Name: breast milk enhances growth of enteroids: an ex vivo model of cell proliferation
Uploaded: 2018-02-15T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 2 s
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MG é apoiada por subsídios, K08DK101608 e R03DK111473 do Hospital o National Institutes of Health, março de Dimes Foundation Grant no. 5-FY17-79, das crianças Discovery Institute de Washington University e St. Louis infantil e departamento de Pediatria Washington University School of Medicine, St. Louis. CJL é suportado pelo R01DK104946 (PI: Silverman), Hospital Discovery Institute de Washington University infantil e St. Louis infantil.

Todos os procedimentos de animais neste estudo foram aprovados pelo também da Universidade de Washington em St. Louis institucional Animal cuidados uso Comité (protocolo 20160187) ou cuidados animais institucionais da Universidade de Pittsburgh e Comissão de utilização (protocolo 14103918). Humano intestino fetal em menos de 24 semanas de gestação foi obtido em conformidade com as diretrizes de aquisição de tecido anatômico Universidade de Pittsburgh após aprovação do Conselho de revisão institucional (protocolo PRO14100537) da Universidade de Pittsburgh saúde ciências banco de tecidos através de um sistema de corretor honesto. Leite materno de identificados ou o leite materno pasteurizado doador foi obtido com uma dispensa de consentimento da Universidade de Pittsburgh Conselho de revisão institucional.
1. a cripta isolamento e estabelecimento de Enteroids de ratos Neonatal ou prematuro intestino humano
<ol><li>Preparação de meios de comunicação Nota: Mídia deve ser preparada no bairro no dia anterior o isolamento da cripta.<ol>
<li>Prepare meios de cultura 1,11 L. Começar com 1 L médio modificado águia de Dulbecco (DMEM) com glicose de 4,5 g/L e L-glutamina e adicionar 110 mL soro Fetal bovino (FBS) (10% de concentração final), 11 mL penicilina-estreptomicina (concentração final 1%) e 1,1 mL insulina estéril (final concentração 0,1%).</li>
		<li>Prepare a mistura de 500 mL de PBS-antibiótico. Começar com 500 mL 1 x fosfato salino de Dulbecco (DPBS) com 10% FBS e adicionar 5 mL de gentamicina (concentração final 1%), 1 mL de anfotericina B (0,2% de concentração final) e 5 mL de penicilina-estreptomicina (concentração final 1%).</li>
		<li>Prepare 30 mL célula rompimento Media #1. Primeiro prepare 30 mL de meio de cultura. Adicionar 600 µ l 0,5 M de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) (concentração final 10 mM), 300 µ l gentamicina (concentração final 1%) e 60 µ l de anfotericina B (0,2% de concentração final).</li>
		<li>Prepare 30 mL célula rompimento Media #2. Primeiro prepare 30 mL de meio de cultura. Adicionar 300 µ l EDTA de 0,5 M (concentração final 5 mM), 300 µ l gentamicina (concentração final 1%) e 60 µ l de anfotericina B (0,2% de concentração final).</li>
		<li>Prepare meios de cultura de cripta 50ml sem fatores de crescimento. Medir a 33,4 mL 1 x Advanced DMEM/F-12 e adicionar 10 mL FBS (20% de concentração final).<ol>
<li>Adicionar 500 µ l penicilina-estreptomicina (concentração final 1%), 500 µ l L-glutamina (concentração final 1%), 500 µ l 100 µ l de anfotericina B (0,2% de concentração final), gentamicina (concentração final 1%), 2,5 µ l 1 M N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane ácido sulfônico (HEPES) (concentração final 0,05 mM), 500 µ l 100 mM N-acetilcisteína (concentração final 1 mM), 500 µ l 100 x N-2 suplemento, 1 mL 50 x suplemento isento de soro (por exemplo, B-27) menos vitamina A e 500 µ l 1 mM 100 x Y-27632.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Prepare meios de cultura de cripta de 1 mL com fatores de crescimento. Primeiro Prepare-se 1 mL da cripta meios de cultura sem fatores de crescimento. Adicionar 2,5 µ l 40 µ g/mL Wnt3a (concentração final de 100 ng/mL), 1 µ l 100 µ g/mL Noggin (concentração final de 100 ng/mL), 2 µ l 250 µ g/mL R-Spondin (concentração final 500 ng/mL) e 0,5 µ l 100 µ g/mL EGF (concentração final de 50 ng/mL).</li>
	</ol></li>
	<li>Isolamento da cripta
	<ol>
<li>Lugar solubilizado extrato de membrana basal (ver Tabela de materiais) no gelo para descongelar antes de começar. Nota: Mantenha membrana basal em gelo ou irá polimerizar.</li>
		<li>Em conformidade com o protocolo institucional Cuidado Animal e Comissão de utilização para os ratos maiores que 14 dias de idade, eutanásia em ratos com dois métodos de eutanásia com o segundo sendo um processo físico para velar a morte. Nota: Para os ratos menos de 14 dias de idade, decapitação é o procedimento padrão, usando a tesoura.</li>
		<li>Usando uma tesoura e pinça, faça uma incisão vertical para baixo da linha média do abdômen, através da pele e peritônio, para todo o comprimento do abdômen. Excisar o intestino do estômago ao ceco com tesoura e remover o mesentério com fórceps. Nota: Duas semanas de idade masculinos e femininos C57BL/6J rato filhotes, cada pesagem g 5.5-7, foram utilizados para isolamento de cripta. Qualquer idade ou tamanho do mouse pode ser usado para a isolação de cripta.</li>
		<li>Para preparar o intestino recém-colhidas para isolamento de cripta, posicione o intestino reto e corte o intestino longitudinalmente ao longo de toda a sua extensão com uma tesoura. Nota: Mouse e intestino humano podem ser preparados da mesma forma.</li>
		<li>Limpa fezes do intestino, agitando suavemente o intestino e para trás em um prato de Petri cheia de PBS-antibiótico mistura usando fórceps.</li>
		<li>Adicione 30 mL de célula rompimento Media #1 para um tubo cónico de 50 mL. Corte o intestino em pedaços de comprimento 0,5 cm diretamente no tubo. Definir o tubo em um balde de gelo e agitar suavemente agitador na velocidade mais baixa por 15 min.</li>
		<li>Enquanto os tecidos são o agitador, obter placas de 24 ou 48-boas para crescer criptas se o enteroids está a ser usado para o isolamento de proteínas, DNA ou RNA. Slides de câmara de 8 poços uso crescer criptas se o enteroids está a ser usado para toda a montam imagem latente confocal.</li>
		<li>No capô, adicione 15 µ l de membrana basal para o fundo de cada poço da placa de 24 ou 48-bem. Se usando slides câmara, adicione 9 µ l da membrana basal à parte inferior de cada câmara. Nota: Ajuste de volume da membrana basal de acordo com o tamanho da placa se necessário.</li>
		<li>Espalhou-se rapidamente a membrana basal com a ponta da pipeta para que a membrana basal forma uma camada fina no fundo do poço. Coloque a placa a 37 ° C numa incubadora por 30 min permitir que a membrana basal polimerizar. Nota: As criptas não irão anexar se membrana basal não é uma fina camada ou membrana basal contém bolhas de ar.</li>
