontaneous activity in developing cortical networks. Calcium-sensitive indicators, such as Fura 2-AM ester diffuse across the cell membrane where intracellular esterase activity cleaves the AM esters to leave the cell-impermeant form of indicator dye. The impermeant form of indicator has carboxylic acid groups which are able to then detect and bind calcium ions intracellularly.. The fluorescence of the calcium-sensitive dye is transiently altered upon binding to calcium. Single or multi-photon imaging techniques are used to measure the change in photons being emitted from the dye, and thus indicate an alteration in intracellular calcium. Furthermore, these calcium-dependent indicators can be combined with other fluorescent markers to investigate cell types within the active network.

Spontaneous activity of developing neuronal networks can be measured using AM-ester forms of calcium-sensitive indicator dyes. Changes in intracellular calcium, indicating neuronal activation, are detected as transient changes in indicator fluorescence with one- or two-photon imaging. This protocol can be adapted for a range of developmentally-dependent neuronal networks in vitro.

皮質ネットワークの開発で機能的カルシウムイメージング

A hallmark pattern of activity in developing nervous systems is spontaneous, synchronized network activity. Synchronized activity has been observed in ...

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other insects proprioception is provided by specialized sensory organs termed chordotonal organs (ChOs) 2. Like many other organs in Drosophila, ChOs develop twice during the life cycle of the fly. First, the larval ChOs develop during embryogenesis. Then, the adult ChOs start to develop in the larval imaginal discs and continue to differentiate during metamorphosis.
The development of larval ChOs during embryogenesis has been studied extensively 10,11,13,15,16. The centerpiece of each ChO is a sensory unit composed of a neuron and a scolopale cell. The sensory unit is stretched between two types of accessory cells that attach to the cuticle via specialized epidermal attachment cells 1,9,14. When a fly larva moves, the relative displacement of the epidermal attachment cells leads to stretching of the sensory unit and consequent opening of specific transient receptor potential vanilloid (TRPV) channels at the outer segment of the dendrite 8,12. The elicited signal is then transferred to the locomotor central pattern generator circuit in the central nervous system.
Multiple ChOs have been described in the adult fly 7. These are located near the joints of the adult fly appendages (legs, wings and halters) and in the thorax and abdomen. In addition, several hundreds of ChOs collectively form the Johnston's organ in the adult antenna that transduce acoustic to mechanical energy 3,5,17,4.
In contrast to the extensive knowledge about the development of ChOs in embryonic stages, very little is known about the morphology of these organs during larval stages. Moreover, with the exception of femoral ChOs 18 and Johnston's organ, our knowledge about the development and structure of ChOs in the adult fly is very fragmentary.
Here we describe a method for staining and visualizing ChOs in third instar larvae and pupae. This method can be applied together with genetic tools to better characterize the morphology and understand the development of the various ChOs in the fly.

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

A method to immunostain and visualize chordotonal organs in larvae and pupae of Drosophila melanogaster is described.

でProprioceptorsの可視化<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;幼虫および蛹

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other ...

Isolation and Culture of Mouse Cortical Astrocytes

Astrocytes are an abundant cell type in the mammalian brain, yet much remains to be learned about their molecular and functional characteristics. In vitro astrocyte cell culture systems can be used to study the biological functions of these glial cells in detail. This video protocol shows how to obtain pure astrocytes by isolation and culture of mixed cortical cells of mouse pups. The method is based on the absence of viable neurons and the separation of astrocytes, oligodendrocytes and microglia, the three main glial cell populations of the central nervous system, in culture. Representative images during the first days of culture demonstrate the presence of a mixed cell population and indicate the timepoint, when astrocytes become confluent and should be separated from microglia and oligodendrocytes. Moreover, we demonstrate purity and astrocytic morphology of cultured astrocytes using immunocytochemical stainings for well established and newly described astrocyte markers. This culture system can be easily used to obtain pure mouse astrocytes and astrocyte-conditioned medium for studying various aspects of astrocyte biology.

Astrocytes have been recognized to be versatile cells participating in fundamental biological processes that are essential for normal brain development and function, and central nervous system repair. Here we present a rapid procedure to obtain pure mouse astrocyte cultures to study the biology of this major class of central nervous system cells.

マウス大脳皮質アストロサイトの単離および培養

Astrocytes  are an abundant cell type in the mammalian brain, yet much remains to be  learned about their molecular and functional characteristics. In ...

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety of brain disorders1,2. To better understand the mechanisms by which brain circuits react to an animal's experience requires the ability to monitor the experience-dependent molecular changes in a given set of neurons, over a prolonged period of time, in the live animal. While experience and associated neural activity is known to trigger gene expression changes in neurons1,2, most of the methods to detect such changes do not allow repeated observation of the same neurons over multiple days or do not have sufficient resolution to observe individual neurons3,4. Here, we describe a method that combines in vivo two-photon microscopy with a genetically encoded fluorescent reporter to track experience-dependent gene expression changes in individual cortical neurons over the course of day-to-day experience. 
One of the well-established experience-dependent genes is Activity-regulated cytoskeletal associated protein (Arc)5,6. The transcription of Arc is rapidly and highly induced by intensified neuronal activity3, and its protein product regulates the endocytosis of glutamate receptors and long-term synaptic plasticity7. The expression of Arc has been widely used as a molecular marker to map neuronal circuits involved in specific behaviors3. In most of those studies, Arc expression was detected by in situ hybridization or immunohistochemistry in fixed brain sections. Although those methods revealed that the expression of Arc was localized to a subset of excitatory neurons after behavioral experience, how the cellular patterns of Arc expression might change with multiple episodes of repeated or distinctive experiences over days was not investigated. 
In vivo two-photon microscopy offers a powerful way to examine experience-dependent cellular changes in the living brain8,9. To enable the examination of Arc expression in live neurons by two-photon microscopy, we previously generated a knock-in mouse line in which a GFP reporter is placed under the control of the endogenous Arc promoter10. This protocol describes the surgical preparations and imaging procedures for tracking experience-dependent Arc-GFP expression patterns in neuronal ensembles in the live animal. In this method, chronic cranial windows were first implanted in Arc-GFP mice over the cortical regions of interest. Those animals were then repeatedly imaged by two-photon microscopy after desired behavioral paradigms over the course of several days. This method may be generally applicable to animals carrying other fluorescent reporters of experience-dependent molecular changes4.

