Este trabajo fue apoyado por la Humboldt Universität zu Berlin, el centro de Bernstein para Berlín de neurociencia computacional, del centro alemán para enfermedades neurodegenerativas (DZNE), el Ministerio Federal alemán de educación e investigación (BMBF, Förderkennzeichen 01GQ1001A), NeuroCure y Gottfried Wilhelm Leibniz Premio del DFG. Agradecemos a Shimpei Ishiyama de excelente diseño gráfico y Juliane Diederichs excelente asistencia técnica.

Todos los procedimientos experimentales fueron realizados según las directrices alemanas sobre el bienestar de los animales bajo la supervisión de los comités de ética locales (LaGeSo). Humanos y murciélagos cerebro datos fueron derivados de Naumann et al. 5 el siguiente procedimiento se realiza en rata Wistar macho adulto (cepa: RJHan:WI).
1. perfusión y extracción de cerebro
Nota: Para obtener un cerebro fijado homogéneamente y sin sangre, las transcardial la perfusión del animal es muy animada, como sangre residual aumenta la señal de fondo no específica durante la coloración. Sin embargo, también es posible obtener secciones aplanadas del espécimen no perfundido y les mancha. La facilidad de manipulación de la muestra varía con la concentración de fijador utilizado. Fijación insuficiente aumenta el riesgo de manejar el daño en el cerebro durante aplanar y cortar, mientras que concentraciones demasiadas menor flexibilidad para aplanar y la calidad de la señal de tinción.
<ol><li>Transcardially perfusión el animal, utilizando una aguja de 23G. Para una información más detallada, véase Gage et al. 9<ol>
<li>Uso de fosfato buffer salino10 (PBS 0.02 M; pH 7,4) a eliminar sangre desde el cerebro y el cuerpo del animal. Continúe hasta que el líquido de infusión aparece clara, con al menos 150 mL PBS ser infundida a través del sistema vascular. Nota: Se consiguen mejores resultados a una presión similar a la gama de la presión arterial fisiológica del animal siendo perfundido (p. ej., rata: 120-130 mmHg). Opcionalmente, añadir heparina (10 U/mL) a la solución para evitar la coagulación de sangre11.</li>
		<li>Para fijar el cerebro, transcardially infundir un mínimo de 100 mL paraformaldehido12 (PFA, 4%; en fosfato de 0.1 M tampón (PB)13) hasta que el cuello del animal es rígido. PRECAUCIÓN: El PFA es un carcinógeno potencial. Nota: Para la actividad histoquímica de la coloración, tales como la citocromo oxidasa, se consiguen mejores resultados, al utilizar 2% PDA. Para otras manchas, como inmunohistoquímica, 4% PFA es preferido.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Extraer el cerebro del cráneo. Nota: Ver Gage et al. 9 para más detalles.<ol>
<li>Aislar la cabeza con grandes tijeras o los esquileos del hueso.</li>
		<li>Con unas tijeras finas, cortar la piel a lo largo de la línea media del cuello a la nariz. Separe la piel para exponer el cráneo. Quitar el cuello y los músculos temporales con unas tijeras finas.</li>
		<li>Haga una línea media a través del hueso interparietal desde el foramen magnum hasta el hueso parietal.</li>
		<li>Uso de gubias de pelar el hueso interparietal. Deslice las tijeras finas a lo largo de la sutura sagital y corte desde el extremo posterior del parietal en el extremo anterior de los huesos frontales.</li>
		<li>Uso de gubias de pelar los huesos frontal y parietal. Por otra parte, levantar los huesos lejos con unas pinzas. Use una cuchara para cortar cuerdas ventrales del nervio y quitar el cerebro. Transferir el cerebro a PB (0,1 M; pH 7,4).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Reparar cerebros no perfundidos por inmersión en el 4% PFA para 1-3 h a 4 ° C (dependiendo del tamaño del cerebro y sonda: musaraña: ~ 1 h, humanos: ~ 3 h). Nota: Para grandes y gyrencephalic cerebros como los seres humanos, aislar y cortar el área de interés para reducir el tiempo de fijación.</li>
	<li>Para obtener las áreas corticales más grandes en una sección, aplane el cerebro antes de la fijación más; proceda al paso 2. Sin embargo, para obtener secciones de más difícil llegar a zonas como la corteza del entorhinal medial, después arreglar el cerebro en el 4% PFA por 24 h antes de proceder al paso 2.</li>
</ol>2. disección y aplanamiento del cerebro
<ol><li>Separar los hemisferios del cerebro mediante una hoja de afeitar (lissencephalic cerebro) o un bisturí (gyrencephalic cerebro). Nota: Si el cerebro no se ha corregido después, es susceptible a daños por manejo.</li>
	<li>Paso opcional para ayudar a la estimación de sección posterior registro y contracción:<ol>
<li>La corteza en un área de interés no la punción con una aguja de 35G normal a la superficie cortical. Repita el paso dos veces a distancias definidas a lo largo de la lámina cortical. Para determinar la distancia a lo largo de la lámina cortical, utilice un hilo de corte a longitud fija (por ejemplo, 5 mm) y colóquela a lo largo de la superficie cortical para determinar puntos de punción.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Cerebros lissencephalic: quitar las estructuras subcorticales usando una espátula de disección. Crítica: Mantenga el cerebro húmedo con PB (0,1 M; pH 7,4) a lo largo de todo el procedimiento.<ol>
<li>Mantenga el cerebro por el cerebelo e inserte suavemente la espátula para abrir un plano de disección en el cuerpo calloso. La punta redonda de espátula debe apuntar a la corteza.</li>
		<li>Deslizar la espátula más lejos y tirar suavemente hasta que la espátula esté entre el tálamo y la corteza. Distintas estructuras subcorticales con movimientos de rascado.</li>
		<li>Inspeccione el hemisferio para incluso el grueso. Nota: Regiones irregulares pueden resultar en un gradiente trans-capa durante el seccionamiento. Para corte tangencial, utilice un bisturí para hacer un corte limpio a través del cerebro, paralelo a la superficie pial de la región de la cual se desean secciones tangenciales.</li>
		<li>Pasos opcionales para mejorar la calidad del acoplamiento:<ol>
<li>Hacer un corte limpio por el cuerpo estriado, Núcleo accumbens y corteza orbitofrontal, puesto que aumentan el espesor de la corteza en la región lateral. También, añadir un corte de alivio en la base de la región interna de la corteza prefrontal, que permite el despliegue de las porciones mediales de la corteza.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Coloque el hemisferio (corteza hacia abajo) sobre un portaobjetos de vidrio. Proceda al paso 2.6.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Cerebros Gyrencephalic: Quite la materia blanca para desplegar las convoluciones del cerebro (para protocolos detallados, vea: Soledad et al. 14; Tootell y Silverman15). Crítica: Uso PB (0,1 M; pH 7,4) a mantener el cerebro húmedo en todo momento.<ol>
<li>Poner el área de interés en un papel filtro húmedo en un gran plato de Petri, con la corteza hacia arriba.</li>
		<li>Quitar la membrana aracnoide y pia usando dos pinzas.</li>
		<li>Utilice un hisopo de algodón húmedo y suavemente inserte en cada surco para separar las adherencias entre las convoluciones del cerebro.</li>
		<li>La vuelta del cerebro mediante el uso de otro papel de filtro húmedo.</li>
		<li>Utilizar dos espátulas curvas de micro para desplegar solo convoluciones del cerebro. Utilice el lado convexo de las espátulas para embromar aparte la materia blanca hasta llegar cerca del extremo cóncavo de la convolución del cerebro. Utilice un hisopo de algodón húmedo y continuar con movimientos de remolinos para llegar al extremo cóncavo de la convolución del cerebro.</li>
		<li>Embromar apartes solo convoluciones del cerebro. Si es necesario, agregue aliviar pequeños cortes si la tensión es demasiado alta.</li>
		<li>Aplana el cerebro desplegado en la caja Petri o un recipiente similar.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Opcionalmente, lugar cerebros más grandes en una esponja de filtro de papel cubierto, para garantizar que las regiones no se resequen.</li>
	<li>Coloque dos piezas laminados de la arcilla en ambos lados. Crítica: Como el grueso de la arcilla define cuánto el hemisferio puede ser aplanado, asegurarse de que la arcilla es 10-20% más delgada que la corteza no aplanada.</li>
	<li>Presione suavemente hasta que el hemisferio esté completamente plano una segundo cristal diapositiva pequeña caja de Petri en la corteza. Para obtener los mejores resultados para una región deseada, coloque el portaobjetos de cristal primero en el área respectiva. Para obtener los mejores resultados para cerebros lissencephalic, coloque el portaobjetos de cristal tangencialmente en la porción lateral primero y aplique presión concentrada en esta región.</li>
	<li>Poner un peso (por ejemplo, un vidrio de reloj cerámica) sobre el portaobjetos de vidrio/Petri y aplanar el hemisferio durante 3-5 h a 4 ° C en PB.</li>
	<li>Para la fijación, suelte la presión y retire el portaobjetos. Poner el hemisferio aplanado en PFA (libre flotación) por 24 h en un agitador a 4 ° C. Nota: Se consiguen mejores resultados para los stainings histoquímicos actividad cuando se usa 1% PFA. Para otros los stainings, como inmunohistoquímica, para cerebros sin perfusión, PFA se puede utilizar el 2%.</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56992/56992fig1.jpg"> Figura 1: representación esquemática del flujo de trabajo para aplanar de un hemisferio cortical de la rata y la visualización de los módulos en la corteza somatosensorial. Después de la perfusión de transcardial, el cerebro de un ratón fue diseccionado (A). Fueron quitadas estructuras subcorticales y la corteza fue aplanada entre dos portaobjetos en tampón de fosfato (B). Hemisferio aplanado (C) post fijo, seccionado tangencialmente y manchado para la actividad de citocromo oxidasa (D). Barras de escala = 1 cm. R: Rostral, Caudal C:, L: Lateral, Medial de la M:. Figura adaptada de Lauer et al. 23 <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56992/56992fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