		<li>Depois de 15 min em uma coqueteleira, filtre o tecido através de um filtro de 100 µm. Descarte a fluir.</li>
		<li>Adicione 30 mL de célula rompimento Media #2 para um novo tubo cónico de 50 mL. Remover tecido do filtro e adicionar ao tubo.</li>
		<li>Definir o tubo em um balde de gelo e agitar suavemente agitador na velocidade mais baixa por 15 min.</li>
		<li>Depois de 15 min no agitador, filtro tecido através de um filtro de 100 µm. Manter o fluxo através da este passo, no caso de rendimento é baixo em etapas posteriores. Nota: Todo o fluxo através de tubos deve ser mantido no gelo.</li>
		<li>Adicione 15 mL DMEM com glicose de 4,5 g/L e L-glutamina para um novo tubo cónico de 50 mL. Remover tecido do filtro e adicionar ao tubo. Agitar o tubo com a mão para 10 filtro s. através de um filtro de 100 µm e coletar o fluxo através de vigorosamente. Repita até que flua através de contém sem partículas.</li>
		<li>No capô, filtre o fluxo através da etapa anterior em um novo tubo cônico de 50 mL usando 70 µm de filtros para tecido de rato ou 100 µm filtros de tecido humano. Nota: Têm filtros extras no modo de espera e despeje lentamente como filtros vão entupir com detritos.</li>
		<li>Centrifugar o tubo a x 200 g por 8 min a 4 ° C e lugar diretamente em um balde de gelo no bairro. Remova o sobrenadante com uma pipeta sem perturbar o sedimento. Resuspenda o pellet com total quantidade desejada de cripta meios de cultura sem fatores de crescimento. Nota: As criptas enriquecidas são a camada 'areia' da pelota. Bem, cada um exige 250 µ l de cripta meios de cultura sem fatores de crescimento.</li>
	</ol></li>
	<li>Estabelecimento de enteroids
	<ol>
<li>A mistura de mídia cripta directamente sobre a membrana basal da placa.</li>
		<li>Verifique criptas com um microscópio para garantir o processo de isolamento foi bem-sucedido. Nota: As células e bolas de células são desejadas. Aproximadamente 100 criptas individuais são banhadas por bem.</li>
		<li>Incube a placa a 37 ° C por 3 h permitir criptas de aderir a membrana basal. Nota: Esta incubação é com cripta meios de cultura sem fatores de crescimento.</li>
		<li>Remova lentamente a mídia e criptas em excesso que falharam ao conectar usando uma pipeta de P-200. Nota: Não perturbe a membrana basal como criptas anexadas podem tornar-se desalojado.</li>
		<li>Lentamente, adicione 250 µ l de cripta meios de cultura com fatores de crescimento para cada poço. Nota: Para 24-, 48-bem placas, ou câmara desliza, 250 µ l de cripta meios de cultura com fatores de crescimento é suficiente.</li>
		<li>Substitua os meios de comunicação a cada 2 dias com fresco cripta meios de cultura com fatores de crescimento durante 5 dias antes de tratamentos para permitir o crescimento e o acessório ideal.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Mouse recolha de leite materno
<ol><li>Separe uma barragem de C57BL/6J lactante no pós-parto 7-12 dias seus filhotes para 6 h antes da ordenha.</li>
	<li>Anestesiar a barragem lactante com isoflurano através de um cone de nariz e administrar uma injeção subcutânea de ocitocina em 0,15 UI/kg de peso. Espere 3 minutos antes de tentar o procedimento de ordenha.</li>
	<li>Limpar os tetos com etanol a 70% antes do procedimento de ordenha e deixe secar.</li>
	<li>Extrai leite de tetinas, um de cada vez usando uma bomba de mama humano elétrico com tubo de silicone de tamanho para caber as tetinas de rato em um tubo de coleta de 5 mL. Nota: As bombas de mama ideal tem duas configurações, um para a velocidade e outro para a sucção. É melhor começar com o menor configurações de cada um e aumentar ambos lentamente até leite é extraído. Idealmente, o rendimento total será ~ 500 µ l - 1 mL de leite materno de rato por barragem lactante.</li>
	<li>O leite materno imediatamente alíquota e loja a-80 ° C. Nota: Evite congelar/descongelar ciclos.</li>
	<li>Tratar enteroids no dia 5 com 50 µ l/mL de leite materno de rato por mL de meio de cultura de cripta com fatores de crescimento por 24 h a 37 ° C.</li>
</ol>3. toda montagem coloração de Enteroids
<ol><li>
Preparação dos reagentes
	<ol>
<li>Prepare-se 16 mL 1X PBS por 8 poços.</li>
		<li>Prepare o paraformaldeído 4% de 2 mL (PFA) em 1X PBS por 8 poços.</li>
		<li>Prepare-se 2 mL 0,1% Triton X-100 em PBS 1x por 8 poços.</li>
		<li>Preparar 24 mL PBS Tween (PBST é 0.1% Tween 20 em 1X PBS) por 8 poços.</li>
		<li>Preparar o soro de burro normal de 10% 2 mL (NDS) em 0,1% PBST (10% NDS/PBST) por 8 poços.</li>
		<li>Preparar 4 mL 1% NDS em 0,1% PBST (1% NDS/PBST) por 8 poços.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Dia 1 de coloração
	<ol>
<li>Aspire o tratamentos e lavar enteroids com PBS. Adicionar 250 µ l 4% PFA por bem. Coloque no rotator para 1-2 h a 4 ° C. Remover 4% PFA com pipeta.</li>
		<li>Lave 4 vezes com 250 µ l/poço 1 x PBS. Coloque no rotator durante 10 minutos à temperatura ambiente (RT). Nota: É possível armazenar a placa por 1-2 dias a 4 ° C, se necessário.</li>
		<li>Adicionar 250 µ l/poço 0.1% Triton X-100. Incubar durante 1 h em RT. Remove 0,1% Triton X-100 com pipeta.</li>
		<li>Lave 4 vezes com 250 µ l/poço 1 x PBS. Coloque no rotador por 15 min no RT</li>
		<li>Adicionar 250 µ l/poço 10% NDS/PBST. Incubar durante 45 min no RT. Remove 10% NDS/PBST com pipeta.</li>
		<li>Adicionar 250 µ l/poço primário anticorpo, 1/250 diluídos em 1% NDS/PBST e incubar durante a noite a 4 ° C. Nota: A diluição de anticorpo ideal varia de acordo com o fabricante.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Dia 2 de coloração
	<ol>
<li>Lave pelo menos 5 vezes para 4-5 h com 250 µ l/poço PBST. Coloque no rotator a 4 ° C entre cada lavagem.</li>
		<li>Adicione 250 µ l/poço secundário anticorpo, diluído 1/1.000 em 1% NDS/PBST. Embrulhe o prato em folha e incubar durante a noite a 4 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Dia 3 de coloração
	<ol>
<li>Adicione 250 µ l/poço nuclear mancha 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) por 15 min. Nota: Manter a placa no escuro.</li>
		<li>Lavar 6 vezes com 250 µ l/poço PBST. Coloque no rotator durante 10 minutos a 4 ° C entre cada lavagem.</li>
		<li>Monte lamela na câmara deslize com meios de montagem.</li>
		<li>Captar imagens com um microscópio confocal objetivo de 40x e igualmente processar em um editor de gráficos raster (ver Tabela de materiais).</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
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Os autores têm nada para divulgar e sem conflitos de interesse.

