Name: breast milk enhances growth of enteroids: an ex vivo model of cell proliferation
Uploaded: 2018-02-15T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 2 s
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MG은 K08DK101608와 R03DK111473는 건강의 국가 학회 3 월의 천 재단 보조금 No. 5-FY17-79, 어린이 디스커버리 연구소의 워싱턴 대학, 세인트 루이스 아동 병원과의 학과에서 교부 금에 의해 지원 됩니다. 워싱턴 대학 대학원 의학의 세인트 루이스에서 소아과. CJL R01DK104946에 의해 지원 됩니다 (PI: 실버), 어린이 디스커버리 연구소의 워싱턴 대학 및 St. 루이 아동 병원.

이 연구에서 모든 동물 절차는 세인트 루이스 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (20160187 프로토콜) 또는 피츠버그 대학 제도 동물 보호와 사용 위원회 (14103918 프로토콜)에 워싱턴 대학에 의해 승인 되었다. 24 주 미만의 임신에서 인간의 태아 소장 기관 검토 위원회 승인 (PRO14100537 프로토콜)의 대학에서 후 피츠버그 대학 해 부 조직 조달 지침에 따라 얻은 피츠버그는 정직한 브로커 시스템을 통해 건강 과학 조직 은행. 취소 확인 된 인간 유 방 우유 나 저온 살 균된 기증자 모유 피츠버그 기관 검토 위원회의 대학에서 동의의 포기와 함께 얻은 것입니다.
1. 토 굴 고립과 신생아 쥐 또는 조 인간의 소장에서 Enteroids의 설립
<ol><li>미디어 준비 참고: 미디어 준비 되어야 한다 후드에 하루 토 굴 격리 전에.<ol>
<li>1.11 L 문화 미디어를 준비 합니다. 포도 당 4.5 g/L와 L-글루타민 Dulbecco의 수정이 글의 중간 (DMEM) 1 L로 시작 하 고 110 mL 태아 둔감 한 혈 청 (FBS) (최종 농도 10%), 11 mL 페니실린-스 (최종 농도 1%), 그리고 1.1 mL 살 균 인슐린 (최종 추가 농도 0.1%)입니다.</li>
		<li>500 mL PBS 항생제 혼합을 준비 합니다. 500 mL 1 Dulbecco의 인산 염 버퍼 식 염 수 (DPBS) x 10% 시작 FBS 5 mL Gentamicin (최종 농도 1%), 1 mL 암포 B (최종 농도 0.2%), 추가 5 ml 페니실린-스 (최종 농도 1%).</li>
		<li>30 mL 셀 중단 미디어 # 1을 준비 합니다. 먼저 30 mL 문화 미디어 준비. 600 µ L 0.5 M Ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA) 추가 (최종 농도 10 m m), 300 µ L Gentamicin (최종 농도 1%), 및 60 µ L 암포 B (최종 농도 0.2%).</li>
		<li>30 mL 셀 중단 미디어 # 2를 준비 합니다. 먼저 30 mL 문화 미디어 준비. 300 µ L 0.5 M EDTA를 추가 (최종 농도 5 m m), 300 µ L Gentamicin (최종 농도 1%), 및 60 µ L 암포 B (최종 농도 0.2%).</li>
		<li>성장 인자 없이 50 mL 토 굴 문화 미디어를 준비 합니다. 33.4 mL 1 측정 x 고급 DMEM/F-12 10 mL FBS (최종 농도 20%)를 추가 하 고.<ol>
<li>500 µ L 추가 페니실린-스 (최종 농도 1%), 500 µ L L-글루타민 (최종 농도 1%), 500 µ L Gentamicin (최종 농도 1%), 100 µ L 암포 B (최종 농도 0.2%), 2.5 µ L 1 M N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane 술 폰 산 (HEPES) (최종 농도 0.05 m m), 500 µ L 100 mM N Acetylcysteine (최종 농도 1 m m), 500 µ L 100 N-2 보충, 비타민 A, 마이너스 혈 청 무료 보충 (예를 들어, B-27) x 1 mL 50 및 500 µ 1 m 100 m L x Y-27632 x.</li>
		</ol>
</li>
		<li>성장 요인 1 mL 토 굴 문화 미디어를 준비 합니다. 첫째 1 mL의 토 굴 문화 미디어 없이 성장 요소를 준비 합니다. 2.5 µ L 40 µ g/mL Wnt3a 추가 (최종 농도가 100 ng/mL), 1 µ L 100 µ g/mL 머리 (최종 농도가 100 ng/mL), 2 µ L 250 µ g/mL R-Spondin (최종 농도 500 ng/mL), 및 0.5 µ L 100 µ g/mL EGF (최종 농도 50 ng/mL).</li>
	</ol></li>
	<li>토 굴 절연
	<ol>
<li>장소 solubilized 지하실 막 추출 물 ( 재료의 표참조) 시작 하기 전에 해 동 얼음에. 참고: 얼음에 계속 지하실 멤브레인 유해 것입니다.</li>
		<li>쥐 나이의 14 일 보다 큰에 대 한 기관 동물 관리 및 사용 위원회 프로토콜, 준수와 안락사의 두 가지 방법으로 마우스를 안락사 되 고 죽음을 보장 하기 위해 실제 절차. 참고: 마우스에 대 한 나이의 14 일 아래 잘린은가 위를 사용 하 여 표준 절차.</li>
		<li>가 위와 집게를 이용, 피부 및 복 막, 복 부의 전체 길이 통해 복 부의 정중 선 아래로 수직 절 개 만들. 가 위 맹 하 위장에서 소장을 소비 세 고 집게로는 mesentery를 제거 합니다. 참고: 2 주 된 남성과 여성의 C57BL/6J 마우스 새끼, 각 무게 5.5-7 g, 토 굴 격리 사용 되었다. 토 굴 격리에 대 한 어떤 나이 또는 크기 마우스를 사용할 수 있습니다.</li>
		<li>갓 수확된 소장 토 굴 격리를 준비 하려면 소장 똑바로 놓고 잘라가 위를 사용 하 여 그것의 전체 길이 따라 경도 소장. 참고: 마우스 및 인간의 장 수 준비 마찬가지로.</li>
		<li>부드럽게 앞뒤로 집게를 사용 하 여 PBS 항생제 혼합 가득 페 트리 접시에 소장을 떨고 하 여 소장에서의 하의 깨끗 한 자</li>
		<li>50 mL 원뿔 튜브에 세포 장애 미디어 # 1의 30 mL를 추가 합니다. 소장을 튜브에 직접 0.5 c m 길이 조각을 잘라. 튜브는 얼음 양동이에 설정 하 고 부드럽게 15 분에 대 한 최저 속도로 통에 선동.</li>
		<li>조직 뿌리에 있는 동안, 24 또는 48 잘 플레이트는 enteroids RNA, DNA, 또는 단백질 격리에 사용 되는 경우 지하실을 성장 하는 것을 얻을. 사용 8 잘 챔버 슬라이드 전체에 사용 되는 enteroids 있다면 지하실을 성장 하는 confocal 영상을 탑재 합니다.</li>
		<li>후드, 24 또는 48 잘 플레이트의 각의 밑에 지하실 막의 15 µ L를 추가 합니다. 챔버 슬라이드를 사용 하 여 각 챔버의 바닥에 지하실 막의 9 µ L를 추가 합니다. 참고: 필요한 경우 접시의 크기에 따라 지하실 막의 볼륨을 조정 합니다.</li>
		<li>우물의 바닥에 얇은 층을 형성 하는 지하실 멤브레인을 피 펫 팁 지하실 막을 빠르게 확산. 유해를 지하실 멤브레인 수 있도록 30 분 동안 인큐베이터에서 37 ° C에서 접시를 놓습니다. 참고:는 지하실 지하실 멤브레인은 얇은 층 또는 지하실 멤브레인 기포를 포함 하는 경우 첨부 하지 않습니다.</li>
		<li>후 통에 15 분, 100 µ m 스 트레이너를 통해 조직을 필터링 합니다. 삭제를 통해 흐름.</li>