3. cortar secciones tangencial
Nota: Dependiendo de los requerimientos de los protocolos de tinción, el procedimiento de corte y el grueso pueden ser adaptados. Un vibratome fue utilizado para cortar los hemisferios más histoquímicas procesamiento (paso 3.2) a 80-150 μm. Sin embargo, para el procesamiento de immunohistochemical, secciones más delgadas son las deseadas y un micrótomo de congelación fue utilizado para seccionamiento (paso 3.3) en 10-60 μm. Ver Video 1.
<ol><li>Lave el hemisferio aplanado en PB (0.1M, pH 7.4) durante 15 minutos.</li>
	<li>Un vibratome corte del hemisferio.<ol>
<li>Lugar del hemisferio tangencialmente en el titular de la corte. Opcionalmente, pulse de nuevo suavemente con un portaobjeto antes de fijar en la posición (por ejemplo, con superglue). Nota: Minimizar la cantidad de pegamento utilizado, porque podrían resultar en artefactos de corte debido al pequeño espesor de hemisferios aplanados.</li>
		<li>Corte el hemisferio desde el extremo más grueso y más estable hacia el extremo más delgado (posterior a la anterior, aquí) en el espesor requerido. Continúe con el paso 3.4. Nota: Si se utilizaron concentraciones bajas de fijación, corte a baja velocidad y alta amplitud.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Corte del hemisferio en un micrótomo de congelación.<ol>
<li>Cryoprotect el cerebro sumergiéndolo en una solución de sacarosa al 30% (en PB) hasta que se hunde. Nota: Dependiendo del tamaño del tejido es cryoprotected, se hunde en la solución puede ir desde unas horas hasta unos días. Para cerebros más grandes podrían considerar métodos alternativos de crioprotección (véase Rosene et al. 16).</li>
		<li>Forma de un hielo en el micrótomo de congelación para montar el cerebro. Construir el base del hielo por congelación de PB en la cara del bloque del micrótomo de congelación. Crítica: Asegúrese que la superficie de la base del hielo es paralela a la cuchilla de micrótomo. Para ello, cortar el hielo vacío base usando la cuchilla para Microtomo para alinear exactamente la base de hielo paralela a la superficie de corte.</li>
		<li>Incrustar el cerebro en medio de congelación y montarlo en la cara del bloque del micrótomo con el área de interés paralela a la cara del bloque. Se enfrentan a la superficie pial del cerebro hacia la cara del bloque del microtomo. Crítica: Ajustar la temperatura de congelación dependiendo del tamaño de la muestra; temperaturas más altas garantizar integridad sección mejor de seccionamiento, pero secciones más grandes requieren temperaturas más bajas para congelar la muestra uniformemente.</li>
		<li>Cortar el cerebro tangencialmente en el espesor requerido (velocidades de corte más lento y uniforme resultan en mejor calidad de sección).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Lávese las secciones en PB durante 15 min en un agitador.</li>
</ol><img alt="Video Snapshot" src="/files/ftp_upload/56992/56992video1.jpg"> Video 1: video esquemático de secciones tangenciales de una corteza del entorhinal medial de ratas y el diseño de los módulos parasubicular y entorrinal. La corteza del entorhinal medial de un cerebro de roedor está situada en el extremo posterior de la corteza y se inclina hacia el lado medial y ventral. Secciones tangenciales se obtienen por un cuchillo a lo largo de este ángulo de orientación. Por lo tanto, apropiado tipo de célula específico tinción revela estructuras modulares en la corteza entorrinal medial y parasubiculum contigua. Video adaptado de Ray y Brecht8. <a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56992/Video_1_Tangential_Procedure_MEC.mp4" target="_blank">Por favor haga clic aquí para ver este video. (Clic derecho para descargar)</a>
4. visualización de módulos corticales mediante citocromo oxidasa tinción
Nota: Protocolos de tinción diferentes se han desarrollado para la detección histoquímica de la actividad de la citocromo oxidasa, por ejemplo, primero por Wong-Riley17 y más tarde modificado por Divac et al. 18 este protocolo se basa en la una por Divac et al. 18, ya que el uso de sulfato de amonio de níquel (NiAS) resulta en un mayor contraste y mejores definidos módulos de áreas corticales teñidas.
<ol><li>Preparar la solución de tinción de citocromo oxidasa (ver Divac et al. 18). para 10 mL de solución, añadir: tampón HEPES 10 mL (0.1 M, pH 7.4), sacarosa de 400 mg, 12,5 mg NiAS, citocromo C, 6 mg diaminobenzidina (DAB) de 2 mg. PRECAUCIÓN: DAB y NiAS son cancerígenos. Nota: Agregar DAB justo antes de la incubación de las secciones.</li>
	<li>Lávese las secciones en tampón HEPES (0.1 M, pH 7.4) en un agitador durante 15 minutos.</li>
	<li>Incubar las secciones en la solución de tinción a temperatura ambiente en un agitador. Nota: Observe la velocidad de la tinción. Si no hay reacción visible, cambiar a incubación a 37 ° C. Dependiendo de la cantidad de fijación, tinción puede observarse después de 10 minutos o varias horas.</li>
	<li>Detener la reacción agregando 4% PDA; Esto evita que vuelva a morir y el aumento de señal de fondo no deseados.</li>
	<li>Lavar las secciones tres veces con tampón HEPES durante 10 minutos.</li>
	<li>Monte y secar las secciones sobre portaobjetos de vidrio.</li>
	<li>Deshidratar las secciones con una fila cada vez mayor del alcohol:<ol>
<li>Lave los portaobjetos en etanol al 60% durante 1 minuto lavar los portaobjetos en etanol al 80% por 1 minuto lavar los portaobjetos en etanol al 96% por 2 minutos Lave los portaobjetos en etanol al 100% por 3 minutos Lave el portaobjetos en isopropanol para 5 minutos Lave el portaobjetos en xileno durante 5 minutos.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Inmediatamente un medio de montaje de endurecimiento rápido y añadir un cubreobjetos. Crítica: No utilice medios de montaje a base de agua, como NiAS será eliminada y degradar la tinción.</li>
	<li>Mantener las secciones de 4 ° C para almacenamiento a largo plazo.</li>
</ol>5. visualización de módulos corticales mediante tinción inmunohistoquímica
Nota: Varios protocolos están disponibles para immunohistochemistry, optimizado para la muestra y el tipo de sonda. Adaptaciones se pueden hacer como sea necesario, por concentraciones variables de anticuerpos, agentes permeabilizing y tiempos de incubación. El siguiente protocolo conduce a buenos resultados para la detección de una amplia gama de anticuerpos y la visualización de sondas fluorescentes.
<ol><li>Lávese las secciones en PBS (0,1 M; pH 7.4) durante 15 minutos.</li>
	<li>Opcional: Realice el antígeno para desenmascarar a un epitopo mediante un baño de agua (basado en Jiao et al. 19; para métodos alternativos, vea Pileri et al. 20).<ol>
<li>Precaliente un baño de agua a 80 ° C. Prepara tri-sodio citrato buffer19 (pH 8.0) y precalentamiento en baño María a 80 ° C.</li>
		<li>Transferencia de las secciones a tampón de tri-sodio citrato. Incubar las secciones durante 30 min a 80 ° C</li>
		<li>Enfriar las secciones a temperatura ambiente</li>
		<li>Lávese las secciones en PBS durante 15 minutos.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Lávese las secciones dos veces en PBS-X (0,5% Triton-X, en PBS de 0,1 M) durante 15 minutos.</li>
	<li>Bloquear epitopos inespecíficas por las secciones en una solución de albúmina de suero bovino (BSA; 2,5%) y Triton-X (0,75%) en PBS durante 2 h de incubación.</li>
	<li>Incubar las secciones de anticuerpo primario, por ejemplo, Calbindin - D28k (1:5, 000, 1% de BSA en PBS-X), para 2-3 días en un agitador a 4 ° C. Nota: La dilución óptima para el anticuerpo primario depende del anticuerpo específico utilizado. Consulte la información del fabricante para obtener criterios de dilución de un anticuerpo específico. Anticuerpos múltiples pueden ser usados juntos pero deben elevarse contra especies diferentes.</li>
	<li>Lávese las secciones tres veces en PBS durante 15 minutos.</li>
	<li>Incubar las secciones durante la noche en el anticuerpo secundario (1: 200, 1% de BSA en PBS) a 4 ° C en un agitador. Nota: Múltiples anticuerpos secundarios pueden utilizarse en diversos espectros si se utilizaron varios anticuerpos primarios.</li>
	<li>Lave el anticuerpo secundario lavando las secciones tres veces en PBS durante 10 minutos.</li>
	<li>Monte y secar las secciones en un portaobjetos de vidrio para microscopio. Nota: Las secciones deben estar húmedas antes de montar el cubreobjetos.</li>
	<li>Medio de montaje para fluorescencia colorantes en las secciones de tejido se aplica y se aplica un cubreobjetos.</li>
	<li>Secar las secciones para 1 h.</li>
	<li>Para almacenamiento a largo plazo, sello el cubreobjetos usando esmalte de uñas y mantener en la oscuridad a 4 ° C.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Brodmann, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Vergleichende Lokalisationslehre der Grosshirnrinde in ihren Prinzipien dargestellt auf Grund des Zellenbaues. , (1909).</li><li>Naumann, R. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+reptilian+brain.">The reptilian brain.</a> Curr Biol. 25 (8), R317-R321 (2015).</li><li>Kaas, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+columns,+modules,+and+domains+in+the+neocortex+of+primates.">Evolution of columns, modules, and domains in the neocortex of primates.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (Supplement 1), 10655-10660 (2012).</li><li>Woolsey, T. 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Los autores declaran que la investigación se llevó a cabo en ausencia de cualquier relación comercial o financiera que pueda interpretarse como un potencial conflicto de interés.

