Este trabalho foi apoiado pelo Instituto de Coreia da ciência e tecnologia programa institucional (n º de projetos 2E26190 e 2E26170) e o programa de ciência de fronteira humana (RGY0089/2012).

todos os métodos descritos foram aprovados pelo Comitê de uso do Instituto de Coreia da ciência e tecnologia e cuidado Animal.
 1. preparando a unidade de Micro e eletrodo <ol><li>montar o micro drive.
	<ol><li>Imprimir as peças do micro-drive (controle deslizante, corpo e shell) 14 usando uma impressora 3D de alta resolução. Certifique-se as peças sem defeitos.</li>
		<li>Consertar o controle deslizante para o corpo de micro-drive com um parafuso (tamanho 000-120 x 1/4).</li>
		<li>Soldar uma porca (tamanho 000-120 120 000/64 Hex) para a ponta do parafuso.</li>
		<li>Gire o parafuso no sentido horário para mover o controle deslizante até ou anti-horário para movê-lo para baixo.</li>
		<li>Corrigir o shell para o corpo com um parafuso (tamanho 000-120 x 1/4).</li>
	</ol></li> <li>a sonda de montagem na unidade micro.
	<ol><li>Reparar o micromovimentação na posição horizontal, sob um microscópio binocular.</li>
		<li>Use um agrafo plana com enchimento de borracha para pegar o cabo flex da sonda silício, enquanto desanexando cuidadosamente a sonda do gabinete da expedição com fórceps. Fixar o grampo de jacaré para um manipulador.</li>
		<li>Usando o manipulador, colocar a sonda de silicone no controle deslizante micro drive, paralelamente à direção do movimento.</li>
		<li>Aplicar uma gota de cimento dental (temperatura de cura acrílica dental reparar material) para fixar a sonda para o controle deslizante. Corrija a posição da sonda se mudou. Cola não é recomendada, pois ele cura muito rápido e torna difícil reajustar a posição do eletrodo.</li>
		<li>Consertar o conector da sonda para o C-suporte (suporte conector) com cimento dental.</li>
	</ol></li> <li>Limpeza e colocar corante na sonda.
	<ol><li>Fix a sonda/Microdrive assemblage no dispositivo de limpeza de sonda. O dispositivo é equipado com 2 pequeno giro esponjas de espuma (amostras não-estéril). Ajustar a lacuna por manipulator.</li>
		<li>Embeber as esponjas com detergente.</li>
		<li>Mova lentamente a sonda em cima e para baixo entre as esponjas, que permite um toque suave. Monitorar o processo de limpeza sob um microscópio.</li>
		<li>Lavar a sonda com água destilada. Mergulhe a sonda em álcool para esterilização.</li>
		<li>Aplicar Dil (corante lipofílico fluorescente) na parte de trás dos desvios da sonda, usando um cotonete de espuma. Isto permitirá a visualização dos locais de haste no cérebro em uma fase posterior.</li>
	</ol></li> <li>Montagem do chapéu <ol><li>imprimir as peças do chapéu (cabeça-placa, titular de conector e tampa) 14 usando uma impressora 3D. As 3 partes se encaixam para formar um gabinete selado.</li>
		<li>Inserir porcas (tamanho M2 e 00-90 90 00/4) nas ranhuras da cabeça-placa e fixar com cola e cimento dental.</li>
		<li>Inserir uma anilha na ranhura da tampa e fixe com cimento dental.</li>
	</ol></li></ol> 2. Cirurgia para fixação do chapéu no crânio todas as ferramentas utilizadas para a cirurgia são esterilizadas previamente em autoclave. É utilizado um dispositivo de grânulos de calor seco forto esterilizar ferramentas que tornam-se contaminadas e precisam ser esterilizados durante a cirurgia.
<ol><li>Definir o nível de isoflurano para 4% para o início da anestesia. Coloque o mouse na câmara de anestesia 5 min.</li>
	<li>Instalar o mouse em um aparelho estereotáxica.</li>
	<li>Reduzir o nível de isoflurano 1,5-2%. Ajustar o nível durante a cirurgia de acordo com o estado animal, taxa de respiração e corpo temperatura 20.</li>
	<li>Aplicar a pomada sobre os olhos.</li>
	<li>Raspar o couro cabeludo e limpar a cabeça do animal com anti-séptico (iodopovidone). Manter condições assépticas durante todas as etapas da cirurgia.</li>
	<li>Inject bupivacaína (1 mg/kg), sob o couro cabeludo. Cortar e remover parte da pele da cabeça do mouse usando a tesoura bem para expor o crânio em suas bordas parietal. Usar soro fisiológico e uma esponja hemostática de limpar e controlar o sangramento durante a cirurgia.</li>
	<li>Remover o periósteo usando uma ferramenta de raspador.</li>
	<li>Encontrar os pontos de referência sobre o crânio 21: bregma, lambda, coronal e sagital sutura. Ajustar a cabeça &#39; s ângulo ao longo do eixo sagital, tal que o Bregma e o lambda pontos estão à mesma altura.</li>
	<li>Dois furos (~0.5 mm de diâmetro) no crânio para os eletrodos de referência e o chão. Os furos devem ser de aproximadamente 1 mm caudal e lateral de 1 mm do Lambda.</li>
	<li>Os eléctrodos do chão e referência (tamanho miniatura 000-120 000-120/16 aço inoxidável parafusos fio acoplados aos conectores de pino).</li>
	<li>Aplicar raios ultravioleta (UV) ativador de dentina no crânio de ligação e em seguida, aplicar a luz UV para s. 45-60</li>
	<li>Aplique uma camada de cimento dental nas bordas do crânio. Evitar a propagação de cimento sobre a pele e os cabelos dos ratos.</li>
	<li>Fixe a chapa de cabeça para um manipulador estereotáxica e posicione-o acima do crânio. Lentamente Abaixe a cabeça-placa até toca ligeiramente o crânio e aplique o cimento dental na junção com o crânio. Deixe-a cura do cimento dental durante 15 min.</li>
	<li>Remover a anestesia. Consertar um conector-titular e um boné na cabeça-placa. Coloque o mouse em sua jaula depois de dar uma injeção sub-cutâneo de ketaprofen 5 mg/kg</li>
