Gostaríamos de agradecer a Kaisa Ikkala por sua inestimável assistência técnica e perspicaz ajuda quando atualizando este método, bem como mais tarde durante a implementação às nossas perguntas de pesquisa central. Também gostaríamos de agradecer sua ajuda com planejamento as orientações do veterinário trabalho o centro de animais de laboratório e Anna Meller.

Todas as experiências são aprovadas pelo Conselho Nacional de experimento animal.
1. preparações
<ol><li>Preparar todas as soluções e manter em temperatura ambiente, salvo indicação em contrário. Siga os regulamentos de eliminação de resíduos para dispose utilizado materiais e soluções.</li>
	<li>Uso NMRI e ICR consanguíneo ações, entre as idades de 4 a 12 semanas e ambos os sexos. Se usando a linhagem C57BL/6, siga o método de preparação de cetamina-medetomidina na etapa 1.3.2. Para outras etapas, siga as instruções descritas em 1.3.3.-1.3.5.</li>
	<li>Prepare o medicamento veterinário fresco e no tempo, antes de iniciar a operação. Carprofeno será usado mais tarde, assim não é necessário para prepará-lo neste momento.<ol>
<li>Para preparar uma solução de cetamina-medetomidina para anestesia, misturar 0,375 mL (concentração de ações 50mg/mL) da cetamina (Ketaminol Vet) com 0,25 mL (concentração de ações 1 mg/mL) de medetomidina (Cepetor Vet) e adicione 1,25 mL de estéril 0,9% NaCl. Administre 0,15 mL/20 g de peso do rato (7,5 mg/kg, ketamina e 1 mg/kg, medetomidina).</li>
		<li>Para preparar uma solução mais diluída de cetamina-medetomidina anestesia em camundongos C57BL/6, misturar 0,375 mL (concentração de ações 50mg/mL) da cetamina com 0,25 mL (concentração de ações 1 mg/mL) de medetomidina e adicionar 2,5 mL de estéril 0,9% NaCl. Administre 0,15 mL/20 g de peso do rato (3,75 mg/kg, cetamina e 0,5 mg/kg, medetomidina). Nota: Este é um passo alternativo, apenas para adultos camundongos C57BL/6.</li>
		<li>Para preparar o buprenorfin para analgesia, adicionar 0,1 mL (concentração de ações 0,3 mg/mL) de buprenorfin a 1,9 mL de estéril 0,9% NaCl. Administre 0,2 mL/20 g de massa de rato (0,15 mg/kg).</li>
		<li>Para preparar o atipamezole para interromper a anestesia, adicionar 0,1 mL (concentração de ações 5 mg/mL) de atipamezole para 4,9 mL de 0,9% NaCl. Administre 0,15 mL/20 g de massa de rato (0,75 mg/kg).</li>
		<li>Para analgesia durante pós-anestesia use carprofeno. Adicionar 0,1 mL (concentração de ações 50mg/mL) de carprofeno a 4,9 mL de 0,9% NaCl. Administre 0,15 mL/20 g de peso do rato (7,5 mg/kg).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparar a solução de coloração fluorescente<ol>
<li>Para visualizar a abrasão sob a luz azul cobalto (Figura 1), use uma solução fluorescente. Preparar uma solução de fluoresceína 0,1% primeira medição 10 mg de sal de fluoresceína com uma escala bem e em seguida, adicioná-lo a 10 mL de solução salina tampão fosfato (PBS).</li>
		<li>Proteger a solução de fluoresceína de luz e agitar durante 5 minutos em uma coqueteleira. Nota: A solução de fluoresceína é sensível à luz; manter a solução coberta de luz. Esta solução pode ser armazenada em + 4 ° C durante 2-3 dias. Para uso, é útil colocar a solução de fluoresceína em um frasco conta-gotas que é usado para colírio. Use um filtro estéril quando se deslocam a solução para o frasco conta-gotas.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Limpe a ponta da rebarba ocular antes e após o uso; primeiro com PBS e, em seguida, com 70% EtOH. Se tornando uma abrasão para vários ratos durante a mesma operação, fazer as limpeza etapas entre cada rato.</li>
	<li>Ponha a placa aquecida (37 ° C) e coloque uma toalha de papel nele.</li>
</ol>2. corneal abrasão
Atenção: Utilize protectores (luvas, jaleco) quando lidar com ratos. Pese o mouse para estimar o volume de medicação a administrar.
<ol><li>Use o método agarrando com uma mão para manipular o rato23. Administrar a mistura de cetamina-medetomidina intraperitonealmente (i.p.) no abdômen inferior esquerdo. Coloque o mouse para uma gaiola individual e esperar que caia no sono. Isso geralmente leva menos de 5 minutos. Em seguida, administre buprenorfin primeiro e, em seguida, atipamezole via i.p. injeções. Use a mesma técnica de manipulação. Nota: Uma vez que a anestesia é dada, o protocolo deve não ser pausado a qualquer momento.</li>
	<li>Antes de continuar, verifique se a placa aquecida é quente. Coloque o mouse anestesiado na chapa aquecida. O nível da anestesia é bom se o reflexo de cauda está ausente, mas o reflexo do dedo do pé está presente. Estes reflexos por beliscar a cauda e qualquer dedo do pé com os dedos ou uma pinça. Não use força excessiva. Anestesia vai durar 20-25 minutos.</li>
	<li>Para tornar uma abrasão, use a rebarba ocular limpa. Gire a base das rebarbas para ativar a vibração que é essencial para fazer a abrasão. Senti a vibração na mão, quando a rebarba está funcionando corretamente.<ol>
<li>Abra um olho de cada vez, mantendo as pálpebras separadamente com os dedos. Então firmemente tocar as rebarbas para a córnea e deslocar o instrumento e para trás, bem como para os lados da superfície ocular. A vibração de rebarba executará o zero; Não pressione, agitar ou rasgar a córnea. A córnea central, 20 movimentos na superfície de abrasão são suficientes para induzir a ferida. Não levante a rebarba e tentar ficar na região da córnea para ser desgastados. Adquirir uma abrasão tamanho padrão exigirá várias rodadas de prática.</li>
	</ol>
 Nota: Assepsia da córnea pode ser conseguida antes de abrasão usando betadine solução oftálmica.</li>
</ol>3. imagem latente a abrasão
<ol><li>Ilumine a região abradada usando solução de fluoresceína e luz de caneta azul cobalto (Figura 1). A superfície ocular parece incolor em luz ambiente. Após a aplicação de fluoresceína, região abradada fluoresce a verde quando iluminando o olho com a caneta de luz.<ol>
<li>Se necessário, abra o olho abradado da mesma forma como no 2.3 e administrar uma gota de solução de fluoresceína do frasco conta-gotas. Lavar o olho uma vez com PBS ou 0,9% NaCl para reduzir fundo da fluoresceína. Use um frasco conta-gotas ou uma pipeta para lavagem. Aspirar o líquido fora com uma limpeza suave e limpar os cílios, se necessário. O excesso de líquido geralmente coleta à fronteira nasal do olho, perto da abertura do canal lacrimal. Atenção: Evite tocar a córnea enquanto cleaining como escoriações menores podem ser induzidas.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Fotografa a abrasão da córnea.<ol>
<li>Para obter imagens semelhantes durante cada sessão de imagens, use ferramentas de fixação constante para a luz de caneta azul cobalto e a câmera de SLR (Figura 2). Este protocolo fornece uma configuração fácil de repetir (Figura 2).<ol>
<li>Para anexar a luz caneta e a câmera, use um candeeiro de mesa com um braço flexível e braçadeira e um braço de câmera ajustável com uma pinça, respectivamente. Cabo-tie a caneta de luz ao candeeiro de mesa e posição logo acima do olho do rato. A luz de posicionamento diferente pode alterar a visualização da abrasão. Uma sugestão para o posicionamento dessas ferramentas é descrita na Figura 2.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Use a câmera SLR para tirar fotos do olho. Coloque o animal em uma distância desejada e a posição e o foco da câmera (01:12) na luz do quarto. Depois disso, feche todas as outras luzes, exceto a luz de caneta azul cobalto. Nota: O manípulo de luz caneta de fita para baixo ou use um elástico para manter a luz acesa o tempo todo durante a imagem latente. Isto pode ajudar se a imagem se torna embaçada. É mais fácil de executar a etapa de imagem com um colega.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. acordar após abrasão Corneal
<ol><li>Administre buprenorfin primeiro e, em seguida, atipamezole via i.p. injeções. Use a mesma técnica de manipulação, como em 2.1.</li>
	<li>Coloque uma gota de antibacteriano, fucidin ácido pomada (Isathal) para olhos desgastados e não-desgastada para hidratar e manter a superfície ocular limpo de bactérias após a anestesia.</li>
	<li>Como o mouse vai acordar em 5-20 minutos na placa aquecida, observe o mouse durante o período pós-anestésico do despertar. Quando torna-se móvel, coloque-o em uma gaiola individual. Nota: Se acordar leva mais tempo, coloque o rato na gaiola com uma almofada aquecida ou coloque a gaiola inteira sobre a chapa aquecida e monitorar o mouse regularmente. Enquanto o efeito da anestesia, o mouse normalmente sacode e atinge para cima com o corpo anterior. Esse comportamento deve retornar ao normal em 3-4 horas e então você pode colocar o mouse volta para uma jaula compartilhada.</li>