Modularidad en la corteza cerebral se ha identificado con una variedad de técnicas. Los primeros módulos corticales estudios típicamente identificados ya sea visualizando la célula regiones densas, o la ausencia de fibras1. Métodos posteriores han utilizado la presencia de paquetes dendríticas24, aferentes de una región particular25o enriquecimiento de neurotransmisores26. Aquí muestran dos técnicas de histoquímica de la citocromo oxidasa de (i) y la coloración immunohistochemical (ii).
Citocromo oxidasa tinción ha sido uno de los métodos más populares para visualizar los módulos corticales y ha sido ampliamente utilizado en las cortezas sensoriales primarias27,28. Visualiza los módulos por la coloración más oscura de las zonas de mayor actividad mitocondrial17, actuando así como un proxy para módulos anatómicos que provocan respuestas funcionales substanciales. Este método se ha utilizado para visualizar los módulos corticales somatosensoriales (figura 2) y módulos corticales en la corteza visual27.
Uno de los inconvenientes de las técnicas histoquímicas tradicionales es que su típica visualización por microscopía de campo brillante limita el número de módulos que pueden visualizarse simultáneamente. Sin embargo, métodos inmunohistoquímicos, en conjugación con las puntas de prueba fluorescentes visualización también pueden ser utilizados para ver las proteínas particulares e identificar módulos corticales. Por ejemplo, proyecto de aferentes talámicos a las cortezas sensoriales de manera somatotópicos. Así, visualizando estos aferentes, usando immunoreactivity VGluT2 también permite visualizar los mapas del cuerpo en la corteza somatosensorial primaria que hemos visualizado mediante actividad de citocromo oxidasa (figura 2). Las proteínas selectivas pueden utilizarse también como marcadores celulares para identificar grupos de células genéticamente definidas. Usando immunohistochemistry, identificó grupos de células piramidales en la corteza del entorhinal medial expresan la proteína de unión a calcio, calbindin6 (figura 3) y determinar que grupos de este particular determinaron genéticamente Grupo de células se conservan a través de la evolución5, indicando principios microcircuito comunes subyacentes a su función. Usando múltiples fluoróforos, nosotros también delineó módulos complementarios en la corteza entorrinal intermedio26, demostrando microcircuitos paralelas que subyacen en la memoria espacial.
Históricamente, el cerebro ha sido seccionado en un plano normal a su posición en el cuerpo, en orientaciones sagitales, coronales u horizontales. La identificación de los módulos corticales, como los campos de cañón en la corteza somatosensorial4 también incitó seccionamiento a lo largo de una tangencial y posteriormente en preparaciones corticales aplanados29, aunque fueron casos aislados de tales secciones observa mucho anterior de30,31. Posterior a la identificación de la corteza del cañón, también identificaron otros módulos corticales en la corteza visual primaria27, así como la presencia de un cuerpo completo mapa32 con una representación somatotópicos de cuerpo en primaria Corteza somatosensorial. Aplanado de las secciones de la corteza visual del gato también revelaron la organización topográfica de las columnas de orientación sin necesidad de reconstrucciones adicional33. Modularidad cortical también se ha demostrado en cortezas parahippocampal, incluyendo el presubiculum y parasubiculum26,34 y de la corteza entorrinal intermedio6. Suele aplanar un objeto curvo induce distorsiones en la topografía laminar - como se puede observar por la multitud de proyecciones de la superficie curvada de la tierra en un mapa plano35. Un método relativamente simple para compensar parcialmente estas distorsiones es mediante la introducción de puntos de referencia a distancias definidas antes de acoplar y luego medir la distancia entre ellos después de acoplar. Estas marcas entonces no sólo favorecen al estimar cuantitativamente las distorsiones introducidas por aplastamiento, pero también proporcionan un punto de referencia fácil para alinear las secciones consecutivas. Aspectos cruciales para preservar la fidelidad laminar incluyen asegurar aplanar homogénea a través de la sección y finalmente corte tangencial exactamente a la disposición laminar para obtener optimizadas secciones corticales laminares.
La visualización de los módulos corticales aplanados secciones tangenciales ha desempeñado un papel importante en revelar fascinantes relaciones estructura-función en la corteza cerebral. La representación topográfica de barba y cuerpo en la corteza somatosensorial primaria y la presencia de una red anatómica en los microcircuitos generando células de red funcional en las secciones corticales tangenciales planos revelan complejos microcircuitos información que sería difícil de comprender desde otras orientaciones. Sin embargo, nuestras técnicas actuales proporcionan sólo una rebanada de dos dimensiones de estos módulos esencialmente tridimensionales. Usando técnicas de inmunofluorescencia y tejido claro métodos36,37, sería posible visualizar estos módulos corticales en su conjunto y quizá revelar aún más ideas en nuestra comprensión de mapas corticales y módulos.