		<li>새로운 50 mL 원뿔 튜브에 30 mL 셀 중단 미디어 # 2를 추가 합니다. 스 트레이너에서 조직을 제거 하 고 관에 추가 합니다.</li>
		<li>튜브는 얼음 양동이에 설정 하 고 부드럽게 15 분에 대 한 최저 속도로 통에 선동.</li>
		<li>통에 15 분 후 조직 100 µ m 스 트레이너를 통해 필터링. 수율은 나중 단계에서 낮은 경우에이 단계에서를 통해 흐름을 유지. 참고: 튜브를 통해 모든 흐름은 얼음에 유지 되어야 한다.</li>
		<li>새로운 50 mL 원뿔 튜브에 15 mL DMEM 포도 당 4.5 g/L와 L-글루타민을 추가 합니다. 스 트레이너에서 조직을 제거 하 고 관에 추가 합니다. 적극적으로 100 µ m 스 트레이너를 통해 10 s. 필터에 대 한 손으로 튜브를 흔들을 통해 수집 합니다. 통해 아무 입자 포함 될 때까지 반복 합니다.</li>
		<li>후드, 70 µ m 멤브레인을 사용 하 여 마우스 조직 또는 인간의 조직에 대 한 100 µ m 멤브레인에 대 한 새로운 50 mL 원뿔 튜브에 이전 단계에서 통해 흐름 필터링. 참고: 대기, 여분의 멤브레인 있고 멤브레인 파편으로 방해할 것으로 천천히 붓는 다.</li>
		<li>4 ° C와 후드에 얼음 양동이에 직접 장소에서 8 분 200 x g에서 튜브 원심 펠 릿을 방해 하지 않고 피 펫으로는 상쾌한을 제거 합니다. 총 원하는 금액의 토 굴 문화 미디어 없이 성장 인자와 펠 릿 resuspend 참고: 농축된 지하실은 펠 릿의 '모래' 레이어. 각 잘 250 µ L의 토 굴 문화 미디어 없이 성장 인자를 요구 한다.</li>
	</ol></li>
	<li>Enteroids의 설립
	<ol>
<li>지하실 멤브레인에 직접 토 굴 미디어 혼합 플레이트</li>
		<li>격리 프로세스 성공적이 되도록 현미경으로 지하실을 확인 합니다. 참고: 셀과 셀의 공을 원하는 됩니다. 약 100 개인 지하실 잘 당 도금 된다.</li>
		<li>지하실 지하실 멤브레인에 있도록 3 h 37 ° C에서 접시를 품 어. 참고:이 부 화와 토 굴 문화 미디어 없이 성장 요인입니다.</li>
		<li>천천히 제거 미디어 초과 지하실 P-200 피 펫을 사용 하 여 연결 하지 못했습니다. 참고: 연결 된 지하실 제거 될 수 있다로 지하실 막을 방해 하지 마십시오.</li>
		<li>천천히 각 우물에 250 µ L의 토 굴 문화 미디어와 성장 인자를 추가 합니다. 참고: 24-48-잘 접시, 또는 챔버 슬라이드, 250 µ L의 토 굴 문화 미디어와 함께 성장 요인 충분 하다.</li>
		<li>대체 미디어 2 일 마다와 신선한 토 굴 문화 미디어와 함께 성장 요인 5 일전 최적의 부착과 성장을 허용 하기 위해 치료에 대 한.</li>
	</ol></li>
</ol>2. 마우스 유 방 우유 컬렉션
<ol><li>그 새끼 짤 전에 6 h에서 산 후 7-12 일 C57BL/6J 양모 댐을 구분 합니다.</li>
	<li>Anesthetize 코 콘 통해 isoflurane와 양모 댐 하 고 0.15 IU/kg 몸 무게에서 oxytocin의 피하 주사를 관리. 절차를 짜기 전에 3 분을 기다립니다.</li>
	<li>절차를 짜기 전에 70% 에탄올과 꼭지를 깨끗 하 고 건조 하 게.</li>
	<li>실리콘 튜브 마우스 꼭지 5 mL 컬렉션 튜브에 맞게 크기와 전기 인간 유 방 펌프를 사용 하 여 한 번에 한 꼭지에서 우유를 추출 합니다. 참고: 최적의 유 방 펌프는 두 개의 설정 속도, 하나 흡입 있습니다. 그것은 각각의 낮은 설정으로 시작 하 고 둘 다 우유 추출 될 때까지 천천히 증가입니다. 이상적으로, 총 수익률 됩니다 ~ 500 µ L-마우스 모유 수 댐 당 1 mL.</li>
	<li>즉시 aliquot 모유와-80 ° c.에 게 참고: 동결/동결 해제 방지 주기.</li>
	<li>37 ° c.에 24 h에 대 한 성장 인자와 토 굴 문화 미디어의 mL 당 마우스 유 방 우유의 50 µ L/mL와 5 일에 enteroids를 취급</li>
</ol>3. 전체 Enteroids의 Staining 탑재
<ol><li>
시 약의 준비
	<ol>
<li>8 우물 당 16 mL 1 x PBS를 준비 합니다.</li>
		<li>8 우물 당 1 x PBS에 2 mL 4 %paraformaldehyde (PFA)를 준비 합니다.</li>
		<li>준비 2 mL 0.1 %8 우물 당 1 x PBS에 트라이 톤 X-100.</li>
		<li>준비 24 mL PBS 트윈 (PBST은 0.1% Tween 20 1 x PBS) 8 웰 스 당.</li>
		<li>준비 2 mL 0.1%에 10% 정상 당나귀 세럼 (NDS) PBST (10 %NDS / PBST) 8 웰 스 당.</li>
		<li>준비 4 mL 1% 0.1%에서 NDS PBST (1 %NDS / PBST) 8 웰 스 당.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
주 1 얼룩
	<ol>
<li>치료에서 aspirate와 enteroids PBS로 세척. 추가 250 µ L 4 %PFA 잘 당. 1-2 h 4 ° c.에 대 한 회전에 4% 제거 PFA와 피 펫.</li>
		<li>250 µ L/잘 1과 4 번 세척 PBS x. 실 온 (RT)에서 10 분 동안 회전에 놓습니다. 참고: 필요한 경우 4 ° C에서 1-2 일에 대 한 접시를 저장 가능 하다.</li>
		<li>추가 250 µ L/잘 0.1% 트라이 톤 X-100. 1 h 실시간 제거에 대 한 품 어 0.1% 피 펫과 트라이 톤 X-100.</li>
		<li>250 µ L/잘 1과 4 번 세척 PBS x. 실시간에서 15 분 동안 회전에</li>
		<li>250 µ L/잘 10% 추가 NDS/PBST. 실시간 제거에서 45 분 동안 품 어 10 %NDS / PBST 피 펫과.</li>
		<li>250 µ L/잘 1 차적인 항 체, 희석된 1/250에서 1 %NDS / PBST을 추가 하 고 하룻밤 4 ° c.에 품 어 참고: 최적의 항 체 희석 제조업체에 따라 다릅니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
얼룩이 Day 2
	<ol>
<li>4-5 h 250 µ L/잘 PBST에 대 한 5 번 이상 씻는 다. 각 씻어 사이의 4 ° C에서 회전자에 놓습니다.</li>
		<li>250 µ L/잘 이차 항 체, 희석된 1/1000에서 1 %NDS / PBST을 추가 합니다. 호 일에 접시를 포장 하 고 하룻밤 4 ° c.에 품 어</li>
	</ol>
</li>
	<li>
3 일을 착 색
	<ol>
<li>250 µ L/음 핵 얼룩 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) 15 분 추가 합니다. 참고: 어둠 속에서 접시를 유지.</li>
		<li>250 µ L/잘 PBST 6 번 씻어. 각 씻어 사이의 4 ° C에서 10 분 동안 회전에 놓습니다.</li>
		<li>챔버에 마운트 coverslip 설치 미디어와 슬라이드.</li>
		<li>객관적인 confocal 현미경 40x와 이미지와 래스터 그래픽 편집기에서 동일 하 게 렌더링 ( 재료의 표참조).</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
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저자는 아무것도 공개 및 충돌의 관심 있다.