	<li>Dar injeções sub-cutâneo de ketaprofen 5 mg/kg para os dois próximos dias e monitor cuidadosamente por qualquer sinal de dor. Os ratos normalmente acordam da anestesia dentro de 20-40 min. O implante de chapéu é relativamente luz (3,34 g), tal que os ratos não têm problemas para levantar sua cabeça, correr em labirintos e subir nas bordas de sua gaiola em casa.</li>
</ol> 3. Treinamento comportamental <ol><li>após um período de recuperação pós-operatório de 7 dias, iniciar a restrição de água a 1 mL por dia.</li>
	<li>Para fazer o cinto de esteira, corte um pedaço de tecido de veludo (5 cm por 1-2 m) e consertar pequenos objetos nele usando cola quente. Anexar objetos erigidos nas bordas da correia para não interferir com o movimento do mouse.</li>
	<li>Fixar o cinto nas rodas da esteira de sutura juntos nas duas extremidades.</li>
	<li>Instalar o mouse de cabeça-fixo na esteira inserindo e apertar os dois parafusos da placa de cabeça nas ranhuras da placa de fixação de cabeça.</li>
	<li>Iniciar o mouse para correr de cabeça-contido na esteira para a recompensa de água de formação. Entrega a recompensa de água através de uma porta de lamber. Inicialmente, coloque o mouse sobre a esteira por períodos de 10 minutos, 3 vezes por dia.</li>
	<li>Conforme o mouse se acostuma com a cabeça-fixação e começa a se mover a cintura (normalmente depois de ~ 3 dias), aumentar o treino duração de 30 min. Após 2-3 semanas, alguns ratos executar mais de 100 ensaios em 30 min (uma prova ser uma rotação completa do cinto).</li>
	<li>Escolher os ratos apresentando as melhores performances comportamentais para os experimentos de gravação.</li>
</ol> 4. Implantação da sonda silício <ol><li>colocar o rato sob anestesia.</li>
	<li>Instalar o mouse no aparato estereotáxica, fixando a placa-de-cabeça. Limpe a superfície do crânio com solução salina.</li>
	<li>Encontrar marcadores estereotáxicos: bregma, lambda, coronal e sagital sutura. Medir a distância até o ponto de inserção e marcá-lo</li>
	<li>Perfurar o osso cuidadosamente até que se torne fina e transparente. Umedecer e limpe com soro fisiológico durante a perfuração.</li>
	<li>Remover cuidadosamente o osso diluído e a dura-máter usando força de precisãoPS. Mantenha a superfície do cérebro molhado com soro fisiológico, o tempo todo.</li>
	<li>Corrigir a montagem de sonda Microdrive/silício para um manipulador estereotáxica. Traga a sonda de silicone acima a craniotomia. Dane-se o titular de conector de sonda de silicone na cabeça-placa.</li>
	<li>Ligar os eléctrodos de terra/referência e amplificador de gravação. Escudo do mouse com folha de alumínio para proteger de ruído eletromagnético. Iniciar o sistema de gravação para monitorar a atividade elétrica do cérebro.</li>
	<li>, Lentamente, introduzir a sonda de silicone no cérebro usando o micromanipulador. Verificar continuamente os sinais elétricos, a distância de manipulador viajado e os desvios da sonda (certifique-se que penetram no cérebro). Actividade da unidade é visível no córtex enquanto matéria branca por baixo é relativamente silenciosa. Actividade da unidade reaparece quando as canelas de tocar a camada piramidal do hipocampo. A partir deste ponto, retrair o silício sonda 200 µm (usar o micro-drive no dia seguinte para trazer a haste de volta para a camada piramidal).</li>
	<li>Cobrir a superfície do cérebro com uma mistura de cera para osso e óleo mineral.</li>
	<li>Consertar o micro-drive para a placa de cabeça usando cimento dental. Deixe a cura do cimento dental por 15 min. Então desanexar o microcarro do manipulador estereotáxica e ponha a chapéu boina.</li>
	<li>Colocar o mouse de volta à sua jaula e dar uma injeção sub-cutâneo de ketaprofen 5 mg/kg. Verifique se há qualquer sinal de dor. Esta cirurgia é muito menos invasiva do que a primeira e ratos são normalmente ativos dentro de 45 min, depois eles acordar da anestesia. No entanto, deixe o mouse recuperar um dia inteiro, como a sonda de silicone precisa estabilizar no cérebro.</li>
</ol> 5. Gravação de <ol><li>instalar o mouse cabeça fixa na esteira. Remova o boné chapéu</li>
	<li>Ligar o amplificador de gravação e iniciar a gravação.</li>
	<li>No primeiro dia, usar o micro-drive para mover a sonda de silicone para a camada piramidal do hipocampo. Cada volta anti-horário do parafuso move o shanks 200 µm mais profundo. Ajustar a posição da haste lentamente (~ 20-50 µm de cada vez) até que apareçam ripple oscilações 13 e unidade atividade.</li>
	<li>Nos próximos dias, ajustar a posição da haste e esperar ~ 1 h antes da gravação da atividade hippocampal enquanto o mouse é executado no cinto. Para manter a qualidade de sinal boa gravação por vários dias, remover objectos duros e baixo teto do mouse &#39; gaiola s para minimizar a possibilidade do chapéu solavancos em superfícies duras.</li>
</ol> 6. Recuperando a sonda <ol><li>colocar o rato sob anestesia.</li>
	<li>Instalar o mouse no aparato estereotáxica, fixando a placa-de-cabeça. Remova o boné chapéu</li>
	<li>Trazer manipulator estereotáxica logo acima do micro-drive. Conserte o micro-drive para o manipulador. Desaperte o porta-conector da placa de cabeça. Remova o parafuso conectando a concha e o corpo do micro-drive.</li>
	<li>Sob a supervisão do microscópio binocular, lentamente levante a montagem de microunidade / silicon sonda com o manipulador estereotáxica, deixando a parte casca.</li>
	<li>Limpe a sonda de silicone com o dispositivo de limpeza.</li>
</ol>