Algunos de los cambios más significativos en la estructura del cerebro a través de la filogenia pueden observarse en la corteza cerebral. A pesar de diferencias significativas, la corteza de los animales sigue un patrón común y se puede dividir ampliamente en dos maneras distintas, por capas y áreas1. Capas corticales se encuentran paralelas a la superficie del cerebro y varían en número de 3 capas de cortezas reptiles2 a 6 capas de cortezas mamíferos1. Áreas corticales por el contrario son distintas regiones de la corteza que en gran parte corresponden a diferentes funcionalidades, por ejemplo, la corteza somatosensorial está implicada en la sensación de tacto o la corteza visual en el procesamiento de entradas visuales. Estas áreas corticales pueden a menudo ser subdivididas en parches o módulos de3, que regularmente están repitiendo las estructuras anatómicas, encontradas esencialmente paralelas a la superficie pial del cerebro. Módulos corticales pueden limitarse a un determinado nivel4, o extienden a través de varias capas5.
Métodos estándar de seccionamiento del cerebro involucran las secciones normales a la superficie del cerebro, como coronal o sagital. Aunque estos métodos pueden utilizarse para visualizar los módulos corticales, una multitud de características interesantes puede ser revelada cuando los módulos corticales se visualizan tangencialmente, en un plano paralelo a la superficie del cerebro. Por ejemplo, módulos somatosensoriales en el cerebro de roedor que representa bigotes, aparecen como barriles cuando es visualizado normal a la superficie del cerebro, y así las regiones derivan de la corteza del cañón de nombre. Sin embargo, en la visualización de los barriles en una orientación tangencial, revelan un mapa de barba, con los barriles que están establecidos en una orientación topográfica reflejando la disposición exacta de los bigotes en la superficie externa del cuerpo. En ciertos casos, arreglo modular incluso ha escapado detección durante periodos considerables, cuando es visualizado de manera no tangencial. La corteza del entorhinal medial, se caracteriza por la presencia de células de la red, las neuronas que cuando un animal mueve por medio del fuego en un patrón regular hexagonal. Aunque es un área muy investigada, hasta recientemente, la presencia de parches o módulos de células en la corteza del entorhinal medial, que físicamente se presentan en un patrón hexagonal6, había escapado detección. La presencia y la disposición de estos módulos, en el cerebro de la rata, fue facilitada por hacer secciones tangenciales de la corteza del entorhinal medial e investigar la Citoarquitectura de manera capa-sabio.
Después de seccionar, el aspecto particular de visualización de módulos corticales también puede realizarse de múltiples maneras. Clásicamente, los estudios han delineado módulos basados en células densidad o fibra de diseño1. Otro método popular es el uso de histoquímica de la citocromo oxidasa, que revela las áreas de mayor actividad8. Enfoques más recientes incluyen mirar tipos de células genéticamente determinada, distinguidos sobre la base de su proteína expresión perfiles6,8.
En este estudio, se destacan los métodos para aislar la corteza del cerebro mamífero, obtener secciones tangenciales aplastadas y visualizar módulos corticales basados en citocromo oxidasa histoquímica e inmunohistoquímica de proteínas específicas de tipo celular.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cytochrome oxidase staining</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytochrome c from equine heart</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C2506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3,3&#39;Diaminobenzidine tetrahydrochloride hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5637</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D(+)-Saccharose</td>
			<td>Carl Roth&#160;</td>
			<td>4621.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium nickel(II) sulfate hexahydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A1827</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Carl Roth&#160;</td>
			<td>9105.4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antigen retrieval</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trisodium citrate dihydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S1804</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citric acid monohydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1909</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffer/phosphate-buffered saline/prefix/PFA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium dihydrogen phosphate</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3904.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>9265.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Di-Sodium hydrogen phosphate dihydrate</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>4984.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>0335.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRITON-X 100</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3051.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immunohistochemistry</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calbindin D-28k puriefied from chicken gut, Mouse monoclonal</td>
			<td>Swant</td>
			<td>RRID: AB_10000347</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calbindin D-28k from recombinant rat calbindin D-28k, Rabbit polyclonal</td>
			<td>Swant</td>
			<td>RRID: AB_10000340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumin Fraction V, biotin free</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>0163.4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting or freezing media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount (immunofluorescence)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F4680</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eukitt (histochemistry)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>03989</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue freezing medium</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>NC0696746</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcohol dehydration</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 100%</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>9065.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 96%</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>P075.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Propanol</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>6752.4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene substitute</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>78475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Devices/tools</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microm HM 650V</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Jung RM2035</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #55 Forceps - Inox</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11255-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 Forceps - Inox Biology Tip</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11252-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5SF Forceps - Inox Super Fine Tip</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11252-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bone Shears - 24 cm</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>16150-24</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Friedman Rongeur</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>16000-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blunt Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14000-18</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Scissors - Large Loops</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14101-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Scissors - Sharp-Blunt</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14001-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Iris Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14094-11</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualization of cortical modules in flattened mammalian cortices