장 상피 직감 장벽 무결성을 유지 하는 병원 체에 대 한 호스트 방어를 제공 하 고 여러 질병의 병 인에 위반 될 수 있는 많은 세포질 하위 구성 됩니다. 동물 모델 질병의 몇 가지 측면을 정리 수 있습니다, 하는 동안 생쥐와 인간의 작은 창 자에서 파생 된 enteroids의 비보 전 모델 다양 한 치료의 효과 테스트 플랫폼을 제공 합니다. Enteroid 모델의 중요성 문화 순진한 또는 병에 걸린 동물과 기존 방법으로 사용할 수 없습니다 인간에서 모든 상피 세포 하위로 장 줄기 세포를 분화 하는 연구자를 수 있습니다. 이 모델 시스템 마우스 등 엔테로바이러스25 또는 노로바이러스26 다른 사람 사이 쉽게 변환 되지 않을 수 있습니다 인간 병원 체와 감염에 대 한 사용할 수 있습니다. Enteroid 모델에는 몇 가지 이점이 사용; 그러나, 배려는 미디어와 enteroids의 생존에 필요한 특정 세 성장 요인에 사용 되는 시 약에 일관성을 보장가지고 한다.
Enteroid 모델 내에서 몇 가지 단계가 중요 enteroids 생산에서 성공을 보장 하는. 찬 허 혈 성 시간을 최소화, 조직 적당 하 게 처리 한다. Enteroids 조직 조직 4 ° c.에 로스웰 파크 기념 연구소 (RPMI) 매체에 배치 됩니다 경우 수확 후 24 h까지 생성 될 수 있습니다. 이 필요한 경우 운송 또는 운송의 옵션을 촉진 수 있습니다. Enteroids의 설립, 지하실 멤브레인 첨부 하 고 성장 지하실에 대 한 각의 밑에 얇은, 평면 레이어 수 있어야 합니다. 지하실 막 플랫 되지 않습니다 또는 거품 존재는 지하실 되지 않을 수 있습니다 준수 하 고 것입니다 미디어 변경 될 때 제거 됩니다. enteroids 설립 후 그들은 수 있습니다 7 일 마다 passaged 또는 장기 저장을 위한 액체 질소 냉동. 천천히 그리고 각 잘 방지는 enteroids를 방해 하는 것의 가장자리를 제거 및 추가 토 굴 문화 미디어의 성장 요인 및 각 치료의 관리 수행 되어야 합니다. enteroids의 그들 분리 되 고 씻 겨 미디어 변경 될 때 발생할 수 있습니다. 최상의 결과 얻으려면 해야 합니다 주의 지하실 막과 연결 된 enteroids의 무결성을 유지 하.
현재 연구에서 우리 신생아 쥐에서 파생 된 enteroids 및 조기 유아 성장 하 고 증식 유 방 우유의 다른 종류의 존재를 보고 합니다. 이러한 연구는 조 소장에 유 방 우유의 효과 대 한 우리의 이해를 사전. 우리 enteroid 문화 인간과 쥐에서 실험실에서 설정 하는 방법에 대 한 자세한 방법의 제공 합니다. 또한, 수정된 전기 인간 유 방 펌프를 사용 하 여 젖이 마우스에서 모유를 수집 하는 효율적인 방법을 시연 합니다. 우리 그 마우스 보여 인간, 및 저온 살 균 기증자 모유 강화 성장과 쥐와 인간 enteroids의 확산. 또한, 우리는 감소 enteroid 확산 TLR4 ligand LPS, 마우스, 인간, 또는 기증자 모유는 enteroids를 투여 하는 경우 복원 된 존재를 보여줍니다. 미래의 응용 프로그램 특정 약물 특정 유아에 미치는 영향을 볼 수 장 절제술 후 유아에서 얻은 enteroids에 높은 처리량 마약 화면 맞춤된 정밀 의학을 포함할 수 있습니다. 우리 다른 연구소 소장, NEC, 등의 소아 질병의 많은 다른 영역에 이러한 기술을 활용에 잠재적인 성공 찾을 것입니다 희망 함께 찍은, 임상 시급 새로운 치료 전략을 개발 하는.