O epitélio intestinal é composto de muitos subtipos celulares que são responsáveis por fornecer a defesa do hospedeiro contra patógenos, mantendo a integridade de barreira do intestino e podem ser rompidos na patogênese de diversas doenças. Enquanto modelos animais podem recapitular algumas facetas da doença, o modelo ex vivo de enteroids derivado do intestino de ratos e humanos fornece uma plataforma para testar os efeitos de vários tratamentos. A importância do modelo de enteroid permite que os pesquisadores de cultura e diferenciar as células-tronco intestinais em todos os subtipos celulares epiteliais de ingênuo ou animais doentes e os seres humanos que não estão disponíveis com os métodos existentes. Este sistema de modelo pode ser usado para infecções com agentes patogénicos humanos que não podem ser facilmente traduzíveis para o rato, como enterovírus25 ou norovírus26 entre outros. O modelo enteroid tem várias vantagens e usos; no entanto, deve-se ter cuidado para garantir a consistência nos reagentes que são usados para fazer a mídia e os fatores de crescimento exógenos específicos que são necessários para a sobrevivência da enteroids.
Dentro do modelo de enteroid, várias etapas são de fundamental importância para garantir o sucesso na produção de enteroids. Para minimizar o tempo de isquemia frio, tecido deve ser processado de forma expedita. Enteroids pode ser produzido até 24 h após o tecido é colhido, se o tecido é colocado no meio de Roswell Park Memorial Institute (RPMI) a 4 ° C. Isto pode facilitar a opção de frete ou transporte se necessário. Para o estabelecimento de enteroids, a membrana basal deve ser uma camada fina, plana na parte inferior de cada poço para as criptas anexar e crescer. Se a membrana basal não é plana ou tem bolhas presentes, criptas podem falhar aderir e será removido quando a mídia é alterada. Depois que os enteroids são estabelecidos, podem ser passadas a cada 7 dias ou congelados em nitrogênio líquido para armazenamento a longo prazo. Remoção e adição de meios de cultura de cripta com fatores de crescimento e a administração de cada tratamento devem ser feitos lentamente e à borda de cada poço a evitar perturbar a enteroids. Interrupção da enteroids pode causar-lhes para se tornar independente e lavados quando a mídia é alterada. Para os melhores resultados, deve ter-se cuidado para preservar a integridade da membrana basal e o enteroids anexado.
No estudo atual, nós relatamos que enteroids derivado de ratos Neonatais e prematuros podem crescer e se proliferam na presença de diferentes tipos de leite materno. Estes estudos avançam nossa compreensão dos efeitos do leite materno sobre o intestino prematuro. Nós fornecemos um método detalhado sobre como estabelecer enteroid culturas em laboratório de seres humanos e ratos. Além disso, vamos demonstrar um método eficiente de coleta de leite materno de um rato lactante usando uma bomba de mama humano elétrico modificado. Mostramos esse rato, o leite materno de humanos e pasteurizado doador reforçar o crescimento e proliferação de enteroids de ratos e humanos. Além disso, mostramos enteroid diminuição da proliferação na presença do ligante de TLR4 LPS, que foi restaurado quando o mouse, humanos ou doador de leite materno foi administrado para o enteroids. As aplicações futuras podem incluir medicamento personalizado precisão com telas de drogas alto throughput em enteroids obtidos de lactentes após a ressecção intestinal, para ver como certos medicamentos podem afetar a criança especial. Tomados em conjunto, esperamos que outros laboratórios encontre sucesso potencial na utilização destas técnicas em muitos reinos diferentes pediátrica doenças do intestino, incluindo NEC, onde existe uma necessidade clínica urgente de desenvolver novas estratégias terapêuticas.