La corteza del cerebro mamífero es parcellated en distintas subestructuras o módulos. Módulos corticales normalmente mienten paralelos a la lámina cortical y pueden estar delineados por ciertos métodos histoquímicos e immunohistochemical. En este estudio, podemos destacar un método para aislar la corteza del cerebro mamífero y aplanar para obtener URL de secciones a la hoja de la cortical. Lo más resaltado seleccionado histoquímicos y aplanado de métodos inmunohistoquímicos para procesar estas secciones tangenciales para visualizar los módulos corticales. En la corteza somatosensorial de varios mamíferos, realizamos histoquímica de la citocromo oxidasa para mostrar mapas de cuerpo o módulos corticales que representan diferentes partes del cuerpo del animal. En la corteza del entorhinal medial, un área donde se generan las células de la red, utilizamos métodos inmunohistoquímicos para resaltar módulos de neuronas genéticamente determinadas que se arreglan en un patrón de cuadrícula en la hoja de cortical a través de varias especies. En general, ofrecemos un marco para aislar y preparar layer-wise aplanado secciones corticales y visualizar los módulos corticales mediante histoquímica y métodos inmunohistoquímicos en una amplia variedad de cerebros mamíferos.

Obtenidos de las secciones corticales aplanadas de la corteza somatosensorial en una variedad de cerebros y procesado por histoquímica de la citocromo oxidasa visualizar los módulos somatotópicos representando partes del cuerpo diferentes. Este enfoque comparativo permite estudiar las fuerzas evolutivas forma la corteza, por ejemplo, mostrando muy conservada representación de mistacial vibrissae en roedores y lagomorfos como barriles21 (figura 2). En cambio, otras partes del cuerpo como las patas y órganos genitales muestran variaciones en su relativo tamaño y reflejan la especialización en un nicho ecológico o a selección sexual22,23.
Para entender la arquitectura de la corteza del entorhinal medial, obtuvimos el paralelo de las secciones a la superficie pial. Esto se logró principalmente por secciones tangenciales de la corteza del entorhinal medial en ratones, ratas y murciélagos egipcios. En los seres humanos, debido al tamaño considerablemente más grande y más ondulaciones en la corteza entorrinal, nos suavemente aplana la corteza después de realizar un corte tangencial de la corteza del entorhinal. Posteriormente, todos los cerebros fueron congelados y seccionados en un criostato a 60 μm. inmunohistoquímica se realizó sobre las secciones obtenidas con un anticuerpo anti-calbindin, para visualizar los módulos de calbindin-positive células piramidales en la entorrinal medial corteza5 (figura 3). Los calbindin-módulos de la corteza del entorhinal muestran una periodicidad notable a través de todos estos cerebros y varían en tamaño en sólo un factor de 10 a ~ 20,000-fold variación en cerebro tamaño5.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56992/56992fig2.jpg"> Figura 2: disposición topográfica de los módulos de la corteza de barril en mamíferos identificados por histoquímica de la citocromo oxidasa. Secciones tangenciales de la capa IV de la corteza somatosensorial del ratón (A), gerbil mongol (B), (C) rata, degu (D), (E) hámster, conejo (F), mostrando barriles como un somatotópicos altamente conservado representación de los vibrissae mistacial. Barras de escala = 500 μm. M: L: Lateral, R: Rostral, Medial, Caudal C:; Orientación en el A también se aplica a B-E. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56992/56992fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56992/56992fig3.jpg"> Figura 3: disposición periódica de módulos de Corteza entorrinal medial a través de mamíferos identificados por immunoreactivity calbindin. Secciones tangenciales de la capa II de la corteza del entorhinal medial de ratón (A), (B) rata, murciélago egipcio (C) y (D) humana, mostrando una disposición periódica conservada de módulos calbindin-positive células piramidales. Barras de escala = 250 μm. M: Medial Lateral L:, D: Dorsal, V: Ventral, R: Rostral, Caudal C:; Orientación en D también se aplica a B, C. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56992/56992fig3large.jpg" target="_blank">por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