Necrotizing enterocolitis (NEC)에 영향을 미치는 거의 1/10 유아 29 주 태동1,2,3전에 태어난 조산에 위장 질환에서 죽음의 주요 원인입니다. 생존은 단지 10-304,5가장 심각한 형태를 NEC 진행과 유아의 반은. 미국에는 약된 2-3 십억 달러/년 소비 하는 NEC6,7, 유아 치료 아직 생존 율도 치료는 지난 30 년 동안 변경 되었습니다. 그러나 NEC의 병 장 부상으로 특징은 점 막 치유8,,910,11,, 신호 경로 악화를 선도 염증 반응 및 메커니즘 염증을 불완전 하 게 이해 남아 있습니다.
인간의 모유의 조산에 대 한 NEC에 대 한 유일한 보호 전략 발견 되었습니다. 우리는 이전 유 방 우유는 표 피 성장 인자 수용 체 (EGFR) 신호 통로11를 통해 장 상피에 타고 난 면역 수용 체 통행세 같이 수용 체 4 (TLR4)의 억제를 통해 NEC 개발에 대 한 보호 나타났습니다. 실험 NEC 수식 모유의 보충 감쇠 NEC enterocyte apoptosis의 억제 및 복원 enterocyte 확산 했다 표 피 성장에 의존 하는 방식으로 여로 염증 반응 인자 (EGF) 고 EGFR11. 또 다른 연구에서는 그것은 표시 했다 질 산, 모유의 다른 구성 요소, 분유, 질산염 부족 하 고 NEC에의 증가 주파수에 기여할 수에 비해 장 관류를 변조 하 여 자연 보호에 기여 수식 먹이 유아12,13. 선관위에 대 한 보호에서 포함 되기 위하여 보였다 다른 화합물 모유에 존재 인간의 우유 oligosaccharides, 등 L-아르기닌, 글루타민, lactoferrin14,,1516, 17,,1819. 유 방 우유의 이러한 유익한 요소 NEC의 예방에 있는 그것의 사용의 필요성을 공개 하지만 또한 신호 경로, 및 세포 효과 모유는 선관위에 대 한 보호를 중재 하는 방법에 관련 된 메커니즘의 중요성을 강조 .
진학 하기 위해서는, NEC의 마우스 모델에서 모유의 보호 속성 우리 소설, 사용 하기 쉬운 기술을 개발 모유는 전기 인간 유 방 펌프11,12 사용 하 여 마 취 댐에서 추출 수 있는 마우스에 의해 . 마우스 모유 인수의이 전략이 아니다 유리한, 인간 유 방 펌프 쉽게 사용할 수 있으며 유 방 우유의 조달에 효율적인 뿐만 아니라 종의 유 방 우유 분석을 위해이 방법을 수 있기 때문에 때문에. 결과적으로, 우리 그 표현된 인간의 모유 마우스 유 방 우유의 효과 비교할 수 있습니다 뿐만 아니라 종의 모델에서 우유 은행에서 인간 기증자 우유를 저온 살 균. 이 기술은 NEC 예방으로 그들의 공헌에 관하여 유 방 우유 구성의 연구에 대 한 수 있습니다. 그러나 다른 조사 유 방 우유 추출 방법 개발,, 이러한 기술은 수동는 일반적으로 하나 이상의 연구소 회원20,,2122필요. 여기는 마우스에서 우유를 수집 하는 인간의 전기 유 방 펌프를 수정 하 여 활용할 수 있는 쉬운 기술 제공 됩니다. 이 기술은 또한 다른 종에 적용할 수 있습니다.
가 적절 하 게 신호 경로 NEC와 관련된, 모델 시스템의 질병 과정에 영향을 받을 것으로 알려져 다른 세포 유형 모두 평가 필요 합니다. 여기, 우리가 같은 모델 시스템-enteroids-및 마우스 및 인간의 소장에서 그들의 설립 하나 설명합니다. 인간의 장 enteroids (HIEs)는 혁신, 유전으로 다양 한 비보 전 인간의 모델 위장에서 자리를 차지할 pathophysiological 프로세스의 연구에 도움을 제안 하기 때문에 특히 중요 한 약속를 제공합니다 23. Enteroids 장기 배양 될 발견 되었습니다 나중 사용23, 얼 수 있다 그리고 누구의 문화는 유도할 수 있는 만능 줄기 세포에서 개발 하 고, 인간의 장 Organoids (HIOs), 달리 enteroids 줄기 세포에서 생성 되 고립된 장 지하실24내. Enteroids 유지 일 수 있다25, 신속 하 게 감염 하 고 이후 장 지하실 HIOs23보다 더 분화 된다 쉽게 설정할 수 있습니다. 따라서, HIEs 인간의 위장 상피23의 지역별 구성 및 기능적 속성을 전시 하기 위하여 개발 될 수 있기 때문에 기존 기술을 통해 많은 이점을 제공 합니다. Enteroids 사용 하 여 지역별 제한 및 사용의 용이성에 대 한 준수와 내장의 인간의 모델 필요 때 매우 효과적인 선택입니다. 여기 분리 하 고 기본 줄기 세포 유래 작은 창 자 enteroids 생쥐와 인간의 조산에서 유지 하는 기술을 보여 줍니다.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco&#039;s Modified Eagle&#039;s Medium (DMEM) with 4.5 g/L Glucose and L-Glutamine</td><td>Lonza</td><td>12-604F</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Gibco</td><td>26140-079</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Humulin N (Insulin)</td><td>Eli Lilly And Company</td><td>0002-8315</td><td></td></tr><tr><td>1x Dulbecco&#039;s Phosphate-Buffered Saline (DPBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicin</td><td>Gibco</td><td>15750-060</td><td></td></tr><tr><td>Amphotericin B</td><td>Gibco</td><td>15290-026</td><td></td></tr><tr><td>0.5 M Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), pH 8.0</td><td>Invitrogen</td><td>15575-020</td><td></td></tr><tr><td>1x Advanced DMEM/F-12</td><td>Invitrogen</td><td>12634-028</td><td></td></tr><tr><td>200 mM L-Glutamine</td><td>Gibco</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>1 M N-2-Hydroxyethylpiperazine-N-2-Ethane Sulfonic Acid (HEPES)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3537</td><td></td></tr><tr><td>N-Acetylcysteine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9165</td><td></td></tr><tr><td>100x N-2 Supplement</td><td>Gibco</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>50x B-27 Supplement Minus Vitamin A</td><td>Gibco</td><td>08-0085SA</td><td></td></tr><tr><td>100x ROCK Inhibitor Y-27632, Dihydrochloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y0503</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant Mouse Wnt3a Protein</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>1324-WN</td><td></td></tr><tr><td>Murine Noggin</td><td>PeproTech</td><td>250-38</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant Mouse R-Spondin 1</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>3474-RS</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant Murine Epidermal Growth Factor (EGF)</td><td>PeproTech</td><td>315-09</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel Growth Factor Reduced Basement Membrane Matrix</td><td>Corning</td><td>356231</td><td></td></tr><tr><td>35 x 10 mm Cell Culture Petri Dish</td><td>Eppendorf</td><td>0030700112</td><td></td></tr><tr><td>24-Well Cell Culture Plate</td><td>Eppendorf</td><td>0030722116</td><td></td></tr><tr><td>48-Well Cell Culture Plate</td><td>Eppendorf</td><td>0030723112</td><td></td></tr><tr><td>8-Well Nunc Lab-Tek II Chamber Slide System</td><td>Thermo Scientific</td><td>154534</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Conical Tube</td><td>Corning</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>100 &amp;mu;M Sterile Cell Strainer</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-363-549</td><td></td></tr><tr><td>70 &amp;mu;M Sterile Cell Strainer</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-363-548</td><td></td></tr><tr><td>1x Phosphate-Buffered Saline (PBS), pH 7.2</td><td>Invitrogen</td><td>20012-027</td><td></td></tr><tr><td>16% Paraformaldehyde (PFA)</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>Normal Donkey Serum (NDS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9663</td><td></td></tr><tr><td>4&#039;,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride (DAPI)</td><td>Invitrogen</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>Microscope Cover Glass</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544-D</td><td></td></tr><tr><td>Confocal Microscope Leica TCS SP8 X</td><td>Leica Microsystems</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Photoshop CS6</td><td>Adobe Systems</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>18 G 1.5 Inch Needle</td><td>Becton Dickinson</td><td>305196</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>792632</td><td></td></tr><tr><td>Oxytocin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>O3251</td><td></td></tr><tr><td>Human Double Electric Breast Pump</td><td>Lansinoh</td><td>044677530163</td><td></td></tr><tr><td>5 mL Round Bottom Test Tube</td><td>Corning</td><td>352058</td><td></td></tr><tr><td>Rubber Stoppers</td><td>Frey Scientific</td><td>560761</td><td></td></tr><tr><td>Ki67 Antibody</td><td>Abcam</td><td>AB15580</td><td></td></tr><tr><td>Human Mki67 primer F: 5&#039;-GACCTCAAACTGGCTCCTAATC-3&#039; R: 5&#039;-GCTGCCAGATAGAGTCAGAAAG-3&#039;</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A</td><td></td></tr></tbody></table>