<ol>
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Os autores não têm nada para divulgar.

Gravação crônica da atividade neuronal é fundamental para a compreensão de processos neurais como lugar hippocampal campos. Nossa abordagem para executar implantantation de sonda de silicone crônica se distingue de outros métodos7,18,19,20 pelo fato de que é relativamente simples recuperar o pacote do eletrodo em o final do experimento. Enquanto lugar de células são tipicamente estudadas em movimentando-se livremente as condições, o aparelho de esteira não apenas significativamente simplifica delineamento experimental e análise de dados, também permite que os pesquisadores escrutinar campo mecanismos em contextos mínimos durante muitas repetições de trajetórias estereotipadas de animais12. Também é muito mais simples de construir do que os sistemas de realidade virtual, pois só requer rodas 3D-impresso, sensores de movimento unidimensional e um microcontrolador.
Atividade de campo local estável pode ser gravada ao longo de muitos dias, um requisito importante para investigar a dinâmica de rede a longo prazo associada com a aprendizagem. Neste contexto, algumas questões devem ser consideradas. Em primeiro lugar, os processos de tecido cerebral degeneração e cicatriz formação ao redor as sondas de silicone podem se gerar variações a longo prazo nos padrões de atividade. Portanto, é importante para todos os procedimentos cirúrgicos ser feito cuidadosamente para causar o mínimo de danos para os tecidos do cérebro e vasos sanguíneos. Em segundo lugar, é relativamente difícil acompanhar células individuais ao longo de dias consecutivos, por causa de desvios de eletrodos no cérebro14. A este respeito, técnicas de imagem, tais como a microscopia de dois fotões e microendoscopia podem ser melhores adequado, como célula identidade pode ser traçada a partir da morfologia e configuração espacial das células21,22,23 . Elas também permitem um maior rendimento em termos de número de células gravadas e fornecer informações directas sobre célula gene expressões24. No entanto, técnicas de imagem são bastante invasivas quando regiões profundas do cérebro estão preocupadas e não é possível resolver potenciais de ação única, como dependem principalmente sinais de cálcio. Portanto, uma solução ideal para estudos longitudinais seria combinar abordagens tanto ópticas e eletrofisiológicas.
Finalmente, é interessante notar que o conjunto de técnicas que descrevemos pode ser facilmente adaptável para outros tipos de eletrodo, incluindo Neuropixels (https://www.janelia.org/lab/harris-lab-apig) e optrodes11,25 , 26e pode ser usado em uma variedade de modelos experimentais diferentes células do hipocampo do lugar. Com o rápido progresso na tecnologia de impressão 3D, a melhoria e a personalização de dispositivos de gravação e comportamentais mais devem tornar-se mais simples e acessível para os laboratórios.