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Visualization of Cortical Modules in Flattened Mammalian Cortices

Este artículo describe una metodología detallada para obtener secciones tangenciales aplastadas de cortezas mamíferas y visualizar los módulos corticales mediante histoquímica y métodos inmunohistoquímicos.

Visualización de módulos corticales en cortezas mamíferos aplanados

The cortex of mammalian brains is parcellated into distinct substructures or modules. Cortical modules typically lie parallel to the cortical sheet, and ...

visualization-of-cortical-modules-in-flattened-mammalian-cortices

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

12.7K vistas.  Humboldt University of Berlin. Este artículo describe una metodología detallada para obtener secciones tangenciales aplastadas de cortezas mamíferas y visualizar los módulos corticales mediante histoquímica y métodos inmunohistoquímicos.

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Visualization of Larval Segmental Nerves in 3rd Instar Drosophila Larval Preparations

Drosophila melanogaster is emerging as a powerful model system for studying the development and function of the nervous system, particularly because of its convenient genetics and fully sequenced genome. Additionally, the larval nervous system is an ideal model system to study mechanisms of axonal transport as the larval segmental nerves contain bundles of axons with their cell bodies located within the brain and their nerve terminals ending along the length of the body. Here we describe the procedure for visualization of synaptic vesicle proteins within larval segmental nerves. If done correctly, all components of the nervous system, along with associated tissues such as muscles and NMJs, remain intact, undamaged, and ready to be visualized. 3rd instar larvae carrying various mutations are dissected, fixed, incubated with synaptic vesicle antibodies, visualized and compared to wild type larvae. This procedure can be adapted for several different synaptic or neuronal antibodies and changes in the distribution of a variety of proteins can be easily observed within larval segmental nerves.

Visualization of Larval Segmental Nerves in 3rd Instar Drosophila Larval Preparations

Drosophila melanogaster larvae provide an ideal model system to investigate the mechanisms of axonal transport within larval segmental nerves. Using this procedure, 3rd instar larvae carrying various mutations can be compared to wild type larvae.

La visualización de larvas Nervios segmentarios en 3 Rd Instar Drosophila Preparación de larvas

Drosophila melanogaster is emerging as a powerful model system for studying the development and function of the nervous system, particularly because of ...

Investigación

Neurociencias

In vivo Visualization of Synaptic Vesicles Within Drosophila Larval Segmental Axons

Elucidating the mechanisms of axonal transport has shown to be very important in determining how defects in long distance transport affect different neurological diseases. Defects in this essential process can have detrimental effects on neuronal functioning and development. We have developed a dissection protocol that is designed to expose the Drosophila larval segmental nerves to view axonal transport in real time. We have adapted this protocol for live imaging from the one published by Hurd and Saxton (1996) used for immunolocalizatin of larval segmental nerves. Careful dissection and proper buffer conditions are critical for maximizing the lifespan of the dissected larvae. When properly done, dissected larvae have shown robust vesicle transport for 2-3 hours under physiological conditions. We use the UAS-GAL4 method 1 to express GFP-tagged APP or synaptotagmin vesicles within a single axon or many axons in larval segmental nerves by using different neuronal GAL4 drivers. Other fluorescently tagged markers, for example mitochrondria (MitoTracker) or lysosomes (LysoTracker), can be also applied to the larvae before viewing. GFP-vesicle movement and particle movement can be viewed simultaneously using separate wavelengths.

In vivo Visualization of Synaptic Vesicles Within Drosophila Larval Segmental Axons

This protocol discusses the live dissection of Drosophila larvae for the purpose of imaging the movement of GFP tagged axonal vesicles on microtubule tracks.

Visualización en vivo de las vesículas sinápticas En Drosophila segmentaria axones larvas

Elucidating the mechanisms of axonal transport has shown to be very important in determining how defects in long distance transport affect different ...

Automated Interactive Video Playback for Studies of Animal Communication

Video playback is a widely-used technique for the controlled manipulation and presentation of visual signals in animal communication. In particular, parameter-based computer animation offers the opportunity to independently manipulate any number of behavioral, morphological, or spectral characteristics in the context of realistic, moving images of animals on screen. A major limitation of conventional playback, however, is that the visual stimulus lacks the ability to interact with the live animal. Borrowing from video-game technology, we have created an automated, interactive system for video playback that controls animations in response to real-time signals from a video tracking system. We demonstrated this method by conducting mate-choice trials on female swordtail fish, Xiphophorus birchmanni. Females were given a simultaneous choice between a courting male conspecific and a courting male heterospecific (X. malinche) on opposite sides of an aquarium. The virtual male stimulus was programmed to track the horizontal position of the female, as courting males do in the wild. Mate-choice trials on wild-caught X. birchmanni females were used to validate the prototype's ability to effectively generate a realistic visual stimulus.

Video playback is a widely used technique in animal behavior. We created and evaluated a program that applies rules-based, interactive playback of 3-D computer animations in response to real-time, automated data on subject behavior.

Reproducción automática de vídeo interactivo de Estudios de la Comunicación Animal

Video playback is a widely-used technique for the controlled manipulation and presentation of visual signals in animal communication. In particular, ...