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

Experience-dependent molecular changes in neurons are essential for the brain's ability to adapt in response to behavioral challenges. An in vivo two-photon imaging method is described here that allows the tracking of such molecular changes in individual cortical neurons through genetically encoded reporters.

皮質ニューロンにおける経験依存性分子の変化の in vivo二光子イメージングにおける

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety ...

Subtype-selective Electroporation of Cortical Interneurons

The study of central nervous system (CNS) maturation relies on genetic targeting of neuronal populations. However, the task of restricting the expression of genes of interest to specific neuronal subtypes has proven remarkably challenging due to the relative scarcity of specific promoter elements. GABAergic interneurons constitute a neuronal population with extensive genetic and morphological diversity. Indeed, more than 11 different subtypes of GABAergic interneurons have been characterized in the mouse cortex1. Here we present an adapted protocol for selective targeting of GABAergic populations. We achieved subtype selective targeting of GABAergic interneurons by using the enhancer element of the homeobox transcription factors Dlx5 and Dlx6, homologues of the Drosophila distal-less (Dll) gene2,3, to drive the expression of specific genes through in utero electroporation.

This procedure shows how to target interneurons in the developing mouse forebrain by means of in utero electroporation. This technique was particularly efficient to achieve selective gene expression in interneuron subtypes destined to the superficial layers of the cortex.

皮質介在ニューロンのサブタイプ選択的エレクトロポレーション

The study of central nervous system (CNS) maturation relies on genetic targeting of neuronal populations. However, the task of restricting the expression ...

Quantification of Filamentous Actin (F-actin) Puncta in Rat Cortical Neurons

Filamentous actin protein (F-actin) plays a major role in spinogenesis, synaptic plasticity, and synaptic stability. Changes in dendritic F-actin rich structures suggest alterations in synaptic integrity and connectivity. Here we provide a detailed protocol for culturing primary rat cortical neurons, Phalloidin staining for F-actin puncta, and subsequent quantification techniques. First, the frontal cortex of E18 rat embryos are dissociated into low-density cell culture, then the neurons grown in vitro for at least 12-14 days. Following experimental treatment, the cortical neurons are stained with AlexaFluor 488 Phalloidin (to label the dendritic F-actin puncta) and microtubule-associated protein 2 (MAP2; to validate the neuronal cells and dendritic integrity). Finally, specialized software is used to analyze and quantify randomly selected neuronal dendrites. F-actin rich structures are identified on second order dendritic branches (length range 25-75 &#181;m) with continuous MAP2 immunofluorescence. The protocol presented here will be a useful method for investigating changes in dendritic synapse structures subsequent to experimental treatments.

Quantification of Filamentous Actin F-actin Puncta in Rat Cortical Neurons

Filamentous actin (F-actin) plays an important role in spinogenesis, synaptic plasticity, and synaptic stability. Quantification of F-actin puncta is therefore a useful tool to study the integrity of synaptic structures. This protocol describes the procedures of quantifying F-actin puncta labeled with Phalloidin in low-density primary cortical neuronal cultures.

ラット皮質ニューロンにおける繊維状アクチン（F-アクチン）涙点の定量化

Filamentous actin protein (F-actin) plays a major role in spinogenesis, synaptic plasticity, and synaptic stability. Changes in dendritic F-actin rich ...

Visualization of Thalamocortical Axon Branching and Synapse Formation in Organotypic Cocultures

Axon branching and synapse formation are crucial processes for establishing precise neuronal circuits. During development, sensory thalamocortical (TC) axons form branches and synapses in specific layers of the cerebral cortex. Despite the obvious spatial correlation between axon branching and synapse formation, the causal relationship between them is poorly understood. To address this issue, we recently developed a method for simultaneous imaging of branching and synapse formation of individual TC axons in organotypic cocultures.
This protocol describes a method which consists of a combination of an organotypic coculture and electroporation. Organotypic cocultures of the thalamus and cerebral cortex facilitate gene manipulation and observation of axonal processes, preserving characteristic structures such as laminar configuration. Two distinct plasmids encoding DsRed and EGFP-tagged synaptophysin (SYP-EGFP) were co-transfected into a small number of thalamic neurons by an electroporation technique. This method allowed us to visualize individual axonal morphologies of TC neurons and their presynaptic sites simultaneously. The method also enabled long-term observation which revealed the causal relationship between axon branching and synapse formation.

This protocol describes a method for simultaneous imaging of thalamocortical axon branching and synapse formation in organotypic cocultures of the thalamus and cerebral cortex. Individual thalamocortical axons and their presynaptic terminals are visualized by a single cell electroporation technique with DsRed and GFP-tagged synaptophysin.

視床皮質軸索分岐とシナプスの可視化脊髄共培養系における形成

Axon branching and synapse formation are crucial processes for establishing precise neuronal circuits. During development, sensory thalamocortical (TC) ...