Sondas de silicone apresentam diversas vantagens para gravações eletrofisiológicas, incluindo o fato de que eles são projetados com perfis afiadas, minimizando danos nos tecidos e que apresentam um layout preciso de densamente gravação sites1, 2,3,4. Eles são usados para estudar vários sistemas em diferentes espécies, incluindo5,seres humanos3,6, com diversas abordagens1,7. Ainda, seu uso recorrente é ainda relativamente limitado por causa de seu custo, fragilidade e o fato de que métodos convenientes para experimentos crônicos faltam8. Recentes avanços na tecnologia de impressão 3D tornaram possível o projeto personalizado de dispositivos como unidades de micro e cabeça-placas para permitir uma manipulação mais fácil desses eletrodos delicados. Em uma primeira etapa, descreveremos como construir e usar um conjunto de ferramentas que desenvolvemos para a implantação de silicone crônica sondas14.
Enquanto lugar de células são tipicamente estudadas usando animais movimentando-se livremente, correr em labirintos, recentemente eles foram também investigados em ambientes virtuais15 e na esteira apparatii9 (figura 1A). Estes métodos experimentais oferecem a vantagem de que os animais podem ser cabeça-imobilizados, fazendo o uso de microscópio 2-fóton15, remendo-braçadeira16e optrode9,10,11 técnicas mais fácil, além de proporcionar maior controle sobre comportamento animal e pistas ambientais12. Em uma segunda etapa, apresentaremos os procedimentos para a formação de ratos e atividade de célula de lugar de gravação em um aparelho de esteira.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Silicon Probe</td>
			<td>Neuronexus</td>
			<td>Buzsabi32</td>
			<td>Recording electrode</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recording system</td>
			<td>Intantech</td>
			<td>RHD2132/RHD2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3D printer</td>
			<td>Asiga</td>
			<td>Pico Plus 27</td>
			<td>High resolution printer for micro-drive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3D printer</td>
			<td>Stratasys</td>
			<td>Mojo</td>
			<td>Lower resolution printer for hat components</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereotaxic apparatus</td>
			<td>Kopf</td>
			<td>Model 963</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Binocular microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>M60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Treadmill apparatus</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>We build them</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

implantation of chronic silicon probes and recording of hippocampal place cells in an enriched treadmill apparatus

Um requisito importante para a compreensão do funcionamento do cérebro é a identificação do comportamento e atividade das células correlaciona. Sondas de silicone são avançadas eletrodos para gravação eletrofisiológico em larga escala da atividade neuronal, mas os procedimentos para sua implantação crônica são ainda subdesenvolvidos. A atividade das células do hipocampo lugar chama-se correlacionar com a posição do animal no ambiente, mas os mecanismos subjacentes não são ainda claras. Para investigar o lugar células, aqui descrevemos um conjunto de técnicas que vão desde a fabricação de dispositivos para sonda de silicone crônica de implantes para o monitoramento da atividade de campo lugar em um aparelho de esteira cue-enriquecido. Uma unidade de microe um chapéu são construídos por encaixe e fixação juntos as peças de plástico 3D-impresso. Uma sonda de silicone é montada na unidade micro, limpos e revestida com corante. Uma primeira cirurgia é realizada para corrigir o chapéu no crânio de um rato. Pequenos pontos de referência são fabricados e anexados ao cinto de uma escada rolante. O mouse é treinado para executar cabeça-fixo na esteira. Uma segunda cirurgia é realizada para implantar a sonda de silicone no hipocampo, que banda larga sinais eletrofisiológicos são registrados a seguir. Finalmente, a sonda de silicone é recuperada e limpo para reutilização. A análise da atividade das células lugar na esteira revela uma diversidade de mecanismos de campo, o benefício da abordagem de estrutura de tópicos.