breast milk enhances growth of enteroids: an ex vivo model of cell proliferation

인간의 작은 창 자 enteroids는 지하실에서 파생 되 고 줄기 세포 틈새 시장에서 성장 하는 때 모든 상피 세포 유형을 포함. 인간의 enteroid ex vivo 문화 시스템을 설정 하는 기능 모델 장 이상 하 고 특정 세포 응답 관련된 공부에 중요 하다. 최근 몇 년 동안, 쥐와 인간 enteroids 되 고 교양, passaged, 그리고 은행 떨어져 여러 실험실에서 나중에 사용에 대 한 전 세계에 걸쳐. 이 enteroid 플랫폼은 다양 한 치료와 약물의 효과 및 어떤 효과 소장에 다른 세포 유형에가 해지는 테스트를 사용할 수 있습니다. 여기, 신생아 쥐에서 파생 된 기본 줄기 세포 유래 작은 창 자 enteroids를 설정 하기 위한 프로토콜 이며 조 인간의 내장 제공 됩니다. 또한,이 enteroid 문화 시스템 종의 유 방 우유의 효과 테스트에 이용 되었다. 마우스 모유 수정된 인간 유 방 펌프를 사용 하 여 효율적으로 얻을 수 있다 고 표현된 마우스 우유 추가 연구 실험을 위해 사용할 수 있습니다. 우리 이제 표현된 마우스, 인간의 효과 입증 하 고 성장 및 enteroids의 확산에 기증자 모유 신생아 쥐 또는 조 인간의 작은 창 자에서 파생 된.

우리는 먼저 인간의 모유를 표현 하는 여부를 조사 하고자 또는 저온 살 균된 기증자 모유 작은 장 enteroids에 영향을 했다. 실제로, 인간 유 방 우유와 모유 기증자 신생아 마우스 (그림 1A)와 조 인간의 파생된 enteroids (그림 1B)의 성장을 증가 했다.
인간의 모유 증가 작은 창 자 enteroids의 성장, 이후 우리는 다음 모유 했다 조 인간 enteroids의 확산에 영향을 조사. 우리 인간의 모유 제어 (B, Ki67, 붉은 얼룩-그림 2A)에 비해 조 숙한 인간 enteroids의 확산을 증가 입증. 중요 한 것은, 인간 기증자 모유는 또한 enteroid 확산을 제어, 하지만 인간의 유방암 저온 살 균 되지 않은 우유 (그림 2B-C) 보다 약간 낮은 정도에 비해 증가 했다. 우리 다음 조 인간 enteroids에 Ki67 mRNA 식을 평가 하 고 Ki67 모유 또는 기증자 모유 컨트롤 (그림 2D)을 기준으로 치료 하는 enteroids에서 증가 했다 발견.
우리 다음 이러한 효과 모유에 관하여 종의 있다면 보고 싶 었 어 요. 우리 개발 참조11,12로 수정된 상용 인간 유 방 펌프를 사용 하 여 젖을 쥐에서 모유를 수집 하는 방법. 묘사는 마 취 수 댐 우유 컬렉션을 받고 사용 하는이 장치 (그림 3). 실험의 다음 시리즈 마우스 enteroids에서 수행 하 고 마우스, 인간, 또는 기증자 모유에서 표현된 모유의 확산 효과 평가 했습니다. 그림 4에서 같이, 마우스, 인간, 그리고 저온 살 균된 기증자 유 방 우유 컨트롤 (그림 4A-D)에 비해 마우스 enteroids에 증가 확산. 마우스 enteroids에 확산 존재 TLR4 ligand, lipopolysaccharide (LPS), 제어 (그림 4A, E)에 비해 감소 했다. 중요 한 것은, 마우스, 인간, 또는 기증자 유 방 우유 모든 복원 enteroid 확산 LPS 같이 증가 Ki67 얼룩에 의해 존재 LPS 혼자 (그림 4 층-H)에 비해.
우리의 실험에서 우리는 작은 창 자 enteroids 신생아 쥐에서 파생 된 조 인간의 태아 소장 문화에서 유지 될 수 표시. 우리는 더 다양 한 실험을 위해 사용할 수 있는 마우스에서 모유를 추출 하는 효율적인 방법을 제공 하는 새로운 유 방 우유 수집 방법을 제공 합니다. 우리 인간이 나 쥐에서 표현된 모유 증가 크기, 성장, 그리고 확산 쥐와 인간 enteroids에 발견. 또한, 마우스, 인간, 그리고 기증자 모유 LPS 노출 후 enteroid 확산 복원. 이 모유가 생쥐와 인간 소장에 항 염증 효과 발휘 수 있습니다 나왔다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56921/56921fig1.jpg"> 그림 1입니다. 유 방 우유와 기증자 모유 증가 크기와 마우스와 조 인간 enteroids의 성장. 신생아 쥐 (p14) 또는 조 인간의 창 자에서 작은 창 자 enteroids의 photomicrographs 미디어 (제어), 모유, 또는 기증자 모유 (50 µ L/mL) 24 h. 크기 바에 대 한 치료: 1000 µ m. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56921/56921fig1large.jpg" target="_blank">하시기 바랍니다 여기를 클릭이 더 큰 버전을 볼 수 그림.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56921/56921fig2.jpg"> 그림 2입니다. 유 방 우유와 모유 기증자 조 인간 enteroids의 확산 증가. 5 일, 24 h에 대 한 인간의 유 방 우유와 저온 살 균된 기증자 유 대우 고 얼룩이 확산 마커 Ki67 (빨간색)와 DAPI (핵, 블루)에 대 한 교양 조 인간 enteroids의 Confocal 현미경 사진 (A). 크기 바: 50 µ m. (B) qRT-PCR Ki67 식 하우스키핑 유전자 RPLO에 상대적인 인간 enteroids의. n = 그룹 당 5. p < 학생 t 테스트 제어에 비해 0.0001 비교. 데이터는 평균 ± 표준 편차. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56921/56921fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56921/56921fig3.jpg"> 그림 3입니다. 컬렉션에서 수정 된 인간 유 방 펌프를 사용 하 여 마 취 마우스 우유의. 메 마른 인간 유 방 펌프 튜브는 옥 시 토 신 주사를 받은 후 마 취 수 댐의 꼭지에 배치. 마우스 우유 5 mL 컬렉션 튜브로 중간 속도 힘에 인간 유 방 펌프를 사용 하 여 수집 됩니다. 집단 양 출생 후 일 7-12에서 모든 꼭지 에서부터 500 µ L 마우스 당 1 mL에서 추출. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56921/56921fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56921/56921fig4.jpg"> 그림 4입니다. 마우스, 인간, 그리고 저온 살 균된 기증자 모유 강화 마우스 enteroid 확산. (A H) P14 작은 장 마우스 enteroids (제어, A)의 confocal 현미경 마우스 모유 (MBM, B)와 인간의 모유 (BM, C), 또는 인간 기증자 모유 (DBM, D)에서 치료 부재 ( 에서에서 12 h에 대 한 미디어의 50 µ L/mL A-D) 또는 12 h, (E-H)에 대 한 미디어의 25 µ g/mL의 복용량에 lipopolysaccharide (LPS)의 존재와 확산 마커 Ki67 (빨간색)와 DAPI (핵, 블루)에 대 한 스테인드. 크기 바: 50 µ m. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56921/56921fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