	<li>Administre o carprofeno i.p. para analgesia e olho pomada em dois dias consecutivos após a abrasão, da mesma forma como em passos 2.2. e 4.2.</li>
</ol>5. imagem latente durante a cicatrização de feridas
<ol><li>Neste protocolo, tempo de uso aponta 18 h e 72 h após a abrasão para observar o fechamento da ferida.<ol>
<li>Para tratamento de imagens consecutivo, anestesia os ratos como explicado no ponto 2.2.</li>
		<li>Tire fotos como explicado em 3.</li>
		<li>Acorde os animais com atipamezole i.p. e monitorar o período de despertar, conforme explicado no ponto 4.3. Nota: se não continuar o acompanhamento, eutanásia o mouse logo após 5.1.2. Eutanásia é descrita em 6.1.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. córnea coleção e incorporação de parafina
<ol><li>Após o último ponto de tempo, sacrifica o animal. Coloque o mouse em uma câmara que pode ser preenchida com CO2. Encher o ar da câmara com CO2. Quando o animal fica imóvel, deslocar as vértebras cervicais puxando firmemente da base da cauda e pressionando a região do pescoço para baixo, ao mesmo tempo. Cuidado: Siga sempre as orientações do órgão local de bem-estar animal.</li>
	<li>Recolha o globo ocular inteiro cortando uma abertura na pele para o lado do olho com uma tesoura de dissecação. Coloque a tesoura sob o globo ocular e cortar o nervo ocular para estalar o globo ocular fora da órbita. Use a pinça se o olho não sai facilmente.<ol>
<li>Faça um buraco na parte de trás do olho, do lado da retina, com uma agulha 26G para permitir a livre penetração das soluções dentro do olho. Nota: Não deixe o olho tornar-se seca, em vez disso, colocá-lo em PBS até continuando com o protocolo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Recolha o globo ocular em um tubo de 2 mL com PBS. Não pausa o experimento neste ponto.</li>
	<li>Remover o PBS e corrigir olhos em paraformaldeído 4% (PFA) em + 4 ° C por 4-5 horas.</li>
	<li>Mova o olho fixo para uma fita de tecido para processamento do tecido. Use um tecido de processamento da máquina e o programa a seguir:<ol>
<li>Enxaguar com PBS.</li>
		<li>Incube 2 x 45 min em etanol a 70% à temperatura ambiente.</li>
		<li>Incube 2 x 1 h em 94% de etanol na temperatura de quarto.</li>
		<li>Incube 3 x 45 min em etanol absoluto à temperatura ambiente.</li>
		<li>Incubar 3 x 1 h em xilol, a temperatura e a último xileno a 37 ° C.</li>
		<li>Incubar 3 x 1 h em cera de parafina a 60 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Após processamento de tecido, incorpore o globo ocular em parafina líquida (+ 60 ° C), usando um bloco de incorporação de tecido. Coloque o olho dentro do bloco é olhar para os lados e a borda periférica é virada para cima. Deixe o bloco solidificar em um prato legal por 5-10 minutos.</li>
</ol>7. parafina seções da córnea
<ol><li>Prepare o micrótomo para corte de acordo com as instruções da instituição ou do fabricante. Cuidado: Tenha cuidado ao manusear a lâmina afiada do micrótomo.</li>
	<li>Banho de água de um lugar com temperatura de água ultrapura ao lado do micrótomo e outro com água ultrapura aquecido a + 50 ° C.</li>
	<li>Fazer 5 µm de espessura seções do globo ocular. Nota: A lente rompe facilmente durante o corte. Para evitar isso, limpe a superfície do corte com um tecido úmido, cada vez que uma nova linha de seções é iniciada. Use água da torneira para umedecer o tecido.</li>
	<li>Colocar as seções ao lado do outro em banho de água a temperatura ambiente e em seguida, movê-los para o banho de água quente com a ajuda de uma lâmina de vidro. Estica o banho de água quente, até que todas as rugas relaxar e o fosco seções tornam-se as seções.</li>
	<li>Secar as lâminas de vidro com seções pernoite em 37 ° C.</li>
	<li>Anexar as seções para os slides, mantendo o slide por 1 minuto em uma placa aquecida em + 60 ° C. Depois disso, as seções podem ser diretamente processadas para coloração, métodos reagidos ou armazenadas em + 4 ° C.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Yi, X., Wang, Y., Yu, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Corneal+epithelial+tight+junctions+and+their+response+to+lipopolysaccharide+challenge.">Corneal epithelial tight junctions and their response to lipopolysaccharide challenge.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 41 (13), 4093-4100 (2000).</li><li>Wang, Y., Chen, M., Wolosin, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ZO-1+In+Corneal+Epithelium;+Stratal+Distribution+and+Synthesis+Induction+by+Outer+Cell+Removal.">ZO-1 In Corneal Epithelium; Stratal Distribution and Synthesis Induction by Outer Cell Removal.</a> Experimental Eye Research. 57 (3), 283-292 (1993).</li><li>Sugrue, S. P., Zieske, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ZO1+in+Corneal+Epithelium:+Association+to+the+Zonula+Occludens+and+Adherens+Junctions.">ZO1 in Corneal Epithelium: Association to the Zonula Occludens and Adherens Junctions.</a> Experimental Eye Research. 64 (1), 11-20 (1997).</li><li>Jackson, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+eye-pads+on+healing+of+simple+corneal+abrasions.">Effect of eye-pads on healing of simple corneal abrasions.</a> British Medical Journal. 2 (5200), 713 (1960).</li><li>Stepp, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wounding+the+cornea+to+learn+how+it+heals.">Wounding the cornea to learn how it heals.</a> Experimental Eye Research. 121, 178-193 (2014).</li><li>Kalha, S., Shrestha, B., Sanz Navarro, M., Jones, K. B., Klein, O. D., Michon, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bmi1++Progenitor+Cell+Dynamics+in+Murine+Cornea+During+Homeostasis+and+Wound+Healing.">Bmi1+ Progenitor Cell Dynamics in Murine Cornea During Homeostasis and Wound Healing.</a> Stem Cells. , (2018).</li><li>Nasser, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Corneal-Committed+Cells+Restore+the+Stem+Cell+Pool+and+Tissue+Boundary+following+Injury.">Corneal-Committed Cells Restore the Stem Cell Pool and Tissue Boundary following Injury.</a> Cell Reports. 22 (2), 323-331 (2018).</li><li>Kaplan, N., Fatima, A., Peng, H., Bryar, P. J., Lavker, R. M., Getsios, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EphA2/Ephrin-A1+Signaling+Complexes+Restrict+Corneal+Epithelial+Cell+Migration.">EphA2/Ephrin-A1 Signaling Complexes Restrict Corneal Epithelial Cell Migration.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 53 (2), 936 (2012).</li><li>Bai, J. -. Q., Qin, H. -. F., Zhao, S. -. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Research+on+mouse+model+of+grade+II+corneal+alkali+burn.">Research on mouse model of grade II corneal alkali burn.</a> International Journal of Ophthalmology. 9 (4), 487-490 (2016).</li><li>Chan, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protective+effects+of+matrix+metalloproteinase-12+following+corneal+injury.">Protective effects of matrix metalloproteinase-12 following corneal injury.</a> Journal of Cell Science. 126, 3948-3960 (2013).</li><li>Byeseda, S. E., Burns, A. R., Dieffenbaugher, S., Rumbaut, R. E., Smith, C. W., Li, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ICAM-1+is+necessary+for+epithelial+recruitment+of+gammadelta+T+cells+and+efficient+corneal+wound+healing.">ICAM-1 is necessary for epithelial recruitment of gammadelta T cells and efficient corneal wound healing.</a> American Journal of Pathology. 175 (2), 571-579 (2009).</li><li>Amitai-Lange, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Method+for+Lineage+Tracing+of+Corneal+Cells+Using+Multi-color+Fluorescent+Reporter+Mice.">A Method for Lineage Tracing of Corneal Cells Using Multi-color Fluorescent Reporter Mice.</a> Journal of Visualized Experiments. (106), e53370 (2015).</li><li>Amitai-Lange, A., Altshuler, A., Bubley, J., Dbayat, N., Tiosano, B., Shalom-Feuerstein, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lineage+Tracing+of+Stem+and+Progenitor+Cells+of+the+Murine+Corneal+Epithelium.">Lineage Tracing of Stem and Progenitor Cells of the Murine Corneal Epithelium.</a> Stem Cells. 33 (1), 230-239 (2015).</li><li>Blanco-Mezquita, J. T., Hutcheon, A. E. K., Stepp, M. A., Zieske, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#945;V&#946;6+Integrin+Promotes+Corneal+Wound+Healing.">&#945;V&#946;6 Integrin Promotes Corneal Wound Healing.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 52 (11), 8505 (2011).</li><li>Blanco-Mezquita, J. T., Hutcheon, A. E. K., Zieske, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Thrombospondin-1+in+Repair+of+Penetrating+Corneal+Wounds.">Role of Thrombospondin-1 in Repair of Penetrating Corneal Wounds.