Um rato primeiro foi treinado para ser executado em uma correia longa de dois metros desprovido de tacos (Figura 1). Pós-implante de eletrodo, uma nova correia do mesmo comprimento, mas apresentando 3 pares de sugestões foi instalado na esteira, a fim de gerar representações espaciais de allocentric12,14. Sinais de banda larga foram registrados a uma taxa de amostragem de 30.000 Hz, usando um sistema de 250 canais de gravação (placa de amplificador com placa de interface USB e interface de Labview Custom-Made) e duas sondas de silicone (figura 1A, 4 patas, 8 sites por shanks) implantadas em CA1 e CA3 (figura 1B). As unidades foram detectadas utilizando uma função de limiar, os sinais de filtrado passa-alta (0,8-5 kHz). Isolamento de célula foi realizado usando um pico semi-automática classificação método15,16,17. O movimento para diante/para trás da esteira foi monitorizado usando LED e foto-sensor casais e gravada por canais de entrada Digitas do sistema de gravação.
Uma média de células 148±35 (mean±s.e.m) pode ser isolada em cada sessão, entre os quais 38.4±3.5% apresentaram atividade de campo claro lugar (Figura 2). Os campos do lugar eram relativamente estáveis em muitos ensaios, em qualquer o dia inicial da gravação (Figura 2A) ou após vários dias de exposição ao cinto marcado (Figura 2B e Figura 2). Diferentes tipos de representação espacial podem ser discernidos. Algumas células mostraram repetidas lugar campos correlacionados com a identidade do sinais (Figura 2A), enquanto outras células mostraram um lugar único de campo (Figura 2)12. Daí, podemos gravar células hippocampal lugar durante vários dias e identificar uma diversidade de mecanismos de campo, dois requisitos importantes para estudar os mecanismos e dinâmicas associadas a memória, aprendizagem e navegação espacial.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56438/56438fig1.jpg"> 
Figura 1: aparelho de sonda e esteira de silicone. (A) layout de Shank e site da sonda de silicone. (B) local de implantação. (C) aparelhos de esteira e layout das indicações sobre o cinto. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56438/56438fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56438/56438fig2v2.jpg"> 
Figura 2: gravação crônica das células local. (A) cor codificada representação dos campos de lugar (em cima), spike auto-correlogram (inferior esquerdo) e spike formas de onda (canto inferior direito) para um exemplo de célula gravada no dia 1. (B-C) Mesmo que (A) para exemplos de células gravado no dia 3 (B) e 5 (C). <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56438/56438fig2v2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Implantation of Chronic Silicon Probes and Recording of Hippocampal Place Cells in an Enriched Treadmill Apparatus

Descrevemos as medidas diversas para implante de silicone crônica sondas e gravar lugar células em ratos que são cabeça running-fixo em um aparelho de esteira cue-enriquecido.

Implantação de sondas de silicone crônica e gravação de lugar Hippocampal células em um aparelho de esteira enriquecido

An important requisite for understanding brain function is the identification of behavior and cell activity correlates. Silicon probes are advanced ...

implantation-chronic-silicon-probes-recording-hippocampal-place-cells

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

12.6K visualizações.  Korea Institute of Science and Technology. Descrevemos as medidas diversas para implante de silicone crônica sondas e gravar lugar células em ratos que são cabeça running-fixo em um aparelho de esteira cue-enriquecido.

Vídeo: Implantation of Chronic Silicon Probes and Recording of Hippocampal Place Cells in an Enriched Treadmill Apparatus

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding fundamental biological mechanisms. Striking progress has been particularly evident in Drosophila, whose extensive toolkit of mutants and transgenic lines provides a convenient model to study evolutionarily-conserved developmental and cell biological mechanisms. We are interested in understanding the mechanisms that control cell fate specification in the adult peripheral nervous system (PNS) in Drosophila. Bristles that cover the head, thorax, abdomen, legs and wings of the adult fly are individual mechanosensory organs, and have been studied as a model system for understanding mechanisms of Notch-dependent cell fate decisions. Sensory organ precursor (SOP) cells of the microchaetes (or small bristles), are distributed throughout the epithelium of the pupal thorax, and are specified during the first 12 hours after the onset of pupariation. After specification, the SOP cells begin to divide, segregating the cell fate determinant Numb to one daughter cell during mitosis. Numb functions as a cell-autonomous inhibitor of the Notch signaling pathway.
Here, we show a method to follow protein dynamics in SOP cell and its progeny within the intact pupal thorax using a combination of tissue-specific Gal4 drivers and GFP-tagged fusion proteins 1,2.This technique has the advantage over fixed tissue or cultured explants because it allows us to follow the entire development of an organ from specification of the neural precursor to growth and terminal differentiation of the organ. We can therefore directly correlate changes in cell behavior to changes in terminal differentiation. Moreover, we can combine the live imaging technique with mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) system to assess the dynamics of tagged proteins in mitotic SOPs under mutant or wildtype conditions. Using this technique, we and others have revealed novel insights into regulation of asymmetric cell division and the control of Notch signaling activation in SOP cells (examples include references 1-6,7 ,8).

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

In this video, we describe a method for live cell imaging of asymmetrically dividing sensory organ progenitor cells and epidermal cells in intact Drosophila pupae

Em células vivas, imagens de células precursoras de órgãos sensoriais na Intact Drosophila As pupas

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding ...