Enterocolite necrosante (NEC) é a principal causa de morte por doença gastrintestinal em recém-nascidos prematuros, afetando quase 1 em cada 10 bebés nascidos antes de 29 semanas de gestação,1,2,3. Metade dos infantes com o progresso da NEC para a forma mais grave, onde a sobrevivência é apenas 10-30%4,5. Nos Estados Unidos, uma estimativa de USD 2 bilhões por ano são gastos para tratamento de lactentes com NEC6,7, no entanto, a taxa de sobrevivência, nem terapia tem mudado ao longo dos últimos 30 anos. A patogênese da NEC é caracterizada por lesões intestinais e deficientes auditivos da mucosa cura8,9,10,11, no entanto, as vias de sinalização levando a uma exacerbada resposta inflamatória e mecanismos para reverter a inflamação permanecem incompletamente compreendidos.
A administração de leite materno foi encontrada para ser a estratégia apenas proteção contra NEC para prematuros. Mostramos anteriormente que o leite materno protege contra o desenvolvimento da NEC através da inibição do receptor tipo toll receptor imune inata 4 (TLR4) no epitélio intestinal através do receptor de fator de crescimento epidérmico (EGFR) sinalização via11. Suplementação do leite materno para uma fórmula de NEC experimental atenuado a resposta inflamatória, vista no NEC, como demonstrado por inibição da apoptose enterócito e restauração do enterócito proliferação de uma forma que era dependente de crescimento epidérmico factor (EGF) e EGFR11. Em outro estudo, foi demonstrado que o nitrato, outro componente do leite materno, contribui para sua natureza protetora, modulando a perfusão intestinal, em comparação com a fórmula infantil, que é desprovido de nitrato e pode contribuir para o aumento da frequência do NEC em Fórmula alimentados infantes12,13. Outros compostos presentes no leite materno que foram mostrados para ser envolvido na proteção contra NEC incluem oligossacarídeos do leite humano, L-arginina, glutamina e lactoferrina14,15,16, 17,18,19. Estes elementos benéficos do leite materno revelam a necessidade de seu uso na prevenção da NEC, mas também salientam a importância de se estudar os mecanismos, sinalização de caminhos e efeitos celulares envolveram em como o leite materno é mediar a proteção contra NEC .
Em ordem para um estudo mais aprofundado as propriedades protetoras do leite materno em um modelo do rato da NEC, desenvolvemos uma técnica de novela, fácil de usar por que mouse leite materno pode ser extraído de uma barragem anestesiada usando um elétrico materno bomba11,12 . Esta estratégia de aquisição de leite materno de rato é vantajosa, não só porque as bombas de mama humano são prontamente disponível e eficiente na aquisição de leite materno, mas também porque este método permite análises de leite materno espécie-específicos. Como resultado, nós podemos comparar os efeitos do leite materno de rato com os do leite materno humano bem como pasteurizado o leite humano doador de um banco de leite em modelos espécie-específicos. Esta técnica permite o estudo dos componentes do leite materno em relação à sua contribuição para a prevenção da NEC. Outros investigadores têm desenvolvido métodos de extração de leite materno, no entanto, essas técnicas são manuais e geralmente exigem mais do que um laboratório membro20,21,22. Aqui apresenta-se uma técnica fácil que pode ser utilizada, modificando uma bombinha elétrica humana para coletar leite de um rato. Esta técnica também pode ser aplicada a outras espécies.
Para interrogar adequadamente as vias de sinalização envolvidas com NEC, sistemas modelo são necessários para avaliar todos os tipos de célula diferente, conhecidos por ser afetados no processo de doença. Aqui, vamos discutir um tal sistema de modelo - enteroids - e o seu estabelecimento de rato e o intestino delgado humano. Enteroids intestinais humanas (HIEs), em particular, fornecer promessa significativa, porque eles oferecem um inovador, geneticamente diversos ex vivo modelo humano para auxiliar no estudo de processos fisiopatológicos que ocorrem no trato gastrointestinal 23. Enteroids foram encontrados para ser cultivadas a longo prazo e pode ser congelados para posterior utilização23, e ao contrário de Organoids Intestinal humana (HIOs), cujas culturas são desenvolvidas a partir de células-tronco pluripotentes inducible, enteroids são gerados a partir de células-tronco dentro de criptas intestinais isoladas24. Enteroids exigem menos manutenção, pode ser infectado rapidamente25e pode ser facilmente estabelecido desde criptas intestinais são mais diferenciadas que HIOs23. Portanto, HIEs oferecem muitas vantagens sobre as técnicas existentes, porque eles podem ser desenvolvidos para exibem propriedades de composição e funcionais específicas da região o epitélio gastrointestinal humano23. O uso de enteroids é uma opção altamente eficaz quando precisar de um modelo humano do intestino, com aderência às limitações específicas da região e a facilidade de uso. Aqui vamos demonstrar a técnica de isolar e manutenção primária células-tronco derivadas pequeno intestinal enteroids de camundongos e humanos prematuros.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco&#039;s Modified Eagle&#039;s Medium (DMEM) with 4.5 g/L Glucose and L-Glutamine</td><td>Lonza</td><td>12-604F</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Gibco</td><td>26140-079</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Humulin N (Insulin)</td><td>Eli Lilly And Company</td><td>0002-8315</td><td></td></tr><tr><td>1x Dulbecco&#039;s Phosphate-Buffered Saline (DPBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicin</td><td>Gibco</td><td>15750-060</td><td></td></tr><tr><td>Amphotericin B</td><td>Gibco</td><td>15290-026</td><td></td></tr><tr><td>0.5 M Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), pH 8.0</td><td>Invitrogen</td><td>15575-020</td><td></td></tr><tr><td>1x Advanced DMEM/F-12</td><td>Invitrogen</td><td>12634-028</td><td></td></tr><tr><td>200 mM L-Glutamine</td><td>Gibco</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>1 M N-2-Hydroxyethylpiperazine-N-2-Ethane Sulfonic Acid (HEPES)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3537</td><td></td></tr><tr><td>N-Acetylcysteine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9165</td><td></td></tr><tr><td>100x N-2 Supplement</td><td>Gibco</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>50x B-27 Supplement Minus Vitamin A</td><td>Gibco</td><td>08-0085SA</td><td></td></tr><tr><td>100x ROCK Inhibitor Y-27632, Dihydrochloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y0503</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant Mouse Wnt3a Protein</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>1324-WN</td><td></td></tr><tr><td>Murine Noggin</td><td>PeproTech</td><td>250-38</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant Mouse R-Spondin 1</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>3474-RS</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant Murine Epidermal Growth Factor (EGF)</td><td>PeproTech</td><td>315-09</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel Growth Factor Reduced Basement Membrane Matrix</td><td>Corning</td><td>356231</td><td></td></tr><tr><td>35 x 10 mm Cell Culture Petri Dish</td><td>Eppendorf</td><td>0030700112</td><td></td></tr><tr><td>24-Well Cell Culture Plate</td><td>Eppendorf</td><td>0030722116</td><td></td></tr><tr><td>48-Well Cell Culture Plate</td><td>Eppendorf</td><td>0030723112</td><td></td></tr><tr><td>8-Well Nunc Lab-Tek II Chamber Slide System</td><td>Thermo Scientific</td><td>154534</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Conical Tube</td><td>Corning</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>100 &amp;mu;M Sterile Cell Strainer</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-363-549</td><td></td></tr><tr><td>70 &amp;mu;M Sterile Cell Strainer</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-363-548</td><td></td></tr><tr><td>1x Phosphate-Buffered Saline (PBS), pH 7.2</td><td>Invitrogen</td><td>20012-027</td><td></td></tr><tr><td>16% Paraformaldehyde (PFA)</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>Normal Donkey Serum (NDS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9663</td><td></td></tr><tr><td>4&#039;,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride (DAPI)</td><td>Invitrogen</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>Microscope Cover Glass</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544-D</td><td></td></tr><tr><td>Confocal Microscope Leica TCS SP8 X</td><td>Leica Microsystems</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Photoshop CS6</td><td>Adobe Systems</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>18 G 1.5 Inch Needle</td><td>Becton Dickinson</td><td>305196</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>792632</td><td></td></tr><tr><td>Oxytocin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>O3251</td><td></td></tr><tr><td>Human Double Electric Breast Pump</td><td>Lansinoh</td><td>044677530163</td><td></td></tr><tr><td>5 mL Round Bottom Test Tube</td><td>Corning</td><td>352058</td><td></td></tr><tr><td>Rubber Stoppers</td><td>Frey Scientific</td><td>560761</td><td></td></tr><tr><td>Ki67 Antibody</td><td>Abcam</td><td>AB15580</td><td></td></tr><tr><td>Human Mki67 primer F: 5&#039;-GACCTCAAACTGGCTCCTAATC-3&#039; R: 5&#039;-GCTGCCAGATAGAGTCAGAAAG-3&#039;</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A</td><td></td></tr></tbody></table>