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 54 (9), 6262 (2013).</li><li>Gipson, I. K., Kiorpes, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+sheet+movement:+Protein+and+glycoprotein+synthesis.">Epithelial sheet movement: Protein and glycoprotein synthesis.</a> Developmental Biology. 92 (1), 259-262 (1982).</li><li>Danjo, Y., Gipson, I. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+&amp;#34;purse+string&amp;#34;+filaments+are+anchored+by+E-cadherin-mediated+adherens+junctions+at+the+leading+edge+of+the+epithelial+wound,+providing+coordinated+cell+movement.">Actin &amp;#34;purse string&amp;#34; filaments are anchored by E-cadherin-mediated adherens junctions at the leading edge of the epithelial wound, providing coordinated cell movement.</a> Journal of Cell Science. 111, 3323-3332 (1998).</li><li>Lyu, J., Joo, C. -. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt-7a+up-regulates+matrix+metalloproteinase-12+expression+and+promotes+cell+proliferation+in+corneal+epithelial+cells+during+wound+healing.">Wnt-7a up-regulates matrix metalloproteinase-12 expression and promotes cell proliferation in corneal epithelial cells during wound healing.</a> Journal of Biological Chemistry. 280 (22), 21653-21660 (2005).</li><li>Nagata, M., Nakamura, T., Hata, Y., Yamaguchi, S., Kaku, T., Kinoshita, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=JBP485+promotes+corneal+epithelial+wound+healing.">JBP485 promotes corneal epithelial wound healing.</a> Science Reports. 5, 14776 (2015).</li><li>Stepp, M. A., Zhu, L., Cranfill, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+beta+4+integrin+expression+and+localization+in+vivo+in+response+to+corneal+epithelial+injury.">Changes in beta 4 integrin expression and localization in vivo in response to corneal epithelial injury.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 37 (8), 1593-1601 (1996).</li><li>Stepp, M. A., Zhu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Upregulation+of+alpha+9+integrin+and+tenascin+during+epithelial+regeneration+after+debridement+in+the+cornea.">Upregulation of alpha 9 integrin and tenascin during epithelial regeneration after debridement in the cornea.</a> Journal of Histochemistry &amp; Cytochemistry. 45 (2), 189-201 (1997).</li><li>Pal-Ghosh, S., Tadvalkar, G., Jurjus, R. A., Zieske, J. D., Stepp, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BALB/c+and+C57BL6+mouse+strains+vary+in+their+ability+to+heal+corneal+epithelial+debridement+wounds.">BALB/c and C57BL6 mouse strains vary in their ability to heal corneal epithelial debridement wounds.</a> Experimental Eye Research. 87 (5), 478-486 (2008).</li><li>. Lab Animal Research. Rodent Handling and Restraint Techniques Available from: <a target="_blank" href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/science-education/10221/rodent-handling-and-restraint-techniques">https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/science-education/10221/rodent-handling-and-restraint-techniques</a> (2018)</li><li>Pal-Ghosh, S., Pajoohesh-Ganji, A., Tadvalkar, G., Stepp, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Removal+of+the+basement+membrane+enhances+corneal+wound+healing.">Removal of the basement membrane enhances corneal wound healing.</a> Experimental Eye Research. 93 (6), 927-936 (2011).</li><li>Suzuki, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-matrix+and+cell-cell+interactions+during+corneal+epithelial+wound+healing.">Cell-matrix and cell-cell interactions during corneal epithelial wound healing.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 22 (2), 113-133 (2003).</li><li>Sato, Y., Seo, N., Kobayashi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+background+differences+between+FVB+and+C57BL/6+mice+affect+hypnotic+susceptibility+to+pentobarbital,+ketamine+and+nitrous+oxide,+but+not+isoflurane.">Genetic background differences between FVB and C57BL/6 mice affect hypnotic susceptibility to pentobarbital, ketamine and nitrous oxide, but not isoflurane.</a> Acta Anaesthesiologica Scandinavica. 50 (5), 553-556 (2006).</li><li>Pajoohesh-Ganji, A., Pal-Ghosh, S., Tadvalkar, G., Stepp, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=K14+++Compound+niches+are+present+on+the+mouse+cornea+early+after+birth+and+expand+after+debridement+wounds.">K14 + Compound niches are present on the mouse cornea early after birth and expand after debridement wounds.</a> Developmental Dynamics. 245 (2), 132-143 (2016).</li><li>Boote, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+Assessment+of+Ultrastructure+and+Light+Scatter+in+Mouse+Corneal+Debridement+Wounds.">Quantitative Assessment of Ultrastructure and Light Scatter in Mouse Corneal Debridement Wounds.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 53 (6), 2786 (2012).</li><li>Pal-Ghosh, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MMP9+cleavage+of+the+&#946;4+integrin+ectodomain+leads+to+recurrent+epithelial+erosions+in+mice.">MMP9 cleavage of the &#946;4 integrin ectodomain leads to recurrent epithelial erosions in mice.</a> Journal of Cell Science. 124 (Pt 15), 2666-2675 (2011).</li><li>Pal-Ghosh, S., Pajoohesh-Ganji, A., Brown, M., Stepp, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mouse+model+for+the+study+of+recurrent+corneal+epithelial+erosions:+alpha9beta1+integrin+implicated+in+progression+of+the+disease.">A mouse model for the study of recurrent corneal epithelial erosions: alpha9beta1 integrin implicated in progression of the disease.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 45 (6), 1775-1788 (2004).</li></ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Ferindo métodos são ferramentas populares para estudar diferentes aspectos da homeostase da córnea e patologias. O modelo de abrasão oferece um método bem controlado para resolver problemas relevantes em oftalmologia. No entanto, determinados pontos críticos no protocolo são vale a pena enfatizar. Notavelmente, os detalhes descritos em matéria de medicina veterinária, ferida cura cronograma e resultado são otimizados para uso com estoques NMRI e ICR outbreds, mas podem variar entre cepas de ratos26. Com este protocolo, os animais experimentais permanecerá anestesiados por aproximadamente 20 minutos. Isto dá uma janela curta mas suficiente de tempo para realizar a abrasão. No entanto, ao usar a rebarba ocular, tornando a abrasão em si é uma operação muito rápida e deve ser possível realizar neste período de tempo.
Visualização fácil e acessível é uma das principais vantagens do modelo de abrasão. Isto combinado com métodos de biologia molecular, abre possibilidades para estudar as células epiteliais em grande detalhe. Abradados córneas podem ser processadas para imunológica ou histológica coloração e proteínas ou ácidos nucleicos podem ser coletados e examinados ainda mais. Pajoohesh-Ganji et al mostrou esse gene padrões de expressão da mudança de células epiteliais da córnea após insulto da córnea com uma lâmina entorpecida27. Para garantir a amostragem controlada, recomendamos que imagens das abrasões são tomadas imediatamente após a operação e coleções de amostra seguem exatamente as cronogramas planejadas.
Este protocolo tem usos além do exame de epitelização corneal. Por exemplo, abrasão de limbo corneal, o nicho de células-tronco da córnea, pode ser usada para estudar a dinâmica de células-tronco7. Nós mostramos que a região não-desgastada do epitélio permaneceu normal durante o processo de cura, no entanto, alguns autores afirmam que a membrana basal e à base do estroma keratocytes são afetados pela ocular burr24,28. A remoção da membrana porão pode ser estimada com coloração específica da membrana basal. Além disso, abrasões repetidas ao longo de uma linha de tempo mais longa poderiam revelar padrões interessantes de curativas. Neste protocolo, não observamos a arquitetura do epitélio durante uma perseguição a longo prazo. Ambos entorpecidos bisturi e lesões oculares rebarba mostraram um aumento da incidência de erosões da córnea após uma a várias semanas após a lesão de29,24,30. Isto deve ser mantido em mente ao usar o modelo de abrasão para estudos de longo prazo. No entanto, estudos enfocando erosões da córnea podem achar este protocolo útil.
Outros modelos ferindo são descritos detalhadamente por Stepp et al , em uma revisão de5. Juntos, o presente protocolo e as abordagens existentes fornecem opções versáteis para examinar questões biológicas fundamentais bem como problemas clínicos práticos.