Neurociência

Recording Large-scale Neuronal Ensembles with Silicon Probes in the Anesthetized Rat

Large scale electrophysiological recordings from neuronal ensembles offer the opportunity to investigate how the brain orchestrates the wide variety of behaviors from the spiking activity of its neurons. One of the most effective methods to monitor spiking activity from a large number of neurons in multiple local neuronal circuits simultaneously is by using silicon electrode arrays1-3.
Action potentials produce large transmembrane voltage changes in the vicinity of cell somata. These output signals can be measured by placing a conductor in close proximity of a neuron. If there are many active (spiking) neurons in the vicinity of the tip, the electrode records combined signal from all of them, where contribution of a single neuron is weighted by its 'electrical distance'. Silicon probes are ideal recording electrodes to monitor multiple neurons because of a large number of recording sites (+64) and a small volume. Furthermore, multiple sites can be arranged over a distance of millimeters, thus allowing for the simultaneous recordings of neuronal activity in the various cortical layers or in multiple cortical columns (Fig. 1). Importantly, the geometrically precise distribution of the recording sites also allows for the determination of the spatial relationship of the isolated single neurons4. Here, we describe an acute, large-scale neuronal recording from the left and right forelimb somatosensory cortex simultaneously in an anesthetized rat with silicon probes (Fig. 2).

Extracellular recordings of neuronal activity using silicon probes in the anesthetized rat will be described. This technique allows information to be obtained across multiple brain areas from more than 100 neurons simultaneously. It provides information with single cell resolution about neuronal ensembles dynamics in multiple local circuits.

Gravação em grande escala Ensembles Neuronal com Sondas Silício na rato anestesiado

Large scale electrophysiological recordings from neuronal ensembles offer the opportunity to investigate how the brain orchestrates the wide variety of ...

Surgical Implantation of Chronic Neural Electrodes for Recording Single Unit Activity and Electrocorticographic Signals

The success of long-term electrophysiological recordings often depends on the quality of the implantation surgery. Here we provide useful information for surgeons who are learning the process of implanting electrode systems. We demonstrate the implantation procedure of both a penetrating and a surface electrode. The surgical process is described from start to finish, including detailed descriptions of each step throughout the procedure. It should also be noted that this video guide is focused towards procedures conducted in rodent models and other small animal models. Modifications of the described procedures are feasible for other animal models.

We provide useful information for surgeons who are learning the process of implanting chronic neural recording electrodes. Techniques for both penetrating and surface electrode systems are described in a rodent animal model.

Implante cirúrgico de crônicas Eletrodos Neurais para registrar a atividade única Unidade e Sinais eletrocorticográfica

The success of long-term electrophysiological recordings often depends on the quality of the implantation surgery.  Here we provide useful information for ...

Large-scale Recording of Neurons by Movable Silicon Probes in Behaving Rodents

A major challenge in neuroscience is linking behavior to the collective activity of neural assemblies. Understanding of input-output relationships of neurons and circuits requires methods with the spatial selectivity and temporal resolution appropriate for mechanistic analysis of neural ensembles in the behaving animal, i.e. recording of representatively large samples of isolated single neurons. Ensemble monitoring of neuronal activity has progressed remarkably in the past decade in both small and large-brained animals, including human subjects1-11. Multiple-site recording with silicon-based devices are particularly effective because of their scalability, small volume and geometric design.
Here, we describe methods for recording multiple single neurons and local field potential in behaving rodents, using commercially available micro-machined silicon probes with custom-made accessory components. There are two basic options for interfacing silicon probes to preamplifiers: printed circuit boards and flexible cables. Probe supplying companies (<a href="http://www.neuronexustech.com/" >http://www.neuronexustech.com/</a>; <a href="http://www.sbmicrosystems.com/">http://www.sbmicrosystems.com/</a>; <a href="http://www.acreo.se/">http://www.acreo.se/</a>) usually provide the bonding service and deliver probes bonded to printed circuit boards or flexible cables. Here, we describe the implantation of a 4-shank, 32-site probe attached to flexible polyimide cable, and mounted on a movable microdrive. Each step of the probe preparation, microdrive construction and surgery is illustrated so that the end user can easily replicate the process.

We describe methods for large-scale recording of multiple single units and local field potential in behaving rodents with silicon probes. Drive fabrication, probe attachment to the drive and probe implantation processes are illustrated in sufficient details for easy replication.

Em larga escala de gravação de Neurônios por sondas de silicone móveis em Comportando Roedores

A major challenge in neuroscience is linking behavior to the collective activity of neural assemblies. Understanding of input-output relationships of ...