breast milk enhances growth of enteroids: an ex vivo model of cell proliferation

Enteroids intestinais pequenos humanos derivam das criptas e quando cultivadas em um nicho de células-tronco contêm todos os tipos de células epiteliais. A capacidade de estabelecer sistemas de enteroid humana ex vivo cultura são importantes fisiopatologia intestinal modelo e estudar a resposta celular particular envolvido. Nos últimos anos, enteroids de camundongos e humanos estão sendo cultivadas, passadas e bancados afastado para uso futuro em vários laboratórios em todo o mundo. Esta plataforma de enteroid pode ser usada para testar os efeitos de vários tratamentos e drogas e os efeitos que são exercidos sobre diferentes tipos de células no intestino. Aqui, um protocolo para o estabelecimento principal células-tronco derivadas pequeno intestinal enteroids derivado de ratos Neonatais e intestino humano prematuro é fornecido. Além disso, este sistema de cultura de enteroid foi utilizado para testar os efeitos do leite materno espécie-específicos. O leite materno do mouse pode ser obtido com eficiência usando uma bomba de mama humano modificado e leite expressa do mouse pode ser usado para mais experiências de pesquisa. Podemos agora demonstrar os efeitos de mouse expressado, humano, e o leite materno doador sobre o crescimento e a proliferação de enteroids derivado de ratos neonatais ou prematuro intestino humano.

Primeiro procuramos investigar se expressou o leite materno ou leite pasteurizado doador teve um efeito na pequena enteroids intestinal. Na verdade, leite materno e leite materno de doadores aumentaram o crescimento de prematuro humana derivada enteroids (figura 1B) e rato neonatal (figura 1A).
Desde que o leite materno humano aumentou o crescimento de pequenas enteroids intestinal, investigamos em seguida se o leite materno teve um efeito sobre a proliferação de enteroids humana prematura. Demonstramos que o leite materno aumenta a proliferação de enteroids humana prematura em relação ao controle (Figura 2A–B, Ki67, de coloração vermelha). Importante, o leite materno humano doador também aumentou a proliferação de enteroid comparada ao controle, mas para um grau ligeiramente menor do que o leite materno não-pasteurizadas (Figura 2B–C). Em seguida, nós avaliada a expressão de RNAm de Ki67 no enteroids humano prematuro e descobriu que Ki67 foi aumentada na enteroids tratados com leite materno ou leite materno de doadores em relação ao controle (Figura 2D).
Em seguida queríamos ver se estes efeitos foram espécie-específicos com relação ao leite materno. Desenvolvemos uma maneira de coletar leite de ratos lactantes, usando uma bomba de mama humano disponível comercialmente modificados como referências11,12. Retratado é uma barragem de lactante anestesiada, passando a coleta de leite usando este dispositivo (Figura 3). A próxima série de experimentos foi realizada na enteroids de rato e avaliamos os efeitos da proliferação de leite materno de rato, humano ou doador de leite materno. Como mostrado na Figura 4, rato, humano, e proliferação aumentada no enteroids do mouse em relação ao controle (Figura 4A–D) de leite materno pasteurizado doador. Proliferação em enteroids o rato foi diminuída na presença do ligante TLR4, lipopolissacarídeo (LPS), comparado ao controle (Figura 4A, E). Importante, rato, humano ou doador mama leite todo restaurado enteroid proliferação na presença de LPS, como demonstrado pelo aumento de coloração Ki67 comparado com LPS sozinho (Figura 4F–H).
De nossas experiências, mostramos que enteroids intestinal pequena derivada de ratos Neonatais e prematuro intestino fetal humano pode ser mantido em cultura. Além disso, nós fornecemos um método de coleta de leite materno romance que fornece uma maneira eficiente para extrair o leite materno de ratos, que podem ser usados para várias experiências. Descobrimos que o leite materno de humanos ou ratos aumentou o tamanho, crescimento e proliferação no mouse e enteroids humana. Além disso, o mouse, humanos e doadora de leite materno restaurado a proliferação de enteroid após a exposição de LPS. Isto sugere que o leite materno pode exercer efeitos anti-inflamatórios no intestino delgado dos ratos e seres humanos.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56921/56921fig1.jpg"> Figura 1. O leite materno e o leite materno doador aumentam o tamanho e o crescimento de rato e enteroids humana prematura. Fotomicrografias de pequenas enteroids intestinal de ratos neonatais (p14) ou intestino humano prematuro tratadocom com mídia (controle), o leite materno ou leite de doador (50 µ l/mL) para a barra de tamanho de 24 h.: 1.000 µm. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56921/56921fig1large.jpg" target="_blank">por favor clique aqui para ver uma versão maior deste Figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56921/56921fig2.jpg"> Figura 2. O leite materno e o leite materno doador aumentam a proliferação de enteroids humana prematura. (A) Confocal micrografias de prematuro enteroids humano cultivados por 5 dias, tratados com leite materno e o leite materno pasteurizado doador para 24h e manchada para o marcador de proliferação Ki67 (vermelho) e DAPI (nuclear, azul). Barra de tamanho: 50 µm. (B) qRT-PCR para Ki67 expressão de enteroids humana em relação ao gene da limpeza RPLO. n = 5 por grupo. p < 0,0001 comparações com o teste t de Student em relação ao controle. Dados são média ± desvio-padrão. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56921/56921fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56921/56921fig3.jpg"> Figura 3. Coleção de leite de um mouse anestesiado utilizando uma bomba de mama humano modificado. Tubulação de bomba de mama humano estéril colocado no tetinas da barragem lactante anestesiada depois de receber injeção de oxitocina. Leite de rato é coletada usando a bomba de mama humano na velocidade média e potência em um tubo de coleta de 5 mL. Coletivos volumes extraídos todos variam de tetinas de 500 µ l a 1 mL por rato em dias pós-natal 7-12. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56921/56921fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56921/56921fig4.jpg"> Figura 4. Mouse, humano, e leite pasteurizado doador aumentar a proliferação de rato enteroid. (A H) Confocal micrografias de p14 pequeno rato intestinal enteroids (controle, A) tratadocom com leite materno de rato (MBM, B), leite materno (BM, C), ou leite materno de doador humano (DBM, D) em 50 µ l/mL de mídia por 12h na ausência ( A-D) ou presença de lipopolissacarídeo (LPS) na dose de 25 µ g/mL de mídia por 12h, (E-H) e manchados para o DAPI (nuclear, azul) e o marcador de proliferação Ki67 (vermelho). Barra de tamanho: 50 µm. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56921/56921fig4large.jpg" target="_blank">clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Breast Milk Enhances Growth of Enteroids: An Ex Vivo Model of Cell Proliferation

O leite materno aumenta o crescimento de Enteroids: um modelo Ex Vivo da proliferação celular

Este protocolo descreve como estabelecer um sistema de cultura de enteroid de rato neonatal ou intestino humano prematuro, bem como um método eficiente para coletar leite de ratos.