Epitelial de inúmeros órgãos está expostos a lesões. No entanto, eles também contêm a capacidade de compensar a perda de tecido através da cicatrização da ferida. A córnea oferece um excelente modelo para estudar a cicatrização de feridas. Forma a superfície externa do olho e fornece uma camada protetora para a maquinaria ocular sensível. Assim, a córnea funciona como uma barreira física para patógenos e perda de água. É composto de três camadas; epitélio, estroma e endotélio. O epitélio da córnea torna-se a camada mais externa da córnea. Células epiteliais mantêm a função de barreira da córnea aderindo estritamente ao outro através de junções apertadas1,2,3. Uma membrana basal acelular da córnea, membrana de Bowman, separa o epitélio do estroma extensivo, que contém keratocytes refratário. Sob o estroma, células endoteliais canal nutrientes, água e oxigênio para a camada superior.
Abrasões da córnea são muito comuns na clínica4. Lesões de córnea são diversos, mas em grande parte são causados por pequenas partículas, como poeira ou areia, arranhões ou outros objectos estranhos. O protocolo descrito aqui visa reproduzir um tipo clinicamente relevante de abrasão epitelial da córnea. Ao fazê-lo, este protocolo fornece um método controlável e seminal para clínicos e cientistas da córnea implementar em seus próprios estudos. Efetuamos um ensaio de reparo de lesões no vivo na córnea murino por abrasão o tecido com uma rebarba ocular entorpecida, o II Algerbrush. Aqui, temos como alvo a abrasão para o epitélio corneano central e deixar as outras partes do órgão sem danos. Assim, o protocolo é ideal para estudo célula epitelial da córnea dinâmica ou a membrana basal durante a re-epitelização, célula de migração, proliferação e diferenciação em vivo5. Recentemente, este modelo foi usado para analisar a dinâmica de células progenitoras na córnea murino, bem como para desvendar a capacidade das células epiteliais da córnea diferenciadas em re-estabelecer o nicho de células-tronco da córnea após lesão6,7. Após abrasão, a córnea retorna ao seu normal transparência e resistência à tração. Curiosamente, um estudo em vitro indicou que re-epitelização ocorre sem célula maior proliferação8. Este protocolo descreve a linha do tempo de cicatrização ininterrupta na córnea murino. O método é, portanto, aplicável para testar o efeito das drogas sobre a cura de padrões e velocidade.
A córnea tem sido extensivamente usada para estudos de cicatrização de feridas. No entanto, muitos estudos têm contado com outros modelos de lesão. Um modelo bem estabelecido de lesão da córnea é a queimadura alcalina é executada através da aplicação de hidróxido de sódio (NaOH) com ou sem papel de filtro sobre a superfície da córnea9. Alcalina exposição resulta em uma lesão grande e difusa que afeta não só o epitélio corneano, mas também a conjuntiva e estroma9,10. Soluções alcalinas fortes foram mostradas para induzir úlceras da córnea, opacificação e neovascularização9. Células inflamatórias invadem o estroma geralmente dentro de 6 h e permanecem lá até 24 h11. Assim, a lesão alcalina é um método aconselhável em estudos relacionados à ativação do estroma. Um outro tipo de lesão química pode ser infligido aplicando dimetilsulfóxido (DMSO) na córnea9,10. Outros modelos de lesões comumente usados incluem feridas incisional que penetram através do estroma e fotorrefrativa feridas, que são limitadas a porção superior do estroma14,15. Esses métodos também são úteis para responder perguntas sobre a cicatrização de feridas do estroma. Lesão de diferentes modelos têm suas próprias vantagens e desvantagens. Abrasão, ou desbridamento, do epitélio corneano foi desenvolvida usando bisturis entorpecidas ou lâminas em ex vivo córneas16. Este método foi mais tarde usado na vivo no rato, rato e coelho17,18,19,20,21,22. Usando a rebarba ocular (Figura 1), removemos apenas uma região selecionada do epitélio, deixando o resto do epitélio afetado. Desta forma, é possível segmentar com precisão a remoção epitelial para diferentes partes do cornea. Além disso, o tamanho de abrasão pode ser avaliado com coloração de fluoresceína. Além disso, aqui seguimos encerramento abrasão durante o período de cicatrização.
Esse método apresenta diversas vantagens, i) incluindo a localização precisa do local de abrasão, que não é possível com lesão química, ii) a abrasão é rápida a executar e iii) é não-invasivo. Aqui, descrevemos o método usando o mouse NMRI outbred como modelo, no entanto, isso poderia ser aplicado para a vasta gama de modelos genéticos de rato, bem como para o rato e o coelho, que são modelos comuns usados para estudar a ruptura da córnea humana.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>NMRI mouse</td>
			<td>Envigo</td>
			<td>275</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.9% NaCl</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>use sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medetomidine</td>
			<td>Vetmedic</td>
			<td>Vnr087896</td>
			<td>Market name: Cepetor Vet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine</td>
			<td>Intervet</td>
			<td>Vnr511485</td>
			<td>Market name: Ketaminol Vet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprenorfin</td>
			<td>Invidior</td>
			<td>3015248</td>
			<td>Market name: Temgesic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Atipamezol</td>
			<td>Orion Pharma</td>
			<td>Vnr471953</td>
			<td>Market name: Antisedan Vet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carprofen</td>
			<td>Norbrook</td>
			<td>Vnr027579</td>
			<td>Market name: Norocarp Vet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1% fucidin acid eye ointment</td>
			<td>Dechra</td>
			<td>Vnr080899</td>
			<td>Market name: Isathal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescein salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F6377</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Algerbrush ii ocular burr (0.5 mm tip)</td>
			<td>Algerbrush</td>
			<td>6.39768E+11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cobalt Blue pen light</td>
			<td>SP Services</td>
			<td>DE/003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hot plate</td>
			<td>Kunz Instruments</td>
			<td>2007-0217</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital SLR camera</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>D80</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adjustable camera arm and clamp</td>
			<td>Neewer</td>
			<td>10086132</td>
			<td>Height 28 cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Table lamp with a flexible arm and a clamp</td>
			<td>Prisma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soft wipe</td>
			<td>KimtechScience</td>
			<td>7552</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 chamber</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection toolset</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringes</td>
			<td>Beckton Dickinson</td>
			<td>303172</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>26G needles</td>
			<td>Beckton Dickinson</td>
			<td>303800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL Eppendorf tube</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>689</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue casette</td>
			<td>Sakura Finetech</td>
			<td>4118F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue processing machine ASP200S</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>VWR</td>
			<td>UN1307</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin wax</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>K95523361</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue embedding mold 32 x 25 x 6 mm</td>
			<td>Sakura Finetech</td>
			<td>4123</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome</td>
			<td>Microm</td>
			<td>HM355</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath for sectioning</td>
			<td>Orthex</td>
			<td>60591</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath for sectioning</td>
			<td>Leica</td>
			<td>HI1210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome blade</td>
			<td>Feather</td>
			<td>S35</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slide</td>
			<td>Th.Geyer GmbH &#38; Co.</td>
			<td>7,695,019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure water</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MPGP04001</td>
			<td>MilliQ</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>158127</td>
			<td>PFA</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

