Este protocolo pode ser usado e desenvolvido para analisar como a radiação ionizante afeta o recrutamento de células tumorais, levando a uma maior compreensão da recidiva do câncer. Organoides mamários são modelos poderosos. Eles imitam características básicas in vivo, mas permitem o fácil isolamento das variáveis biológicas.
O uso de placas de baixa adesão nega os desafios de fluxo de trabalho associados às matrizes proteicas. Pacientes com câncer de mama triplo negativo experimentam recidiva regional local a taxas mais altas após a terapia. Estudar como a radiação influencia o comportamento tumoral e das células imunes levará a importantes insights sobre mecanismos de recorrência.
Demonstrando microscopia confocal dos organoides está Javier Gomez, estudante de pós-graduação do laboratório Silvera Batista. Inicie este procedimento com a remoção de glândulas mamárias abdominais e inguinais de camundongos sacrificados conforme detalhado no protocolo de texto. 45 minutos após a irradiação das amostras, conforme descrito no protocolo de texto, coloque as glândulas mamárias em uma placa celular estéril de 35 milímetros e picadinho com bisturis.
Pica com aproximadamente 40 golpes até que o tecido relaxe e pedaços sejam obtidos que não sejam maiores do que aproximadamente um milímetro quadrado na área. Agora transfira o tecido para a solução de colagem em um tubo centrífuga de 50 mililitros. Use 10 mililitros de solução de colagenase por mouse.
Coloque os tubos de amostra em um banho de água por 30 a 60 minutos a 37 graus Celsius, vórtice por cinco segundos a cada 10 minutos. A digestão é completa quando a solução de colagem é nublada. Gire a solução digerida a 450 vezes G por 10 minutos à temperatura ambiente.
Agora três camadas são observadas. O supernante é composto de gordura, a camada média é uma solução aquosa, e a parte inferior é uma pelota. A pelota parece vermelha, pois é uma mistura de células epiteliais, células estromais individuais e glóbulos vermelhos.
Pré-cubra todas as pipetas, pontas de pipeta e tubos de centrífugas com solução BSA antes do contato por adição e remoção da solução BSA. A solução BSA pode ser reutilizada, embora deva ser filtrada estéril antes de cada experimento. Para recuperação adicional, transfira o supernatante para um tubo fresco revestido de BSA de 15 mililitros.
Pipeta para cima e para baixo vigorosamente para dispersar a camada de gordura. Centrifugar a amostra a 450 vezes G por 10 minutos à temperatura ambiente. Aspire o supernasce, deixando uma pequena quantidade de mídia no tubo para evitar aspirar a pelota celular.
Agora aspire a camada aquosa do tubo com a pelota original. Adicione 10 mililitros de DMEM/F12 ao tubo com a pelota original e transfira para o segundo tubo. Pipeta vigorosamente para combinar e resuspensar as duas pelotas.
Depois de centrifugar a 450 vezes G por 10 minutos à temperatura ambiente, aspire o supernatante e adicione quatro mililitros de DMEM/F12 ao tubo. Adicione 40 microliters de desoxiribonuclease à suspensão e aperte suavemente à mão por dois a cinco minutos em temperatura ambiente. Adicione seis mililitros de DMEM/F12 e pipeta completamente.
Depois de centrifugar o tubo a 450 vezes G por 10 minutos à temperatura ambiente, aspire o supernatante à marca de 0,5 mililitro. Resuspenda a pelota em 10 mililitros de DMEM/F12 e pipeta completamente. Agora centrifufique o tubo pulsando para 450 vezes G e parando quatro segundos depois de atingir essa velocidade.
Repita as etapas de lavagem mais três vezes para purificar organoides através da diferenciação centrífuga. A pelota deve ser agora uma cor off-white consistindo apenas de organoides epiteliais. Resuspende a pelota em 10 mililitros de DMEM/F12.
Pipeta completamente para criar uma solução homogênea. Transfira 50 microlitros para uma placa de Petri de 30 milímetros e veja sob um microscópio de contraste de fase a 20X. Conte o número de organoides com um contador de contagem.