Human small intestinal enteroids are derived from the crypts and when grown in a stem cell niche contain all of the epithelial cell types. The ability to ...

breast-milk-enhances-growth-enteroids-an-ex-vivo-model-cell

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Medicine

Breast Milk Enhances Growth of Enteroids: An Ex Vivo Model of Cell Proliferation

19.4K visualizações.  Washington University School of Medicine. Este protocolo descreve como estabelecer um sistema de cultura de enteroid de rato neonatal ou intestino humano prematuro, bem como um método eficiente para coletar leite de ratos.

Vídeo: Breast Milk Enhances Growth of Enteroids: An Ex Vivo Model of Cell Proliferation

Nutrient Regulation by Continuous Feeding for Large-scale Expansion of Mammalian Cells in Spheroids

In this demonstration, spheroids formed from the &#946;-TC6 insulinoma cell line were cultured as a model of manufacturing a mammalian islet cell product to demonstrate how regulating nutrient levels can improve cell yields. In previous studies, bioreactors facilitated increased culture volumes over static cultures, but no increase in cell yields were observed. Limitations in key nutrients such as glucose, which were consumed between batch feedings, can lead to limitations in cell expansion. Large fluctuations in glucose levels were observed, despite the increase in glucose concentrations in the media. The use of continuous feeding systems eliminated fluctuations in glucose levels, and improved cell growth rates when compared with batch fed static and SSB culture methods. Additional increases in growth rates were observed by adjusting the feed rate based on calculated nutrient consumption, which allowed the maintenance of physiological glucose over three weeks in culture. This method can also be adapted for other cell types.

Nutrient regulation using continuous growth adjusted feeding improves growth rates of mammalian cell spheroids compared to intermittent batch feeding for cultures in stirred suspension bioreactors. This study demonstrates the methods required for establishing simple adjusted rate fed cultures.

Nutrient regulamento, a alimentação contínua de Expansão em grande escala de células de mamíferos em Spheroids

In this demonstration, spheroids formed from the &#946;-TC6 insulinoma cell line were cultured as a model of manufacturing a mammalian islet cell product ...

Bioengenharia

Mammary Epithelial and Endothelial Cell Spheroids as a Potential Functional In vitro Model for Breast Cancer Research

Breast cancer is the leading cause of mortality in women. The growth of breast cancer cells and their subsequent metastasis is a key factor for its progression. Although the mechanisms involved in promoting breast cancer growth have been intensively studied using monocultures of breast cancer cells such as MCF-7 cells, the contribution of other cell types, such as vascular and lymphatic endothelial cells that are intimately involved in tumor growth, has not been investigated in depth. Cell-cell interaction plays a key role in tumor growth and progression. Neoangiogenesis, or the development of vessels, is essential for tumor growth, whereas the lymphatic system serves as a portal for cancer cell migration and subsequent metastasis. Recent studies provide evidence that vascular and lymphatic endothelial cells can significantly influence cancer cell growth. These observations imply a need for developing in vitro models that would more realistically reflect breast cancer growth processes in vivo. Moreover, restrictions in animal research require the development of ex vivo models to elucidate better the mechanisms involved.
This article describes the development of breast cancer spheroids composed of both breast cancer cells (estrogen receptor-positive MCF-7 cells) and vascular and/or lymphatic endothelial cells. The protocol describes a detailed step-by-step approach in creating dual-cell spheroids using two different approaches, hanging drop (gold standard and cheap) and 96-well U-bottom plates (expensive). In-depth instructions are provided for how to delicately pick up the formed spheroids to monitor growth by microscopic sizing and assessing viability using dead and live cell staining. Moreover, procedures to fix the spheroids for sectioning and staining with growth-specific antibodies to differentiate growth patterns in spheroids are delineated. Additionally, details for preparing spheroids with transfected cells and methods to extract RNA for molecular analysis are provided. In conclusion, this article provides in-depth instructions for preparing multi-cell spheroids for breast cancer research.

Mammary Epithelial and Endothelial Cell Spheroids as a Potential Functional In vitro Model for Breast Cancer Research

Crosstalk between mammary epithelial cells and endothelial cells importantly contributes to breast cancer progression, tumor growth, and metastasis. In this study, spheroids have been made from breast cancer cells together with vascular and/or lymphatic endothelial cells and demonstrate their applicability as an in vitro system for breast cancer research.

Eferóides de células epiteliais e endoteliais como um modelo in vitro potencial funcional para pesquisa de câncer de mama

Breast cancer is the leading cause of mortality in women. The growth of breast cancer cells and their subsequent metastasis is a key factor for its ...

Pesquisa do câncer

Recapitulating Suckling-to-Weaning Transition In Vitro using Fetal Intestinal Organoids

At the end of the suckling period, many mammalian species undergo major changes in the intestinal epithelium that are associated with the capability to digest solid food. This process is termed suckling-to-weaning transition and results in the replacement of neonatal epithelium with adult epithelium which goes hand in hand with metabolic and morphological adjustments. These complex developmental changes are the result of a genetic program that is intrinsic to the intestinal epithelial cells but can, to some extent, be modulated by extrinsic factors. Prolonged culture of mouse primary intestinal epithelial cells from late fetal period, recapitulates suckling-to-weaning transition in vitro. Here, we describe a detailed protocol for mouse fetal intestinal organoid culture best suited to model this process in vitro. We describe several useful assays designed to monitor the change of intestinal functions associated with suckling-to-weaning transition over time. Additionally, we include an example of an extrinsic factor that is capable to affect suckling-to-weaning transition in vivo, as a representation of modulating the timing of suckling-to-weaning transition in vitro. This in vitro approach can be used to study molecular mechanisms of the suckling-to-weaning transition as well as modulators of this process. Importantly, with respect to animal ethics in research, replacing in vivo models by this in vitro model contributes to refinement of animal experiments and possibly to a reduction in the use of animals to study gut maturation processes.