Design and Assembly of an Ultra-light Motorized Microdrive for Chronic Neural Recordings in Small Animals

The ability to chronically record from populations of neurons in freely behaving animals has proven an invaluable tool for dissecting the function of neural circuits underlying a variety of natural behaviors, including navigation1 , decision making 2,3, and the generation of complex motor sequences4,5,6. Advances in precision machining has allowed for the fabrication of light-weight devices suitable for chronic recordings in small animals, such as mice and songbirds. The ability to adjust the electrode position with small remotely controlled motors has further increased the recording yield in various behavioral contexts by reducing animal handling.6,7
 Here we describe a protocol to build an ultra-light motorized microdrive for long-term chronic recordings in small animals. Our design evolved from an earlier published version7, and has been adapted for ease-of use and cost-effectiveness to be more practical and accessible to a wide array of researchers. This proven design 8,9,10,11 allows for fine, remote positioning of electrodes over a range of ~ 5 mm and weighs less than 750 mg when fully assembled. We present the complete protocol for how to build and assemble these drives, including 3D CAD drawings for all custom microdrive components.

The design, fabrication and assembly of an ultra-light motorized microdrive is described. The device provides a cost-effective and easy-to-use solution for chronic recordings of single units in small behaving animals.

Concepção e montagem de um Microdrive Ultra-leve motorizada para doenças crônicas Recordings Neurais em Pequenos Animais

The ability to chronically record from populations of neurons in freely behaving animals has proven an invaluable tool for dissecting the function of ...

Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs through activation of their ion channels and neurotransmitter receptors, and process information in part through activity-dependent release of gliotransmitters. Furthermore, astrocytes constitute the main uptake system for glutamate, contribute to potassium spatial buffering, as well as to GABA clearance. These cells therefore constantly monitor synaptic activity, and are thereby sensitive indicators for alterations in synaptically-released glutamate, GABA and extracellular potassium levels. Additionally, alterations in astroglial uptake activity or buffering capacity can have severe effects on neuronal functions, and might be overlooked when characterizing physiopathological situations or knockout mice. Dual recording of neuronal and astroglial activities is therefore an important method to study alterations in synaptic strength associated to concomitant changes in astroglial uptake and buffering capacities. Here we describe how to prepare hippocampal slices, how to identify stratum radiatum astrocytes, and how to record simultaneously neuronal and astroglial electrophysiological responses. Furthermore, we describe how to isolate pharmacologically the synaptically-evoked astroglial currents.

The preparation of acute brain slices from isolated hippocampi, as well as the simultaneous electrophysiological recordings of astrocytes and neurons in stratum radiatum during stimulation of schaffer collaterals is described. The pharmacological isolation of astroglial potassium and glutamate transporter currents is demonstrated.

Dois registros eletrofisiológicos de sinapticamente evocadas Respostas astroglial e neuronal em fatias hipocampais agudas

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

Fiber-optic Implantation for Chronic Optogenetic Stimulation of Brain Tissue

Elucidating patterns of neuronal connectivity has been a challenge for both clinical and basic neuroscience. Electrophysiology has been the gold standard for analyzing patterns of synaptic connectivity, but paired electrophysiological recordings can be both cumbersome and experimentally limiting. The development of optogenetics has introduced an elegant method to stimulate neurons and circuits, both in vitro1 and in vivo2,3. By exploiting cell-type specific promoter activity to drive opsin expression in discrete neuronal populations, one can precisely stimulate genetically defined neuronal subtypes in distinct circuits4-6. Well described methods to stimulate neurons, including electrical stimulation and/or pharmacological manipulations, are often cell-type indiscriminate, invasive, and can damage surrounding tissues. These limitations could alter normal synaptic function and/or circuit behavior. In addition, due to the nature of the manipulation, the current methods are often acute and terminal. Optogenetics affords the ability to stimulate neurons in a relatively innocuous manner, and in genetically targeted neurons. The majority of studies involving in vivo optogenetics currently use a optical fiber guided through an implanted cannula6,7; however, limitations of this method include damaged brain tissue with repeated insertion of an optical fiber, and potential breakage of the fiber inside the cannula. Given the burgeoning field of optogenetics, a more reliable method of chronic stimulation is necessary to facilitate long-term studies with minimal collateral tissue damage. Here we provide our modified protocol as a video article to complement the method effectively and elegantly described in Sparta et al.8 for the fabrication of a fiber optic implant and its permanent fixation onto the cranium of anesthetized mice, as well as the assembly of the fiber optic coupler connecting the implant to a light source. The implant, connected with optical fibers to a solid-state laser, allows for an efficient method to chronically photostimulate functional neuronal circuitry with less tissue damage9 using small, detachable, tethers. Permanent fixation of the fiber optic implants provides consistent, long-term in vivo optogenetic studies of neuronal circuits in awake, behaving mice10 with minimal tissue damage.

The development of optogenetics now provides the means to precisely stimulate genetically defined neurons and circuits, both in vitro and in vivo. Here we describe the assembly and implantation of a fiber optic for chronic photostimulation of brain tissue.

Implantação de fibra óptica para Estimulação Crônica optogenética do Tecido Cerebral

Elucidating patterns of neuronal connectivity has been a challenge for both clinical and basic neuroscience. Electrophysiology has been the gold standard ...