Functional Calcium Imaging in Developing Cortical Networks

A hallmark pattern of activity in developing nervous systems is spontaneous, synchronized network activity. Synchronized activity has been observed in intact spinal cord, brainstem, retina, cortex and dissociated neuronal culture preparations. During periods of spontaneous activity, neurons depolarize to fire single or bursts of action potentials, activating many ion channels. Depolarization activates voltage-gated calcium channels on dendrites and spines that mediate calcium influx. Highly synchronized electrical activity has been measured from local neuronal networks using field electrodes. This technique enables high temporal sampling rates but lower spatial resolution due to integrated read-out of multiple neurons at one electrode. Single cell resolution of neuronal activity is possible using patch-clamp electrophysiology on single neurons to measure firing activity. However, the ability to measure from a network is limited to the number of neurons patched simultaneously, and typically is only one or two neurons. The use of calcium-dependent fluorescent indicator dyes has enabled the measurement of synchronized activity across a network of cells. This technique gives both high spatial resolution and sufficient temporal sampling to record spontaneous activity of the developing network.
A key feature of newly-forming cortical and hippocampal networks during pre- and early postnatal development is spontaneous, synchronized neuronal activity (Katz &amp; Shatz, 1996; Khaziphov &amp; Luhmann, 2006). This correlated network activity is believed to be essential for the generation of functional circuits in the developing nervous system (Spitzer, 2006). In both primate and rodent brain, early electrical and calcium network waves are observed pre- and postnatally in vivo and in vitro (Adelsberger et al., 2005; Garaschuk et al., 2000; Lamblin et al., 1999). These early activity patterns, which are known to control several developmental processes including neuronal differentiation, synaptogenesis and plasticity (Rakic &amp; Komuro, 1995; Spitzer et al., 2004) are of critical importance for the correct development and maturation of the cortical circuitry.
In this JoVE video, we demonstrate the methods used to image spontaneous activity in developing cortical networks. Calcium-sensitive indicators, such as Fura 2-AM ester diffuse across the cell membrane where intracellular esterase activity cleaves the AM esters to leave the cell-impermeant form of indicator dye. The impermeant form of indicator has carboxylic acid groups which are able to then detect and bind calcium ions intracellularly.. The fluorescence of the calcium-sensitive dye is transiently altered upon binding to calcium. Single or multi-photon imaging techniques are used to measure the change in photons being emitted from the dye, and thus indicate an alteration in intracellular calcium. Furthermore, these calcium-dependent indicators can be combined with other fluorescent markers to investigate cell types within the active network.

Spontaneous activity of developing neuronal networks can be measured using AM-ester forms of calcium-sensitive indicator dyes. Changes in intracellular calcium, indicating neuronal activation, are detected as transient changes in indicator fluorescence with one- or two-photon imaging. This protocol can be adapted for a range of developmentally-dependent neuronal networks in vitro.

Imagen de calcio funcionales en el desarrollo de redes corticales

A hallmark pattern of activity in developing nervous systems is spontaneous, synchronized network activity. Synchronized activity has been observed in ...

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other insects proprioception is provided by specialized sensory organs termed chordotonal organs (ChOs) 2. Like many other organs in Drosophila, ChOs develop twice during the life cycle of the fly. First, the larval ChOs develop during embryogenesis. Then, the adult ChOs start to develop in the larval imaginal discs and continue to differentiate during metamorphosis.
The development of larval ChOs during embryogenesis has been studied extensively 10,11,13,15,16. The centerpiece of each ChO is a sensory unit composed of a neuron and a scolopale cell. The sensory unit is stretched between two types of accessory cells that attach to the cuticle via specialized epidermal attachment cells 1,9,14. When a fly larva moves, the relative displacement of the epidermal attachment cells leads to stretching of the sensory unit and consequent opening of specific transient receptor potential vanilloid (TRPV) channels at the outer segment of the dendrite 8,12. The elicited signal is then transferred to the locomotor central pattern generator circuit in the central nervous system.
Multiple ChOs have been described in the adult fly 7. These are located near the joints of the adult fly appendages (legs, wings and halters) and in the thorax and abdomen. In addition, several hundreds of ChOs collectively form the Johnston's organ in the adult antenna that transduce acoustic to mechanical energy 3,5,17,4.
In contrast to the extensive knowledge about the development of ChOs in embryonic stages, very little is known about the morphology of these organs during larval stages. Moreover, with the exception of femoral ChOs 18 and Johnston's organ, our knowledge about the development and structure of ChOs in the adult fly is very fragmentary.
Here we describe a method for staining and visualizing ChOs in third instar larvae and pupae. This method can be applied together with genetic tools to better characterize the morphology and understand the development of the various ChOs in the fly.

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

A method to immunostain and visualize chordotonal organs in larvae and pupae of Drosophila melanogaster is described.

Visualización de los propioceptores<em&gt; Drosophila</em&gt; Las larvas y pupas

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other ...

Isolation and Culture of Mouse Cortical Astrocytes

Astrocytes are an abundant cell type in the mammalian brain, yet much remains to be learned about their molecular and functional characteristics. In vitro astrocyte cell culture systems can be used to study the biological functions of these glial cells in detail. This video protocol shows how to obtain pure astrocytes by isolation and culture of mixed cortical cells of mouse pups. The method is based on the absence of viable neurons and the separation of astrocytes, oligodendrocytes and microglia, the three main glial cell populations of the central nervous system, in culture. Representative images during the first days of culture demonstrate the presence of a mixed cell population and indicate the timepoint, when astrocytes become confluent and should be separated from microglia and oligodendrocytes. Moreover, we demonstrate purity and astrocytic morphology of cultured astrocytes using immunocytochemical stainings for well established and newly described astrocyte markers. This culture system can be easily used to obtain pure mouse astrocytes and astrocyte-conditioned medium for studying various aspects of astrocyte biology.

Astrocytes have been recognized to be versatile cells participating in fundamental biological processes that are essential for normal brain development and function, and central nervous system repair. Here we present a rapid procedure to obtain pure mouse astrocyte cultures to study the biology of this major class of central nervous system cells.

Aislamiento y cultivo de astrocitos corticales de ratones

Astrocytes  are an abundant cell type in the mammalian brain, yet much remains to be  learned about their molecular and functional characteristics. In ...