This protocol describes how to mimic suckling-to-weaning transition in vitro using mouse late fetal intestinal organoids cultured for 30 days.

Recapitulando a transição de amamentação in vitro usando organóides intestinais fetais

At the end of the suckling period, many mammalian species undergo major changes in the intestinal epithelium that are associated with the capability to ...

Biologia do Desenvolvimento

Generation of Mosaic Mammary Organoids by Differential Trypsinization

Organoids offer self-organizing, three-dimensional tissue structures that recapitulate physiological processes in the convenience of a dish. The murine mammary gland is composed of two distinct epithelial cell compartments, serving different functions: the outer, contractile myoepithelial compartment and the inner, secretory luminal compartment. Here, we describe a method by which the cells comprising these compartments are isolated and then combined to investigate their individual lineage contributions to mammary gland morphogenesis and differentiation. The method is simple and efficient and does not require sophisticated separation technologies such as fluorescence activated cell sorting. Instead, we harvest and enzymatically digest the tissue, seed the epithelium on adherent tissue culture dishes, and then use differential trypsinization to separate myoepithelial from luminal cells with ~90% purity. The cells are then plated in an extracellular matrix where they organize into bilayered, three-dimensional (3D) organoids that can be differentiated to produce milk after 10 days in culture. To test the effects of genetic mutations, cells can be harvested from wild type or genetically engineered mouse models, or they can be genetically manipulated prior to 3D culture. This technique can be used to generate mosaic organoids that allow investigation of gene function specifically in the luminal or myoepithelial compartment.

The mammary gland is a bilayered structure, comprising outer myoepithelial and inner luminal epithelial cells. Presented is a protocol to prepare organoids using differential trypsinization. This efficient method allows researchers to separately manipulate these two cell types to explore questions concerning their roles in mammary gland form and function.

Geração de Organóides Mammary mosaicos por Trypsinização Diferencial

Organoids offer self-organizing, three-dimensional tissue structures that recapitulate physiological processes in the convenience of a dish. The murine ...

Establishment of Human Epithelial Enteroids and Colonoids from Whole Tissue and Biopsy

The epithelium of the gastrointestinal tract is constantly renewed as it turns over. This process is triggered by the proliferation of intestinal stem cells (ISCs) and progeny that progressively migrate and differentiate toward the tip of the villi. These processes, essential for gastrointestinal homeostasis, have been extensively studied using multiple approaches. Ex vivo technologies, especially primary cell cultures have proven to be promising for understanding intestinal epithelial functions. A long-term primary culture system for mouse intestinal crypts has been established to generate 3-dimensional epithelial organoids. These epithelial structures contain crypt- and villus-like domains reminiscent of normal gut epithelium. Commonly, termed &#8220;enteroids&#8221; when derived from small intestine and &#8220;colonoids&#8221; when derived from colon, they are different from organoids that also contain mesenchyme tissue. Additionally, these enteroids/colonoids continuously produce all cell types found normally within the intestinal epithelium. This in vitro organ-like culture system is rapidly becoming the new gold standard for investigation of intestinal stem cell biology and epithelial cell physiology. This technology has been recently transferred to the study of human gut. The establishment of human derived epithelial enteroids and colonoids from small intestine and colon has been possible through the utilization of specific culture media that allow their growth and maintenance over time. Here, we describe a method to establish a small intestinal and colon crypt-derived system from human whole tissue or biopsies. We emphasize the culture modalities that are essential for the successful growth and maintenance of human enteroids and colonoids.

We describe a method to establish human enteroids from small intestinal crypts and colonoids from colon crypts collected from both surgical tissue and biopsies. In this methodological article, we present the culture modalities that are essential for the successful growth and maintenance of human enteroids and colonoids.

Estabelecimento de epiteliais humanas Enteroids e Colonoids de tecido inteiro e biópsia

The epithelium of the gastrointestinal tract is constantly renewed as it turns over. This process is triggered by the proliferation of intestinal stem ...

Medicina

Evaluation of Mammary Gland Development and Function in Mouse Models

The human mammary gland is composed of 15-20 lobes that secrete milk into a branching duct system opening at the nipple. Those lobes are themselves composed of a number of terminal duct lobular units made of secretory alveoli and converging ducts1. In mice, a similar architecture is observed at pregnancy in which ducts and alveoli are interspersed within the connective tissue stroma. The mouse mammary gland epithelium is a tree like system of ducts composed of two layers of cells, an inner layer of luminal cells surrounded by an outer layer of myoepithelial cells denoted by the confines of a basement membrane2. At birth, only a rudimental ductal tree is present, composed of a primary duct and 15-20 branches. Branch elongation and amplification start at the beginning of puberty, around 4 weeks old, under the influence of hormones3,4,5. At 10 weeks, most of the stroma is invaded by a complex system of ducts that will undergo cycles of branching and regression in each estrous cycle until pregnancy2. At the onset of pregnancy, a second phase of development begins, with the proliferation and differentiation of the epithelium to form grape-shaped milk secretory structures called alveoli6,7. Following parturition and throughout lactation, milk is produced by luminal secretory cells and stored within the lumen of alveoli. Oxytocin release, stimulated by a neural reflex induced by suckling of pups, induces synchronized contractions of the myoepithelial cells around the alveoli and along the ducts, allowing milk to be transported through the ducts to the nipple where it becomes available to the pups 8. Mammary gland development, differentiation and function are tightly orchestrated and require, not only interactions between the stroma and the epithelium, but also between myoepithelial and luminal cells within the epithelium9,10,11. Thereby, mutations in many genes implicated in these interactions may impair either ductal elongation during puberty or alveoli formation during early pregnancy, differentiation during late pregnancy and secretory activation leading to lactation12,13. In this article, we describe how to dissect mouse mammary glands and assess their development using whole mounts. We also demonstrate how to evaluate myoepithelial contractions and milk ejection using an ex-vivo oxytocin-based functional assay. The effect of a gene mutation on mammary gland development and function can thus be determined in situ by performing these two techniques in mutant and wild-type control mice.

This method describes how to dissect and assess mammary gland development and function from mice. Excised mammary glands are assessed for the degree of development using whole mount while milk ejection is evaluated using an oxytocin-based myoepithelial cell contraction assay.

Avaliação do desenvolvimento da glândula mamária e Função em modelos de ratos

The human mammary gland is composed of 15-20 lobes that secrete milk into a branching duct system opening at the nipple. Those lobes are themselves ...