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Breast Milk Enhances Growth of Enteroids: An Ex Vivo Model of Cell Proliferation

유 방 우유 Enteroids의 성장을 강화: 세포 증식의 Ex Vivo 모델

이 프로토콜에서는 쥐에서 우유를 수집 하는 효율적인 방법 뿐만 아니라 신생아 마우스 또는 조 인간의 창 자에서 enteroid 문화 시스템을 설정 하는 방법을 설명 합니다.

Human small intestinal enteroids are derived from the crypts and when grown in a stem cell niche contain all of the epithelial cell types. The ability to ...

breast-milk-enhances-growth-enteroids-an-ex-vivo-model-cell

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Medicine

Breast Milk Enhances Growth of Enteroids: An Ex Vivo Model of Cell Proliferation

19.4K 조회수.  Washington University School of Medicine. 이 프로토콜에서는 쥐에서 우유를 수집 하는 효율적인 방법 뿐만 아니라 신생아 마우스 또는 조 인간의 창 자에서 enteroid 문화 시스템을 설정 하는 방법을 설명 합니다.

비디오: Breast Milk Enhances Growth of Enteroids: An Ex Vivo Model of Cell Proliferation

Nutrient Regulation by Continuous Feeding for Large-scale Expansion of Mammalian Cells in Spheroids

In this demonstration, spheroids formed from the &#946;-TC6 insulinoma cell line were cultured as a model of manufacturing a mammalian islet cell product to demonstrate how regulating nutrient levels can improve cell yields. In previous studies, bioreactors facilitated increased culture volumes over static cultures, but no increase in cell yields were observed. Limitations in key nutrients such as glucose, which were consumed between batch feedings, can lead to limitations in cell expansion. Large fluctuations in glucose levels were observed, despite the increase in glucose concentrations in the media. The use of continuous feeding systems eliminated fluctuations in glucose levels, and improved cell growth rates when compared with batch fed static and SSB culture methods. Additional increases in growth rates were observed by adjusting the feed rate based on calculated nutrient consumption, which allowed the maintenance of physiological glucose over three weeks in culture. This method can also be adapted for other cell types.

Nutrient regulation using continuous growth adjusted feeding improves growth rates of mammalian cell spheroids compared to intermittent batch feeding for cultures in stirred suspension bioreactors. This study demonstrates the methods required for establishing simple adjusted rate fed cultures.

회전 타원체의 포유 동물 세포의 대규모 확장을위한 지속적인 공급함으로써 영양 규정

In this demonstration, spheroids formed from the &#946;-TC6 insulinoma cell line were cultured as a model of manufacturing a mammalian islet cell product ...

연구

생체공학

Mammary Epithelial and Endothelial Cell Spheroids as a Potential Functional In vitro Model for Breast Cancer Research

Breast cancer is the leading cause of mortality in women. The growth of breast cancer cells and their subsequent metastasis is a key factor for its progression. Although the mechanisms involved in promoting breast cancer growth have been intensively studied using monocultures of breast cancer cells such as MCF-7 cells, the contribution of other cell types, such as vascular and lymphatic endothelial cells that are intimately involved in tumor growth, has not been investigated in depth. Cell-cell interaction plays a key role in tumor growth and progression. Neoangiogenesis, or the development of vessels, is essential for tumor growth, whereas the lymphatic system serves as a portal for cancer cell migration and subsequent metastasis. Recent studies provide evidence that vascular and lymphatic endothelial cells can significantly influence cancer cell growth. These observations imply a need for developing in vitro models that would more realistically reflect breast cancer growth processes in vivo. Moreover, restrictions in animal research require the development of ex vivo models to elucidate better the mechanisms involved.
This article describes the development of breast cancer spheroids composed of both breast cancer cells (estrogen receptor-positive MCF-7 cells) and vascular and/or lymphatic endothelial cells. The protocol describes a detailed step-by-step approach in creating dual-cell spheroids using two different approaches, hanging drop (gold standard and cheap) and 96-well U-bottom plates (expensive). In-depth instructions are provided for how to delicately pick up the formed spheroids to monitor growth by microscopic sizing and assessing viability using dead and live cell staining. Moreover, procedures to fix the spheroids for sectioning and staining with growth-specific antibodies to differentiate growth patterns in spheroids are delineated. Additionally, details for preparing spheroids with transfected cells and methods to extract RNA for molecular analysis are provided. In conclusion, this article provides in-depth instructions for preparing multi-cell spheroids for breast cancer research.

Mammary Epithelial and Endothelial Cell Spheroids as a Potential Functional In vitro Model for Breast Cancer Research

Crosstalk between mammary epithelial cells and endothelial cells importantly contributes to breast cancer progression, tumor growth, and metastasis. In this study, spheroids have been made from breast cancer cells together with vascular and/or lymphatic endothelial cells and demonstrate their applicability as an in vitro system for breast cancer research.

유방암 연구를 위한 잠재적인 기능적인 시험관 내 모형으로 유방 상피 및 내피 세포 스페로이드

Breast cancer is the leading cause of mortality in women. The growth of breast cancer cells and their subsequent metastasis is a key factor for its ...