corneal epithelial abrasion with ocular burr as a model for cornea wound healing

A córnea murino fornece um excelente modelo para estudar a cicatrização de feridas. A córnea é a camada mais externa do olho e, portanto, é a primeira defesa de lesão. Na verdade, o tipo mais comum de lesão ocular encontrado na clínica é uma abrasão da córnea. Aqui, nós utilizamos uma rebarba ocular para induzir uma abrasão, resultando na remoção do epitélio corneano na vivo em ratos anestesiados. Este método permite a interrupção epitelial visada e reprodutível, deixando outras áreas intactas. Além disso, descrevemos a visualização do epitélio com fluoresceína mancha abradado e fornecer aconselhamento concreto sobre como visualizar a abrasão da córnea. Então, seguimos a linha do tempo da ferida cura 0, 18 e 72 h após a abrasão, até que a ferida é re-epithelialized. O modelo de abrasão epitelial de lesão corneana é ideal para estudos sobre a proliferação de células epiteliais, migração e re-epitelização das camadas da córnea. No entanto, esse método não é ideal para estudar a ativação do estroma durante a cicatrização de feridas, porque a rebarba ocular não penetra nas camadas de células do estroma. Esse método também é apropriado para aplicações clínicas, por exemplo, pré-clínicos teste de eficácia de drogas.