Biologia

Growth and Characterization of Irradiated Organoids from Mammary Glands

Organoids derived from the digested tissue are multicellular three-dimensional (3D) constructs that better recapitulate in vivo conditions than cell monolayers. Although they cannot completely model in vivo complexity, they retain some functionality of the original organ. In cancer models, organoids are commonly used to study tumor cell invasion. This protocol aims to develop and characterize organoids from the normal and irradiated mouse mammary gland tissue to evaluate the radiation response in normal tissues. These organoids can be applied to future in vitro cancer studies to evaluate tumor cell interactions with irradiated organoids. Mammary glands were resected, irradiated to 20 Gy and digested in a collagenase VIII solution. Epithelial organoids were separated via centrifugal differentiation, and 3D organoids were developed in 96-well low-adhesion microplates. Organoids expressed the characteristic epithelial marker cytokeratin 14. Macrophage interaction with the organoids was observed in co-culture experiments. This model may be useful for studying tumor-stromal interactions, infiltration of immune cells, and macrophage polarization within an irradiated microenvironment.

Organoids developed from mouse mammary glands were irradiated and characterized to assess epithelial traits and interactions with immune cells. Irradiated organoids can be used to better evaluate cell-cell interactions that may lead to tumor cell recruitment in irradiated normal tissue.

Crescimento e caracterização de organóides irradiados de glândulas mamárias

Organoids derived from the digested tissue are multicellular three-dimensional (3D) constructs that better recapitulate in vivo conditions than cell ...

Direct Bioprinting of 3D Multicellular Breast Spheroids onto Endothelial Networks

Bioprinting is emerging as a promising tool to fabricate 3D human cancer models that better recapitulate critical hallmarks of in vivo tissue architecture. In current layer-by-layer extrusion bioprinting, individual cells are extruded in a bioink together with complex spatial and temporal cues to promote hierarchical tissue self-assembly. However, this biofabrication technique relies on complex interactions among cells, bioinks and biochemical and biophysical cues. Thus, self-assembly may take days or even weeks, may require specific bioinks, and may not always occur when there is more than one cell type involved. We therefore developed a technique to directly bioprint pre-formed 3D breast epithelial spheroids in a variety of bioinks. Bioprinted pre-formed 3D breast epithelial spheroids sustained their viability and polarized architecture after printing. We additionally printed the 3D spheroids onto vascular endothelial cell networks to create a co-culture model. Thus, the novel bioprinting technique rapidly creates a more physiologically relevant 3D human breast model at lower cost and with higher flexibility than traditional bioprinting techniques. This versatile bioprinting technique can be extrapolated to create 3D models of other tissues in additional bioinks.

The goal of this protocol is to directly bioprint breast epithelial cells as multicellular spheroids onto pre-formed endothelial networks to rapidly create 3D breast-endothelial co-culture models which can be used for drug screening studies.

Bioimpressão direta de esferoides de mama multicelular 3D em redes endoteliais

Bioprinting is emerging as a promising tool to fabricate 3D human cancer models that better recapitulate critical hallmarks of in vivo tissue ...

In Vitro Apical-Out Enteroid Model of Necrotizing Enterocolitis

Necrotizing enterocolitis (NEC) is a devastating disease affecting preterm infants, characterized by intestinal inflammation and necrosis. Enteroids have recently emerged as a promising system to model gastrointestinal pathologies. However, currently utilized methods for enteroid manipulation either lack access to the apical surface of the epithelium (three-dimensional [3D]) or are time-consuming and resource-intensive (two-dimensional [2D] monolayers). These methods often require additional steps, such as microinjection, for the model to become physiologically translatable. Here, we describe a physiologically relevant and inexpensive protocol for studying NEC in vitro by reversing enteroid polarity, resulting in the apical surface facing outward (apical-out). An immunofluorescent staining protocol to examine enteroid barrier integrity and junctional protein expression following exposure to tumor necrosis factor-alpha (TNF-&#945;) or lipopolysaccharide (LPS) under normoxic or hypoxic conditions is also provided. The viability of 3D apical-out enteroids exposed to normoxic or hypoxic LPS or TNF-&#945; for 24 h is also evaluated. Enteroids exposed to either LPS or TNF-&#945;, in combination with hypoxia, exhibited disruption of epithelial architecture, a loss of adherens junction protein expression, and a reduction in cell viability. This protocol describes a new apical-out NEC-in-a-dish model which presents a physiologically relevant and cost-effective platform to identify potential epithelial targets for NEC therapies and study the preterm intestinal response to therapeutics.

In Vitro Apical-Out Enteroid Model of Necrotizing Enterocolitis

This protocol describes an apical-out necrotizing enterocolitis (NEC)-in-a-dish model utilizing small intestinal enteroids with reversed polarity, allowing access to the apical surface. We provide an immunofluorescent staining protocol to detect NEC-related epithelial disruption and a method to determine the viability of apical-out enteroids subjected to the NEC-in-a-dish protocol.

In vitro Modelo enteróide apical-out de enterocolite necrotizante

Necrotizing enterocolitis (NEC) is a devastating disease affecting preterm infants, characterized by intestinal inflammation and necrosis. Enteroids have ...

Quantification of Proliferative and Dead Cells in Enteroids

The intestinal epithelium acts as a barrier that prevents luminal contents, such as pathogenic microbiota and toxins, from entering the rest of the body. Epithelial barrier function requires the integrity of intestinal epithelial cells. While epithelial cell proliferation maintains a continuous layer of cells that forms a barrier, epithelial damage leads to barrier dysfunction. As a result, luminal contents can across the intestinal barrier via an unrestricted pathway. Dysfunction of intestinal barrier has been associated with many intestinal diseases, such as inflammatory bowel disease. Isolated mouse intestinal crypts can be cultured and maintained as crypt-villus-like structures, which are termed intestinal organoids or &ldquo;enteroids&rdquo;. Enteroids are ideal to study the proliferation and cell death of intestinal epithelial cells in vitro. In this protocol, we describe a simple method to quantify the number of proliferative and dead cells in cultured enteroids. 5-ethynyl-2&rsquo;-deoxyuridine (EdU) and propidium iodide are used to label proliferating and dead cells in enteroids, and the proportion of proliferating and dead cells are then analyzed by flow cytometry. This is a useful tool to test the effects of drug treatment on intestinal epithelial cell proliferation and cell survival.

The presented protocol uses flow cytometry to quantify the number of proliferating and dead cells in cultured mouse enteroids. This method is helpful to evaluate the effects of drug treatment on organoid proliferation and survival.

Quantificação de Células Proliferativas e Mortas em Enteróides

The intestinal epithelium acts as a barrier that prevents luminal contents, such as pathogenic microbiota and toxins, from entering the rest of the body. ...