Electrophysiological Method for Recording Intracellular Voltage Responses of Drosophila Photoreceptors and Interneurons to Light Stimuli In Vivo

Voltage responses of insect photoreceptors and visual interneurons can be accurately recorded with conventional sharp microelectrodes. The method described here enables the investigator to measure long-lasting (from minutes to hours) high-quality intracellular responses from single Drosophila R1-R6 photoreceptors and Large Monopolar Cells (LMCs) to light stimuli. Because the recording system has low noise, it can be used to study variability among individual cells in the fly eye, and how their outputs reflect the physical properties of the visual environment. We outline all key steps in performing this technique. The basic steps in constructing an appropriate electrophysiology set-up for recording, such as design and selection of the experimental equipment are described. We also explain how to prepare for recording by making appropriate (sharp) recording and (blunt) reference electrodes. Details are given on how to fix an intact fly in a bespoke fly-holder, prepare a small window in its eye and insert a recording electrode through this hole with minimal damage. We explain how to localize the center of a cell's receptive field, dark- or light-adapt the studied cell, and to record its voltage responses to dynamic light stimuli. Finally, we describe the criteria for stable normal recordings, show characteristic high-quality voltage responses of individual cells to different light stimuli, and briefly define how to quantify their signaling performance. Many aspects of the method are technically challenging and require practice and patience to master. But once learned and optimized for the investigator's experimental objectives, it grants outstanding in vivo neurophysiological data.

Electrophysiological Method for Recording Intracellular Voltage Responses of Drosophila Photoreceptors and Interneurons to Light Stimuli In Vivo

Sharp microelectrodes enable accurate electrophysiological characterization of photoreceptor and visual interneuron output in living Drosophila. Here we show how to use this method to record high-quality voltage responses of individual cells to controlled light stimulation. This method is ideal for studying neural information processing in insect compound eyes.

Método eletrofisiológico para respostas gravação intracelular de tensão<em&gt; Drosophila</em&gt; Fotorreceptores e Interneurônios à luz Estímulos<em&gt; In Vivo</em

Voltage responses of insect photoreceptors and visual interneurons can be accurately recorded with conventional sharp microelectrodes. The method ...

Quantification of Endosome and Lysosome Motilities in Cultured Neurons Using Fluorescent Probes

In the brain, membrane trafficking systems play important roles in regulating neuronal functions, such as neuronal morphology, synaptic plasticity, survival, and glial communications. To date, numerous studies have reported that defects in these systems cause various neuronal diseases. Thus, understanding the mechanisms underlying vesicle dynamics may provide influential clues that could aid in the treatment of several neuronal disorders. Here, we describe a method for quantifying vesicle motilities, such as motility distance and rate of movement, using a software plug-in for the ImageJ platform. To obtain images for quantification, we labeled neuronal endosome-lysosome structures with EGFP-tagged vesicle marker proteins and observed the movement of vesicles using a time-lapse microscopy. This method is highly useful and simplify measuring vesicle motility in neurites, such as axons and dendrites, as well as in the soma of both neurons and glial cells. Furthermore, this method can be applied to other cell lines, such as fibroblasts and endothelial cells. This approach could provide a valuable advancement of our understanding of membrane trafficking.

The investigation of membrane trafficking is crucial for understanding neuronal functions. Here, we introduce a method for quantifying vesicle motility in neurons. This is a convenient method that can be adapted to the quantification of membrane trafficking in the nervous system.

Quantificação de Endosome e Moosidades de Lisosoma em Neurônios Cultivados Usando Sondas Fluorescentes

In the brain, membrane trafficking systems play important roles in regulating neuronal functions, such as neuronal morphology, synaptic plasticity, ...

Chronic Transcranial Electrical Stimulation and Intracortical Recording in Rats

Transcranial electrical stimulation (TES) is a powerful and relatively simple approach to diffusely influence brain activity either randomly or in a closed-loop event-triggered manner. Although many studies are focusing on the possible benefits and side-effects of TES in healthy and pathologic brains, there are still many fundamental open questions regarding the mechanism of action of the stimulation. Therefore, there is a clear need for a robust and reproducible method to test the acute and the chronic effects of TES in rodents. TES can be combined with regular behavioral, electrophysiological, and imaging techniques to investigate neuronal networks in vivo. The implantation of transcranial stimulation electrodes does not impose extra constraints on the experimental design while it offers a versatile, flexible tool to manipulate brain activity. Here we provide a detailed, step-by-step protocol to fabricate and implant transcranial stimulation electrodes to influence brain activity in a temporally constrained manner for months.

This detailed protocol describes transcranial stimulation electrode placement on the temporal bone in order to investigate the short- and long-term effects of transcranial electrical stimulation in freely moving rats.

Estimulação elétrica transcraniana crônica e gravação Intracortical em ratos

Transcranial electrical stimulation (TES) is a powerful and relatively simple approach to diffusely influence brain activity either randomly or in a ...