Este protocolo descreve um modelo para infligir um dano de abrasão ao cornea de rato e sugere como seguir e visualizar o processo de cicatrização após a abrasão. Recentemente, utilizamos este método para estudar o papel das células progenitoras epiteliais da córnea durante6de cicatrização de feridas. O uso de ferramentas estabelecidas é a chave para uma experiência bem sucedida de abrasão. Nós e outros, têm usado as rebarbas ocular Algerbrush II (Figura 1) para executar a abrasões6,7,24. Esta ferramenta tem uma ponta de rebarba entorpecida de 0,5 mm de tamanho que escovas fora ao invés de brocas ou tesouras do epitélio corneano. Assim, esta ferramenta é a opção recomendada para uma lesão de abrasão na córnea.
Uma parte central deste modelo é que a região afetada pode ser facilmente visualizada em intervalos desejados. Na Figura 3A, apresentamos o uso da fluoresceína mancha em combinação com uma fonte de luz azul cobalto (Figura 1) para exibir o site da abrasão. Neste experimento, realizamos um grande ferimento na córnea central e deixado intocada córnea periférica (Figura 3A). Além disso, estamos desgastados apenas o olho esquerdo de cada rato e manteve o olho bilateral, bem como um controle de não-desgastada. As amostras de olho bilateral manteve-se negativa para o sinal de fluoresceína, que sugere que eles não passam por qualquer perda de célula durante o experimento e assim funcionar bem como amostras de controlo. No entanto, sinal verde nas fronteiras do olho exibido a solução de fluoresceína que acumulou na junção entre o olho e a pálpebra. A abrasão foi maior às 0h, imediatamente após a lesão (Figura 3A). Foi marcadamente menor após 18 h e, neste caso, sua proximidade com a borda superior do olho. No entanto, o epitélio fecha a região exposta a uma velocidade igual de todos os lados da abrasão. Notavelmente, em 72 h após ferimento, nenhum sinal verde era visível. Isso indica que o epitélio corneano foi totalmente re-epithelialized por 72 h após a abrasão.
Com este método, que visa focar a abrasão apenas sobre o epitélio corneano, para que as camadas mais profundas da córnea permaneceram intactas. A remoção do epitélio corneano era evidente de cortes histológicos na Figura 3B. Às 0h, a borda da abrasão é mostrada como uma saliência estreita, acelular que é contínua, desde um regular, epitélio corneano grosso célula 4-5 de camadas. Limbo, borda periférica do epitélio corneano, apresenta uma região de exemplo que não foi afetado pela abrasão durante todo cronograma experimental (72 h). Além disso, cortes histológicos indicaram que as camadas mais profundas da córnea, o estroma e o endotélio, não foram prejudicados por burr a ocular. Estes dois tecidos apareceram semelhantes em amostras de olho desgastados e bilateral. No pós-lesão 18 h, o processo de cicatrização é ativo e re-epitelização está em curso. Isto foi sugerido pelo surgimento de uma vanguarda. A extremidade contém apenas 1-2 camadas de células epiteliais e abrange a região exposta antes de re-estratificação pode ocorrer25. Em consonância com os resultados na Figura 3A, a superfície foi totalmente re-epithelialized por 72 h, quando as frentes migratórias tinham coberto a ferida e todas as camadas epiteliais novamente estavam presentes. Cortes histológicos do olho bilateral confirmaram (Figura 3A), que os olhos de controle permaneceram intactos durante o período de observação.
Por último, nós fornecemos a evidência de que o modelo de abrasão é restrito para o epitélio corneano e não invoca uma resposta estromal de lesão, tais como neovascularização. A Figura 4 mostra a córnea murino às 18 h após a abrasão. Com base na visão macroscópica, neste ponto do tempo não exibir uma resposta estromal, indicando assim que nosso protocolo não interrompa as camadas mais profundas da córnea. Em comparação, uma lesão alcalina com 0,75 mol/L do NaOH induzida imediatamente neovascularização no estroma. Dada a rápida neovascularização na lesão alcalina, os pontos de tempo em nosso método fornecem provas para descartar a possibilidade de resposta no estroma.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58071/58071fig1.jpg"> Figura 1: ferramentas essenciais para abrasão epitelial corneana. À esquerda está uma rebarba ocular vibratória. A luz de caneta azul cobalto no canto direito é usada para trazer a mancha de fluoresceína visível. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/58071/58071fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58071/58071fig2.jpg"> Figura 2: imagem da abrasão da córnea. (A) ferramentas para geração de imagens são um braço de câmera ajustável com grampo (à esquerda), a câmera de SLR (centro) e um candeeiro de mesa com braço flexível e braçadeira (à direita). A luz de caneta azul cobalto está ligada à cúpula da lâmpada com duas abraçadeiras. (B) uma visão geral da configuração de imagem; a distância de cada ferramenta de fixação está marcada na imagem em cm. Ambos os grampos são 6 cm longe da placa calor e o mouse é colocado a 10 cm de distância da borda de placa de calor. (C) um olhar mais de perto a imagem de abrasão com distância proposta e posição para o olho do rato em cm. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/58071/58071fig2large.jpg" target="_blank">clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58071/58071fig3.jpg"> Figura 3: deteção e localização de abrasão corneal. (A) olhos de rato em 0, 18 e 72 h após a abrasão. Sinal de fluoresceína marca região abradada em verde-claro, Considerando que todas as outras regiões no epitélio permanecem escuras. Olhos bilaterais servem como controles. Linha tracejada marca as bordas da ferida e a mancha branca em cada olho é o reflexo da câmera. (B) histologicamente seccionado e hematoxilina e eosina manchado amostras dos olhos do mouse em 0, 18 e 72 h após a abrasão. Limbo é a fronteira que rodeia o epitélio corneano de todos os lados. Asterix marca a borda da abrasão. Barra de escala é 100 µm. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/58071/58071fig3large.jpg" target="_blank">clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58071/58071fig4.jpg"> Figura 4: abrasão Corneal não ativa uma resposta estromal. Exposição alcalina com 0,75 mol/L do NaOH, seguido de irrigação com 0,9% NaCl produz neovascularização da córnea (olho recolhido imediatamente após o tratamento). Abrasão com a rebarba ocular mostra sem neovascularização mesmo após 18 h. abrasão site é marcado com uma linha tracejada. Escala da barra 1 mm. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/58071/58071fig4large.jpg" target="_blank">clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Corneal Epithelial Abrasion with Ocular Burr As a Model for Cornea Wound Healing at JoVE.com

Corneal Epithelial Abrasion with Ocular Burr As a Model for Cornea Wound Healing

Cicatrização de feridas abrasão epitelial da córnea com Burr Ocular como um modelo para córnea

Este protocolo descreve um método para infligir uma abrasão na superfície ocular do mouse e a seguir a ferida que daí em diante o processo de cura. O protocolo se aproveita de uma rebarba ocular para remover parcialmente o epitélio superficial do olho em camundongos anestesiados.

The murine cornea provides an excellent model to study wound healing. The cornea is the outermost layer of the eye, and thus is the first defense to ...

corneal-epithelial-abrasion-with-ocular-burr-as-model-for-cornea

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Medicine

20.2K visualizações.  University of Helsinki. Este protocolo descreve um método para infligir uma abrasão na superfície ocular do mouse e a seguir a ferida que daí em diante o processo de cura. O protocolo se aproveita de uma rebarba ocular para remover parcialmente o epitélio superficial do olho em camundongos anestesiados.

Vídeo: Corneal Epithelial Abrasion with Ocular Burr As a Model for Cornea Wound Healing

A Mouse Model of the Cornea Pocket Assay for Angiogenesis Study

A normal cornea is clear of vascular tissues. However, blood vessels can be induced to grow and survive in the cornea when potent angiogenic factors are administered 1. This uniqueness has made the cornea pocket assay one of the most used models for angiogenesis studies. The cornea composes multiple layers of cells. It is therefore possible to embed a pellet containing the angiogenic factor of interest in the cornea to investigate its angiogenic effect 2,3. Here, we provide a step by step demonstration of how to (I) produce the angiogenic factor-containing pellet (II) embed the pellet into the cornea (III) analyze the angiogenesis induced by the angiogenic factor of interest. Since the basic fibroblast growth factor (bFGF) is known as one of the most potent angiogenic factors 4, it is used here to induce angiogenesis in the cornea.

The cornea is unique in that it lacks vascular tissues. However, robust blood vessel growth and survival can be induced in the cornea by potent angiogenic factors. Therefore, the cornea can provide with us a valuable tool for angiogenic studies. This protocol demonstrates how to perform the mouse model of cornea pocket assay and how to assess the angiogenesis induced by angiogenic factors using this model.

Um modelo do rato do Ensaio de bolso Córnea para o Estudo da angiogênese

A normal cornea is clear of vascular tissues. However, blood vessels can be induced to grow and survive in the cornea when potent angiogenic factors are ...

Medicina

Murine Model of Wound Healing

Wound healing and repair are the most complex biological processes that occur in human life. After injury, multiple biological pathways become activated. Impaired wound healing, which occurs in diabetic patients for example, can lead to severe unfavorable outcomes such as amputation. There is, therefore, an increasing impetus to develop novel agents that promote wound repair. The testing of these has been limited to large animal models such as swine, which are often impractical. Mice represent the ideal preclinical model, as they are economical and amenable to genetic manipulation, which allows for mechanistic investigation. However, wound healing in a mouse is fundamentally different to that of humans as it primarily occurs via contraction. Our murine model overcomes this by incorporating a splint around the wound. By splinting the wound, the repair process is then dependent on epithelialization, cellular proliferation and angiogenesis, which closely mirror the biological processes of human wound healing. Whilst requiring consistency and care, this murine model does not involve complicated surgical techniques and allows for the robust testing of promising agents that may, for example, promote angiogenesis or inhibit inflammation. Furthermore, each mouse acts as its own control as two wounds are prepared, enabling the application of both the test compound and the vehicle control on the same animal. In conclusion, we demonstrate a practical, easy-to-learn, and robust model of wound healing, which is comparable to that of humans.