Pipeta 50 microliters de organoides em cada poço de uma placa de baixa adesão. Adicione 150 microliters de meio organoide para trazer o volume total de trabalho para 200 microliters. Substitua cuidadosamente o meio a cada dois dias.
Mantenha macrófagos brutos GFP ou D-tomate 264,7 em mídia DMEM suplementados com 10%FPS e 1%penicilina-estreptomicina. Seme as células no meio organoide na densidade desejada. Use contraste de fase de células vivas e imagens fluorescentes para monitorar a infiltração de macrófagos ao longo do tempo.
Remova o meio organoide dos poços aspirando cuidadosamente. Fixar as amostras com formalina tamponada 10% neutra por 15 minutos à temperatura ambiente. Lave os organoides fixos três vezes por cinco minutos em 1X PBS.
Se desejar, as amostras fixas podem ser armazenadas a quatro graus Celsius durante uma semana para mais manchas. Após a lavagem, permeabilize os organoides fixos por cinco minutos. Bloqueie os organoides fixos com soro de cabra 5% normal em 0,1%PBST por uma hora em temperatura ambiente antes de lavar três vezes por cinco minutos com PBS.
Incubar os organoides fixos com anti-citokeratina-14, E-cadherin, ou proteína de junção apertada, em 1%NGS em PBST por uma hora à temperatura ambiente. Em seguida, lave três vezes por cinco minutos no PBST. Agora incubar os organoides com anticorpo secundário anti-coelho de cabra com 1%NGS PBST por uma hora em temperatura ambiente.
Cubra com papel alumínio para evitar a exposição à luz. Depois de lavar como antes, use o corante nuclear para manchar núcleos por aproximadamente meia hora. Lave os organoides manchados por cinco minutos na PBS três vezes.
Se usar um slide de câmara, monte com um deslizamento de tampa. Armazene os organoides embrulhados em papel alumínio a quatro graus Celsius por até duas semanas. Organoides irradiados poderiam ser cultivados em placas de baixa adesão, ou dentro da membrana do porão, mas o crescimento mais rápido ocorreu em placas de baixa adesão.
Organoides recapitularam características da glândula mamária. Foram observados construtos morfologicamente semelhantes aos dutos e lóbulos. As tendências de crescimento indicaram que quando os organoides foram imediatamente semeados após a digestão e triagem, os organoides não irradiados cresceram mais rápido do que os organoides irradiados, provavelmente devido à parada de crescimento celular resultante de mecanismos de reparação de danos de DNA.
Os organoides expressaram características epiteliais, que foram avaliadas por meio de coloração imunofluorescente. Organoides irradiados expressavam marcadores epiteliais. Citokeratin-14, um marcador de mioepithelium, foi expressa fortemente na superfície de organoides irradiados.
Além disso, a e-cadherina e a proteína de junção apertada foram expressas dentro de junções celulares de organoides. Essas proteínas são essenciais para a adesão celular adequada. Após a irradiação, os organoides continuaram a manter suas características epiteliais.
A coloração fluorescente de organoides pode ser visualizada dentro de placas de baixa adesão usando microscopia de fluorescência. No entanto, a visualização mais clara foi obtida via microscopia confocal. A intensidade de fluorescência total corrigida foi calculada subtraindo o fundo e normalizando por área organoide.
Organoides em crescimento nas placas de baixa adesão de 96 poços também simplificaram experimentos de co-cultura. Quando semeada em concentrações típicas da glândula mamária, a colocalização do macrófago aumentou com organoides irradiados. Ao realizar este procedimento, as coisas mais importantes a se lembrar são não digerir demais os organoides, e purificar adequadamente a diferenciação centrífuga.
Após este procedimento, podem ser realizados experimentos adicionais de cocultura. Organoides podem ser co-cultivados com células tumorais, outras células imunes e células estromais para recriar o microambiente irradiado associado à recidiva. Este método será importante para avaliar como os danos normais do tecido influenciam especificamente a dinâmica das células imunes, e eventualmente serão usados para entender os mecanismos de recrutamento de células tumorais.
Organoides mamários têm mecanismos elucidados de desenvolvimento da glândula mamária, e têm robustamente recapitulado câncer de mama in vitro. Esperamos que nosso modelo forneça insights sobre o recrutamento de células tumorais induzidas por radiação.