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety of brain disorders1,2. To better understand the mechanisms by which brain circuits react to an animal's experience requires the ability to monitor the experience-dependent molecular changes in a given set of neurons, over a prolonged period of time, in the live animal. While experience and associated neural activity is known to trigger gene expression changes in neurons1,2, most of the methods to detect such changes do not allow repeated observation of the same neurons over multiple days or do not have sufficient resolution to observe individual neurons3,4. Here, we describe a method that combines in vivo two-photon microscopy with a genetically encoded fluorescent reporter to track experience-dependent gene expression changes in individual cortical neurons over the course of day-to-day experience. 
One of the well-established experience-dependent genes is Activity-regulated cytoskeletal associated protein (Arc)5,6. The transcription of Arc is rapidly and highly induced by intensified neuronal activity3, and its protein product regulates the endocytosis of glutamate receptors and long-term synaptic plasticity7. The expression of Arc has been widely used as a molecular marker to map neuronal circuits involved in specific behaviors3. In most of those studies, Arc expression was detected by in situ hybridization or immunohistochemistry in fixed brain sections. Although those methods revealed that the expression of Arc was localized to a subset of excitatory neurons after behavioral experience, how the cellular patterns of Arc expression might change with multiple episodes of repeated or distinctive experiences over days was not investigated. 
In vivo two-photon microscopy offers a powerful way to examine experience-dependent cellular changes in the living brain8,9. To enable the examination of Arc expression in live neurons by two-photon microscopy, we previously generated a knock-in mouse line in which a GFP reporter is placed under the control of the endogenous Arc promoter10. This protocol describes the surgical preparations and imaging procedures for tracking experience-dependent Arc-GFP expression patterns in neuronal ensembles in the live animal. In this method, chronic cranial windows were first implanted in Arc-GFP mice over the cortical regions of interest. Those animals were then repeatedly imaged by two-photon microscopy after desired behavioral paradigms over the course of several days. This method may be generally applicable to animals carrying other fluorescent reporters of experience-dependent molecular changes4.

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

Experience-dependent molecular changes in neurons are essential for the brain's ability to adapt in response to behavioral challenges. An in vivo two-photon imaging method is described here that allows the tracking of such molecular changes in individual cortical neurons through genetically encoded reporters.

In vivo de dos fotones de imágenes de dependientes Experience-Los cambios moleculares en las neuronas corticales

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety ...

Subtype-selective Electroporation of Cortical Interneurons

The study of central nervous system (CNS) maturation relies on genetic targeting of neuronal populations. However, the task of restricting the expression of genes of interest to specific neuronal subtypes has proven remarkably challenging due to the relative scarcity of specific promoter elements. GABAergic interneurons constitute a neuronal population with extensive genetic and morphological diversity. Indeed, more than 11 different subtypes of GABAergic interneurons have been characterized in the mouse cortex1. Here we present an adapted protocol for selective targeting of GABAergic populations. We achieved subtype selective targeting of GABAergic interneurons by using the enhancer element of the homeobox transcription factors Dlx5 and Dlx6, homologues of the Drosophila distal-less (Dll) gene2,3, to drive the expression of specific genes through in utero electroporation.

This procedure shows how to target interneurons in the developing mouse forebrain by means of in utero electroporation. This technique was particularly efficient to achieve selective gene expression in interneuron subtypes destined to the superficial layers of the cortex.

-Subtipo selectivo electroporación de interneuronas corticales

The study of central nervous system (CNS) maturation relies on genetic targeting of neuronal populations. However, the task of restricting the expression ...

Quantification of Filamentous Actin (F-actin) Puncta in Rat Cortical Neurons

Filamentous actin protein (F-actin) plays a major role in spinogenesis, synaptic plasticity, and synaptic stability. Changes in dendritic F-actin rich structures suggest alterations in synaptic integrity and connectivity. Here we provide a detailed protocol for culturing primary rat cortical neurons, Phalloidin staining for F-actin puncta, and subsequent quantification techniques. First, the frontal cortex of E18 rat embryos are dissociated into low-density cell culture, then the neurons grown in vitro for at least 12-14 days. Following experimental treatment, the cortical neurons are stained with AlexaFluor 488 Phalloidin (to label the dendritic F-actin puncta) and microtubule-associated protein 2 (MAP2; to validate the neuronal cells and dendritic integrity). Finally, specialized software is used to analyze and quantify randomly selected neuronal dendrites. F-actin rich structures are identified on second order dendritic branches (length range 25-75 &#181;m) with continuous MAP2 immunofluorescence. The protocol presented here will be a useful method for investigating changes in dendritic synapse structures subsequent to experimental treatments.

Quantification of Filamentous Actin F-actin Puncta in Rat Cortical Neurons

Filamentous actin (F-actin) plays an important role in spinogenesis, synaptic plasticity, and synaptic stability. Quantification of F-actin puncta is therefore a useful tool to study the integrity of synaptic structures. This protocol describes the procedures of quantifying F-actin puncta labeled with Phalloidin in low-density primary cortical neuronal cultures.

La cuantificación de la actina filamentosa (F-actina) puntos lagrimales en las neuronas corticales de rata

Filamentous actin protein (F-actin) plays a major role in spinogenesis, synaptic plasticity, and synaptic stability. Changes in dendritic F-actin rich ...

Visualization of Thalamocortical Axon Branching and Synapse Formation in Organotypic Cocultures

Axon branching and synapse formation are crucial processes for establishing precise neuronal circuits. During development, sensory thalamocortical (TC) axons form branches and synapses in specific layers of the cerebral cortex. Despite the obvious spatial correlation between axon branching and synapse formation, the causal relationship between them is poorly understood. To address this issue, we recently developed a method for simultaneous imaging of branching and synapse formation of individual TC axons in organotypic cocultures.
This protocol describes a method which consists of a combination of an organotypic coculture and electroporation. Organotypic cocultures of the thalamus and cerebral cortex facilitate gene manipulation and observation of axonal processes, preserving characteristic structures such as laminar configuration. Two distinct plasmids encoding DsRed and EGFP-tagged synaptophysin (SYP-EGFP) were co-transfected into a small number of thalamic neurons by an electroporation technique. This method allowed us to visualize individual axonal morphologies of TC neurons and their presynaptic sites simultaneously. The method also enabled long-term observation which revealed the causal relationship between axon branching and synapse formation.

This protocol describes a method for simultaneous imaging of thalamocortical axon branching and synapse formation in organotypic cocultures of the thalamus and cerebral cortex. Individual thalamocortical axons and their presynaptic terminals are visualized by a single cell electroporation technique with DsRed and GFP-tagged synaptophysin.

Visualización de axón talamocorticales ramificación y sinapsis formación en Organotypic Cocultures

Axon branching and synapse formation are crucial processes for establishing precise neuronal circuits. During development, sensory thalamocortical (TC) ...