A murine model of cutaneous wound healing that can be used to assess therapeutic compounds in physiological and pathophysiological settings.

Modelo Murino de Cicatrização

Wound healing and repair are the most complex biological processes that occur in human life. After injury, multiple biological pathways become activated. ...

Multimodal Quantitative Phase Imaging with Digital Holographic Microscopy Accurately Assesses Intestinal Inflammation and Epithelial Wound Healing

The incidence of inflammatory bowel disease, i.e., Crohn&#39;s disease and Ulcerative colitis, has significantly increased over the last decade. The etiology of IBD remains unknown and current therapeutic strategies are based on the unspecific suppression of the immune system. The development of treatments that specifically target intestinal inflammation and epithelial wound healing could significantly improve management of IBD, however this requires accurate detection of inflammatory changes. Currently, potential drug candidates are usually evaluated using animal models in vivo or with cell culture based techniques in vitro. Histological examination usually requires the cells or tissues of interest to be stained, which may alter the sample characteristics and furthermore, the interpretation of findings can vary by investigator expertise. Digital holographic microscopy (DHM), based on the detection of optical path length delay, allows stain-free quantitative phase contrast imaging. This allows the results to be directly correlated with absolute biophysical parameters. We demonstrate how measurement of changes in tissue density with DHM, based on refractive index measurement, can quantify inflammatory alterations, without staining, in different layers of colonic tissue specimens from mice and humans with colitis. Additionally, we demonstrate continuous multimodal label-free monitoring of epithelial wound healing in vitro, possible using DHM through the simple automated determination of the wounded area and simultaneous determination of morphological parameters such as dry mass and layer thickness of migrating cells. In conclusion, DHM represents a valuable, novel and quantitative tool for the assessment of intestinal inflammation with absolute values for parameters possible, simplified quantification of epithelial wound healing in vitro and therefore has high potential for translational diagnostic use.

Accurate assessment of anti-inflammatory effects is of utmost importance for the evaluation of potential new drugs for the treatment of inflammatory bowel disease. Digital holographic microscopy provides assessment of inflammation in murine and human colonic tissue samples as well as automated multimodal evaluation of epithelial wound healing in vitro.

Multimodal Quantitative Fase de imagem com o Digital Holographic Microscopia com precisão Avalia Cura inflamação intestinal e epitelial de Feridas

The incidence of inflammatory bowel disease, i.e., Crohn&#39;s disease and Ulcerative colitis, has significantly increased over the last decade. The ...

Creation and Transplantation of an Adipose-derived Stem Cell (ASC) Sheet in a Diabetic Wound-healing Model

Artificial skin has achieved considerable therapeutic results in clinical practice. However, artificial skin treatments for wounds in diabetic patients with impeded blood flow or with large wounds might be prolonged. Cell-based therapies have appeared as a new technique for the treatment of diabetic ulcers, and cell-sheet engineering has improved the efficacy of cell transplantation. A number of reports have suggested that adipose-derived stem cells (ASCs), a type of mesenchymal stromal cell (MSC), exhibit therapeutic potential due to their relative abundance in adipose tissue and their accessibility for collection when compared to MSCs from other tissues. Therefore, ASCs appear to be a good source of stem cells for therapeutic use. In this study, ASC sheets from the epididymal adipose fat of normal Lewis rats were successfully created using temperature-responsive culture dishes and normal culture medium containing ascorbic acid. The ASC sheets were transplanted into Zucker diabetic fatty (ZDF) rats, a rat model of type 2 diabetes and obesity, that exhibit diminished wound healing. A wound was created on the posterior cranial surface, ASC sheets were transplanted into the wound, and a bilayer artificial skin was used to cover the sheets. ZDF rats that received ASC sheets had better wound healing than ZDF rats without the transplantation of ASC sheets. This approach was limited because ASC sheets are sensitive to dry conditions, requiring the maintenance of a moist wound environment. Therefore, artificial skin was used to cover the ASC sheet to prevent drying. The allogenic transplantation of ASC sheets in combination with artificial skin might also be applicable to other intractable ulcers or burns, such as those observed with peripheral arterial disease and collagen disease, and might be administered to patients who are undernourished or are using steroids. Thus, this treatment might be the first step towards improving the therapeutic options for diabetic wound healing.

Creation and Transplantation of an Adipose-derived Stem Cell ASC Sheet in a Diabetic Wound-healing Model

Adipose-derived stem cells (ASCs) are easily isolated and harvested from the fat of normal rats. ASC sheets can be created using cell-sheet engineering and can be transplanted into Zucker diabetic fatty rats exhibiting full-thickness skin defects with exposed bone and then covered with a bilayer of artificial skin.

Criação e transplante de uma folha de células-tronco adiposo-derivado (ASC) em um modelo de cicatrização de feridas diabética

Artificial skin has achieved considerable therapeutic results in clinical practice. However, artificial skin treatments for wounds in diabetic patients ...

Development of a Direct Pulp-capping Model for the Evaluation of Pulpal Wound Healing and Reparative Dentin Formation in Mice

Dental pulp is a vital organ of a tooth fully protected by enamel and dentin. When the pulp is exposed due to cariogenic or iatrogenic injuries, it is often capped with biocompatible materials in order to expedite pulpal wound healing. The ultimate goal is to regenerate reparative dentin, a physical barrier that functions as a "biological seal" and protects the underlying pulp tissue. Although this direct pulp-capping procedure has long been used in dentistry, the underlying molecular mechanism of pulpal wound healing and reparative dentin formation is still poorly understood. To induce reparative dentin, pulp capping has been performed experimentally in large animals, but less so in mice, presumably due to their small sizes and the ensuing technical difficulties. Here, we present a detailed, step-by-step method of performing a pulp-capping procedure in mice, including the preparation of a Class-I-like cavity, the placement of pulp-capping materials, and the restoration procedure using dental composite. Our pulp-capping mouse model will be instrumental in investigating the fundamental molecular mechanisms of pulpal wound healing in the context of reparative dentin in vivo by enabling the use of transgenic or knockout mice that are widely available in the research community.

We describe a step-by-step method of performing direct pulp capping on mice teeth for the evaluation of pulpal wound healing and reparative dentin formation in vivo.

Desenvolvimento de um Modelo-capeamento pulpar direto para a Avaliação dos pulpar cicatrização de feridas e Formação reparadora dentina em Ratos

Dental pulp is a vital organ of a tooth fully protected by enamel and dentin. When the pulp is exposed due to cariogenic or iatrogenic injuries, it is ...

Microscopy Based Methods for the Assessment of Epithelial Cell Migration During In Vitro Wound Healing

Cell migration is a mandatory aspect for wound healing. Creating artificial wounds on research animal models often results in costly and complicated experimental procedures, while potentially lacking in precision. In vitro culture of epithelial cell lines provides a suitable platform for researching the cell migratory behavior in wound healing and the impact of treatments on these cells. The physiology of epithelial cells is often studied in non-confluent conditions; however, this approach may not resemble natural wound healing conditions. Disrupting the epithelium integrity by mechanical means generates a realistic model, but may impede the application of molecular techniques. Consequently, microscopy based techniques are optimal for studying epithelial cell migration in vitro. Here we detail two specific methods, the artificial wound scratch assay and the artificial migration front assay, that can obtain quantitative and qualitative data, respectively, on the migratory performance of epithelial cells.