암 연구학

Recapitulating Suckling-to-Weaning Transition In Vitro using Fetal Intestinal Organoids

At the end of the suckling period, many mammalian species undergo major changes in the intestinal epithelium that are associated with the capability to digest solid food. This process is termed suckling-to-weaning transition and results in the replacement of neonatal epithelium with adult epithelium which goes hand in hand with metabolic and morphological adjustments. These complex developmental changes are the result of a genetic program that is intrinsic to the intestinal epithelial cells but can, to some extent, be modulated by extrinsic factors. Prolonged culture of mouse primary intestinal epithelial cells from late fetal period, recapitulates suckling-to-weaning transition in vitro. Here, we describe a detailed protocol for mouse fetal intestinal organoid culture best suited to model this process in vitro. We describe several useful assays designed to monitor the change of intestinal functions associated with suckling-to-weaning transition over time. Additionally, we include an example of an extrinsic factor that is capable to affect suckling-to-weaning transition in vivo, as a representation of modulating the timing of suckling-to-weaning transition in vitro. This in vitro approach can be used to study molecular mechanisms of the suckling-to-weaning transition as well as modulators of this process. Importantly, with respect to animal ethics in research, replacing in vivo models by this in vitro model contributes to refinement of animal experiments and possibly to a reduction in the use of animals to study gut maturation processes.

This protocol describes how to mimic suckling-to-weaning transition in vitro using mouse late fetal intestinal organoids cultured for 30 days.

태아 장 오르가노이드를 사용하여 시험관내 빨기-위닝 전환 반복

At the end of the suckling period, many mammalian species undergo major changes in the intestinal epithelium that are associated with the capability to ...

발생학

Generation of Mosaic Mammary Organoids by Differential Trypsinization

Organoids offer self-organizing, three-dimensional tissue structures that recapitulate physiological processes in the convenience of a dish. The murine mammary gland is composed of two distinct epithelial cell compartments, serving different functions: the outer, contractile myoepithelial compartment and the inner, secretory luminal compartment. Here, we describe a method by which the cells comprising these compartments are isolated and then combined to investigate their individual lineage contributions to mammary gland morphogenesis and differentiation. The method is simple and efficient and does not require sophisticated separation technologies such as fluorescence activated cell sorting. Instead, we harvest and enzymatically digest the tissue, seed the epithelium on adherent tissue culture dishes, and then use differential trypsinization to separate myoepithelial from luminal cells with ~90% purity. The cells are then plated in an extracellular matrix where they organize into bilayered, three-dimensional (3D) organoids that can be differentiated to produce milk after 10 days in culture. To test the effects of genetic mutations, cells can be harvested from wild type or genetically engineered mouse models, or they can be genetically manipulated prior to 3D culture. This technique can be used to generate mosaic organoids that allow investigation of gene function specifically in the luminal or myoepithelial compartment.

The mammary gland is a bilayered structure, comprising outer myoepithelial and inner luminal epithelial cells. Presented is a protocol to prepare organoids using differential trypsinization. This efficient method allows researchers to separately manipulate these two cell types to explore questions concerning their roles in mammary gland form and function.

차동 시도에 의한 모자이크 유방 오르가노이드 생성

Organoids offer self-organizing, three-dimensional tissue structures that recapitulate physiological processes in the convenience of a dish. The murine ...

Establishment of Human Epithelial Enteroids and Colonoids from Whole Tissue and Biopsy

The epithelium of the gastrointestinal tract is constantly renewed as it turns over. This process is triggered by the proliferation of intestinal stem cells (ISCs) and progeny that progressively migrate and differentiate toward the tip of the villi. These processes, essential for gastrointestinal homeostasis, have been extensively studied using multiple approaches. Ex vivo technologies, especially primary cell cultures have proven to be promising for understanding intestinal epithelial functions. A long-term primary culture system for mouse intestinal crypts has been established to generate 3-dimensional epithelial organoids. These epithelial structures contain crypt- and villus-like domains reminiscent of normal gut epithelium. Commonly, termed &#8220;enteroids&#8221; when derived from small intestine and &#8220;colonoids&#8221; when derived from colon, they are different from organoids that also contain mesenchyme tissue. Additionally, these enteroids/colonoids continuously produce all cell types found normally within the intestinal epithelium. This in vitro organ-like culture system is rapidly becoming the new gold standard for investigation of intestinal stem cell biology and epithelial cell physiology. This technology has been recently transferred to the study of human gut. The establishment of human derived epithelial enteroids and colonoids from small intestine and colon has been possible through the utilization of specific culture media that allow their growth and maintenance over time. Here, we describe a method to establish a small intestinal and colon crypt-derived system from human whole tissue or biopsies. We emphasize the culture modalities that are essential for the successful growth and maintenance of human enteroids and colonoids.

We describe a method to establish human enteroids from small intestinal crypts and colonoids from colon crypts collected from both surgical tissue and biopsies. In this methodological article, we present the culture modalities that are essential for the successful growth and maintenance of human enteroids and colonoids.

전체 조직과 조직 검사에서 인간 상피 Enteroids과 Colonoids 설립

The epithelium of the gastrointestinal tract is constantly renewed as it turns over. This process is triggered by the proliferation of intestinal stem ...

의학

Evaluation of Mammary Gland Development and Function in Mouse Models

The human mammary gland is composed of 15-20 lobes that secrete milk into a branching duct system opening at the nipple. Those lobes are themselves composed of a number of terminal duct lobular units made of secretory alveoli and converging ducts1. In mice, a similar architecture is observed at pregnancy in which ducts and alveoli are interspersed within the connective tissue stroma. The mouse mammary gland epithelium is a tree like system of ducts composed of two layers of cells, an inner layer of luminal cells surrounded by an outer layer of myoepithelial cells denoted by the confines of a basement membrane2. At birth, only a rudimental ductal tree is present, composed of a primary duct and 15-20 branches. Branch elongation and amplification start at the beginning of puberty, around 4 weeks old, under the influence of hormones3,4,5. At 10 weeks, most of the stroma is invaded by a complex system of ducts that will undergo cycles of branching and regression in each estrous cycle until pregnancy2. At the onset of pregnancy, a second phase of development begins, with the proliferation and differentiation of the epithelium to form grape-shaped milk secretory structures called alveoli6,7. Following parturition and throughout lactation, milk is produced by luminal secretory cells and stored within the lumen of alveoli. Oxytocin release, stimulated by a neural reflex induced by suckling of pups, induces synchronized contractions of the myoepithelial cells around the alveoli and along the ducts, allowing milk to be transported through the ducts to the nipple where it becomes available to the pups 8. Mammary gland development, differentiation and function are tightly orchestrated and require, not only interactions between the stroma and the epithelium, but also between myoepithelial and luminal cells within the epithelium9,10,11. Thereby, mutations in many genes implicated in these interactions may impair either ductal elongation during puberty or alveoli formation during early pregnancy, differentiation during late pregnancy and secretory activation leading to lactation12,13. In this article, we describe how to dissect mouse mammary glands and assess their development using whole mounts. We also demonstrate how to evaluate myoepithelial contractions and milk ejection using an ex-vivo oxytocin-based functional assay. The effect of a gene mutation on mammary gland development and function can thus be determined in situ by performing these two techniques in mutant and wild-type control mice.