Microscopy Based Methods for the Assessment of Epithelial Cell Migration During  In Vitro Wound Healing

This manuscript describes how incision-like lesions made on cultured epithelial cell monolayers conveniently model wound healing in vitro, allowing for imaging by confocal or laser scanning microscopy, and which can provide high-quality quantitative and qualitative data for studying both cell behavior and the mechanisms involved in migration.

Microscopia com base em métodos de avaliação da migração de células epiteliais durante a cicatrização em Vitro

Cell migration is a mandatory aspect for wound healing. Creating artificial wounds on research animal models often results in costly and complicated ...

Ex Vivo Corneal Organ Culture Model for Wound Healing Studies

The cornea has been used extensively as a model system to study wound healing. The ability to generate and utilize primary mammalian cells in two dimensional (2D) and three dimensional (3D) culture has generated a wealth of information not only about corneal biology but also about wound healing, myofibroblast biology, and scarring in general. The goal of the protocol is an assay system for quantifying myofibroblast development, which characterizes scarring. We demonstrate a corneal organ culture ex vivo model using pig eyes. In this anterior keratectomy wound, corneas still in the globe are wounded with a circular blade called a trephine. A plug of approximately 1/3 of the anterior cornea is removed including the epithelium, the basement membrane, and the anterior part of the stroma. After wounding, corneas are cut from the globe, mounted on a collagen/agar base, and cultured for two weeks in supplemented-serum free medium with stabilized vitamin C to augment cell proliferation and extracellular matrix secretion by resident fibroblasts. Activation of myofibroblasts in the anterior stroma is evident in the healed cornea. This model can be used to assay wound closure, the development of myofibroblasts and fibrotic markers, and for toxicology studies. In addition, the effects of small molecule inhibitors as well as lipid-mediated siRNA transfection for gene knockdown can be tested in this system.

A protocol for an ex vivo corneal organ culture model useful for wound healing studies is described. This model system can be used to assess the effects of agents to promote regenerative healing or drug toxicity in an organized 3D multicellular environment.

Ex Vivo modelo de cultura órgão da córnea para cicatrização de feridas estudos

The cornea has been used extensively as a model system to study wound healing. The ability to generate and utilize primary mammalian cells in two ...

Targeting Gray Rami Communicantes in Selective Chemical Lumbar Sympathectomy

Chemical lumbar sympathectomy (CLS) is a commonly used, minimally invasive procedure for the treatment of conditions including ischemic diseases of the lower extremities, hyperhidrosis, etc. It is commonly practiced to position the puncture needle tip in front of the anterior fascia of the psoas major muscle and inject the inactivating agent around the sympathetic trunk, which is defined as conventional CLS. Although relatively rare, ureteropelvic damage is the most frequently reported complication of conventional CLS and can cause serious harm to patients. We found that injecting the inactivating agent behind the anterior fascia, which only targets gray rami communicantes, helped achieve therapeutic efficacy in&#160;vasodilation, sweat reduction, and pain relief comparable to conventional CLS, and serious complications were largely reduced. We define this procedure as selective CLS. Here, we present a protocol of selective CLS. The precise needle tract and accurate evaluation of the spreading of the contrast agent are critical to ensure that the drug is injected behind the anterior fascia of the psoas major muscle. The needle tip is at approximately one-third the dividing line of the vertebral body in the lateral view of a lumbar X-ray. The contrast is mainly confined around the needle tip and spreads outward and downward along the psoas muscle fibers. In this way, the anterior fascia provides a natural barrier for the ureteropelvic area, and the psoas major muscle provides a natural barrier for the lumbar nerve root. There are several highlights of this article, including 1) a detailed description of the selective CLS procedures, 2) an explanation of the anatomical basis for the implementation of selective CLS, and 3) an explanation of the differences between selective and conventional CLS.

We present a protocol for selective chemical lumbar sympathectomy (CLS), which inactivates only gray rami communicantes and not the sympathetic trunk. Selective CLS can help achieve therapeutic efficacy in vasodilation, sweat reduction, and pain relief that are comparable to conventional CLS, and serious complications, particularly ureteropelvic damages, can be reduced.

Direcionamento de Rami cinza Communicantes em simpatectomia lombar química seletiva

Chemical lumbar sympathectomy (CLS) is a commonly used, minimally invasive procedure for the treatment of conditions including ischemic diseases of the ...

A Porcine Corneal Endothelial Organ Culture Model Using Split Corneal Buttons

Experimental research on corneal endothelial cells is associated with several difficulties. Human donor corneas are scarce and rarely available for experimental investigations as they are normally needed for transplantation. Endothelial cell cultures often do not translate well to in vivo situations. Due to the biostructural characteristics of non-human corneas, stromal swelling during cultivation induces substantial corneal endothelial cell loss, which makes it difficult to perform cultivation for an extended period of time. Deswelling agents such as dextran are used to counteract this response. However, they also cause significant endothelial cell loss. Therefore, an ex vivo organ culture model not requiring deswelling agents was established. Pig eyes from a local slaughterhouse were used to prepare split corneal buttons. After partial corneal trephination, the outer layers of the cornea (epithelium, bowman layer, parts of the stroma) were removed. This significantly reduces corneal endothelial cell loss induced by massive stromal swelling and Descemet&#39;s membrane folding throughout longer cultivation periods and improves general preservation of the endothelial cell layer. Subsequent complete corneal trephination was followed by the removal of the split corneal button from the remaining eye bulb and cultivation. Endothelial cell density was assessed at follow-up times of up to 15 days after preparation (i.e., days 1, 8, 15) using light microscopy. The preparation technique used allows a better preservation of the endothelial cell layer enabled by less stromal tissue swelling, which results in slow and linear decline rates in split corneal buttons comparable to human donor corneas. As this standardized organo-typically cultivated research model for the first time allows a stable cultivation for at least two weeks, it is a valuable alternative to human donor corneas for future investigations of various external factors with regards to their effects on the corneal endothelium.

Here, a step-by-step protocol for the preparation and cultivation of porcine split corneal buttons is presented. As this organo-typically cultivated organ culture model shows cell death rates within 15 days, comparable to human donor corneas, it represents the first model allowing long-term cultivation of non-human corneas without adding toxic dextran.

Um modelo de cultura de órgão endotelial corneano porcina usando Split córnea botões

Experimental research on corneal endothelial cells is associated with several difficulties. Human donor corneas are scarce and rarely available for ...

Development of a Noninvasive, Laser-Assisted Experimental Model of Corneal Endothelial Cell Loss

Nd:YAG lasers have been used to perform noninvasive intraocular surgery, such as capsulotomy for several decades now. The incisive effect relies on the optical breakdown at the laser focus. Acoustic shock waves and cavitation bubbles are generated, causing tissue rupture. Bubble sizes and pressure amplitudes vary with pulse energy and position of the focal point. In this study, enucleated porcine eyes were positioned in front of a commercially available Nd:YAG laser. Variable pulse energies as well as different positions of the focal spots posterior to the cornea were tested. Resulting lesions were evaluated by two-photon microscopy and histology to determine the best parameters for an exclusive detachment of corneal endothelial cells (CEC) with minimum collateral damage. The advantages of this method are the precise ablation of CEC, reduced collateral damage, and above all, the non-contact treatment.

Here, we present a protocol to detach corneal endothelial cells (CEC) from Descemet&#8217;s membrane (DM) using a neodymium:YAG (Nd:YAG) laser as an ex vivo disease model for bullous keratopathy (BK).

Desenvolvimento de um modelo experimental não invasivo, assistido a laser de perda de células endoteliais córneas

Nd:YAG lasers have been used to perform noninvasive intraocular surgery, such as capsulotomy for several decades now. The incisive effect relies on the ...