This method describes how to dissect and assess mammary gland development and function from mice. Excised mammary glands are assessed for the degree of development using whole mount while milk ejection is evaluated using an oxytocin-based myoepithelial cell contraction assay.

마우스 모델에서 유선 개발 및 기능 평가

The human mammary gland is composed of 15-20 lobes that secrete milk into a branching duct system opening at the nipple. Those lobes are themselves ...

생물학

Growth and Characterization of Irradiated Organoids from Mammary Glands

Organoids derived from the digested tissue are multicellular three-dimensional (3D) constructs that better recapitulate in vivo conditions than cell monolayers. Although they cannot completely model in vivo complexity, they retain some functionality of the original organ. In cancer models, organoids are commonly used to study tumor cell invasion. This protocol aims to develop and characterize organoids from the normal and irradiated mouse mammary gland tissue to evaluate the radiation response in normal tissues. These organoids can be applied to future in vitro cancer studies to evaluate tumor cell interactions with irradiated organoids. Mammary glands were resected, irradiated to 20 Gy and digested in a collagenase VIII solution. Epithelial organoids were separated via centrifugal differentiation, and 3D organoids were developed in 96-well low-adhesion microplates. Organoids expressed the characteristic epithelial marker cytokeratin 14. Macrophage interaction with the organoids was observed in co-culture experiments. This model may be useful for studying tumor-stromal interactions, infiltration of immune cells, and macrophage polarization within an irradiated microenvironment.

Organoids developed from mouse mammary glands were irradiated and characterized to assess epithelial traits and interactions with immune cells. Irradiated organoids can be used to better evaluate cell-cell interactions that may lead to tumor cell recruitment in irradiated normal tissue.

유 방 땀 샘에서 조사 된 유기 체의 성장과 특성화

Organoids derived from the digested tissue are multicellular three-dimensional (3D) constructs that better recapitulate in vivo conditions than cell ...

Direct Bioprinting of 3D Multicellular Breast Spheroids onto Endothelial Networks

Bioprinting is emerging as a promising tool to fabricate 3D human cancer models that better recapitulate critical hallmarks of in vivo tissue architecture. In current layer-by-layer extrusion bioprinting, individual cells are extruded in a bioink together with complex spatial and temporal cues to promote hierarchical tissue self-assembly. However, this biofabrication technique relies on complex interactions among cells, bioinks and biochemical and biophysical cues. Thus, self-assembly may take days or even weeks, may require specific bioinks, and may not always occur when there is more than one cell type involved. We therefore developed a technique to directly bioprint pre-formed 3D breast epithelial spheroids in a variety of bioinks. Bioprinted pre-formed 3D breast epithelial spheroids sustained their viability and polarized architecture after printing. We additionally printed the 3D spheroids onto vascular endothelial cell networks to create a co-culture model. Thus, the novel bioprinting technique rapidly creates a more physiologically relevant 3D human breast model at lower cost and with higher flexibility than traditional bioprinting techniques. This versatile bioprinting technique can be extrapolated to create 3D models of other tissues in additional bioinks.

The goal of this protocol is to directly bioprint breast epithelial cells as multicellular spheroids onto pre-formed endothelial networks to rapidly create 3D breast-endothelial co-culture models which can be used for drug screening studies.

내피 네트워크에 3D 다세포 유방 스페로이드의 직접 생체 인쇄

Bioprinting is emerging as a promising tool to fabricate 3D human cancer models that better recapitulate critical hallmarks of in vivo tissue ...

In Vitro Apical-Out Enteroid Model of Necrotizing Enterocolitis

Necrotizing enterocolitis (NEC) is a devastating disease affecting preterm infants, characterized by intestinal inflammation and necrosis. Enteroids have recently emerged as a promising system to model gastrointestinal pathologies. However, currently utilized methods for enteroid manipulation either lack access to the apical surface of the epithelium (three-dimensional [3D]) or are time-consuming and resource-intensive (two-dimensional [2D] monolayers). These methods often require additional steps, such as microinjection, for the model to become physiologically translatable. Here, we describe a physiologically relevant and inexpensive protocol for studying NEC in vitro by reversing enteroid polarity, resulting in the apical surface facing outward (apical-out). An immunofluorescent staining protocol to examine enteroid barrier integrity and junctional protein expression following exposure to tumor necrosis factor-alpha (TNF-&#945;) or lipopolysaccharide (LPS) under normoxic or hypoxic conditions is also provided. The viability of 3D apical-out enteroids exposed to normoxic or hypoxic LPS or TNF-&#945; for 24 h is also evaluated. Enteroids exposed to either LPS or TNF-&#945;, in combination with hypoxia, exhibited disruption of epithelial architecture, a loss of adherens junction protein expression, and a reduction in cell viability. This protocol describes a new apical-out NEC-in-a-dish model which presents a physiologically relevant and cost-effective platform to identify potential epithelial targets for NEC therapies and study the preterm intestinal response to therapeutics.

In Vitro Apical-Out Enteroid Model of Necrotizing Enterocolitis

This protocol describes an apical-out necrotizing enterocolitis (NEC)-in-a-dish model utilizing small intestinal enteroids with reversed polarity, allowing access to the apical surface. We provide an immunofluorescent staining protocol to detect NEC-related epithelial disruption and a method to determine the viability of apical-out enteroids subjected to the NEC-in-a-dish protocol.

체외 괴사성 장염의 Apical-Out Enteroid 모델

Necrotizing enterocolitis (NEC) is a devastating disease affecting preterm infants, characterized by intestinal inflammation and necrosis. Enteroids have ...

Quantification of Proliferative and Dead Cells in Enteroids

The intestinal epithelium acts as a barrier that prevents luminal contents, such as pathogenic microbiota and toxins, from entering the rest of the body. Epithelial barrier function requires the integrity of intestinal epithelial cells. While epithelial cell proliferation maintains a continuous layer of cells that forms a barrier, epithelial damage leads to barrier dysfunction. As a result, luminal contents can across the intestinal barrier via an unrestricted pathway. Dysfunction of intestinal barrier has been associated with many intestinal diseases, such as inflammatory bowel disease. Isolated mouse intestinal crypts can be cultured and maintained as crypt-villus-like structures, which are termed intestinal organoids or &ldquo;enteroids&rdquo;. Enteroids are ideal to study the proliferation and cell death of intestinal epithelial cells in vitro. In this protocol, we describe a simple method to quantify the number of proliferative and dead cells in cultured enteroids. 5-ethynyl-2&rsquo;-deoxyuridine (EdU) and propidium iodide are used to label proliferating and dead cells in enteroids, and the proportion of proliferating and dead cells are then analyzed by flow cytometry. This is a useful tool to test the effects of drug treatment on intestinal epithelial cell proliferation and cell survival.

The presented protocol uses flow cytometry to quantify the number of proliferating and dead cells in cultured mouse enteroids. This method is helpful to evaluate the effects of drug treatment on organoid proliferation and survival.

엔터로이드에서 증식 및 죽은 세포의 정량화

The intestinal epithelium acts as a barrier that prevents luminal contents, such as pathogenic microbiota and toxins, from entering the rest of the body. ...