이 작품은 한국 과학 연구소 및 기술 기관 프로그램 (프로젝트 번호 2E26190 및 2E26170) 및 인간 프론티어 과학 프로그램 (RGY0089/2012)에 의해 지원 되었다.

설명 하는 모든 방법을 동물 관리 및 사용 위원회 한국 과학 및 기술에 의해 승인 되었습니다.
 1. 마이크로 드라이브와 전극 준비 <ol><li>마이크로 드라이브를 조립.
	<ol><li>(슬라이더, 몸, 및 셸) 마이크로 드라이브의 부분을 인쇄 14 고해상도 3D 프린터를 사용 하 여. 부품 아무 결함을가지고 있는지 확인 하십시오.</li>
		<li>나사 (000-120 x 1/4 크기)와 마이크로 드라이브 몸으로 슬라이더를 수정.</li>
		<li>너트 솔더 (000-120 000-120/64 16 진수 크기)는 스크류의 끝에.</li>
		<li>나사를 시계 방향으로 슬라이더를 위로 또는 아래로 이동 하려면 시계 반대 방향으로 이동.</li>
		<li>나사 (000-120 x 1/4 크기)와 신체에 셸을 수정.</li>
	</ol></li> <li>마이크로 드라이브에 프로브를 장착.
	<ol><li>쌍 안 현미경 수평 위치에 있는 마이크로 드라이브를 수정.</li>
		<li>고무 패딩 플랫 악어 클립을 사용 하 여 신중 하 게 집게와 선적 인클로저에서 프로브를 분리 하는 동안 실리콘 프로브의 플렉스 케이블을 잡아. 조작자에 악어 클립을 수정.</li>
		<li>운동의 방향에 마이크로 드라이브 슬라이더에 실리콘 프로브를 평행 하다, 조작자를 사용 하 여.</li>
		<li>적용 치과 시멘트의 드롭 (실 온 경화 아크릴 치과 자료 복구) 프로브 슬라이더를 해결 하기 위해. 그것은 이동 하는 경우 프로브 위치를 수정 합니다. 접착제는 권장 하지 않습니다 그것은 매우 빠르게 치료 및 전극 위치 조정 하기가 어렵습니다.</li>
		<li>치과 시멘트와 프로브를 C-홀더 (홀더 커넥터)의 커넥터 수정.</li>
	</ol></li> <li>클리닝 하 고 염료는 프로브에.
	<ol><li>수정 마이크로 드라이브/프로브 프로브 청소 장치에 조립. 장치는 2 작은 회전 거품 스폰지 (비 멸 균 면봉)을 갖추고 있습니다. 조작자 간격 조정.</li>
		<li>세제와 스폰지를 적시 게.</li>
		<li>는 서서히 부드러운 터치 수 있도록 스폰지 사이 여기저기에 프로브를 이동 합니다. 현미경으로 청소 과정 모니터링.</li>
		<li>는 증류수로 프로브 린스. 살 균에 대 한 알코올에 프로브를 찍어.</li>
		<li>적용 Dil (닥터지 형광 염료) 프로브, 정강이의 뒤에 거품 면봉을 사용 하 여. 이것은 두뇌에서 생크 위치 시각화 나중 단계에서 수.</li>
	</ol></li> <li>조립 모자 <ol><li>모자 (머리 판, 커넥터 홀더, 및 모자)의 부분을 인쇄 14 3D 프린터를 사용 하 여. 3 부품 밀봉 된 인클로저를 형성 하기 위하여 맞는.</li>
		<li>머리 판 및 접착제와 치과 시멘트 수정의 슬롯에 삽입 너트 (m 2와 00-90 시-90/4 크기).</li>
		<li>세탁기 뚜껑의 슬롯에 삽입 하 고 치과 시멘트로 수정.</li>
	</ol></li></ol> 2. 두개골에 모자의 고정을 위한 수술 수술에 사용 되는 모든 도구는 압력가 마로 소독 하 여 미리 살 균 된다. 건조 열 구슬 장치는 forto 오염 되 고 수술 하는 동안 소독 하는 데 필요한 도구를 소독.
<ol><li>마 취의 개시에 대 한 4 %isoflurane 수준을 설정합니다. 5 분에 대 한 마 취 약 실에 있는 마우스를 넣어</li>
	<li>Stereotaxic 장치에 마우스를 설치.</li>
	<li>는 1.5-2 %isoflurane 수준을 줄일. 동물 상태, 호흡 속도 따라 수술 하는 동안 레벨을 조정 하 고 몸 온도 20.</li>
	<li>눈에 눈 연 고를 적용.</li>
	<li>두 피를 면도 하 고 살 균 (iodopovidone)와 동물의 머리를 청소. 수술의 모든 단계 동안 무 균 상태를 유지.</li>
	<li>두 피 아래 넣기 bupivacaine (1 mg/kg). 잘라 고 좋은 위를 사용 하 여 그것의 가장자리에 두개골을 폭로 하는 마우스 머리의 정수 리 스킨의 일부를 제거 합니다. 염 분 및 hemostatic 스폰지를 사용 하 여 청소 하 고는 수술 중 출혈 제어.</li>
	<li>긁는 도구 도구를 사용 하 여과 제거.</li>
	<li>두개골 21에 참조 점의 찾을: bregma, 람다, 코로나와 화살 봉합. 머리를 조정 &#39; 되도록 Bregma 점과 람다 같은 높이에서 s 화살 축 각도.</li>
	<li>참조 및 접지 전극에 대 한 두개골에 두 개의 구멍 (~0.5 m m 직경) 드릴. 구멍 해야 약 1 m m 꼬리 람다의 1 m m 옆.</li>
	<li>지상 및 기준 전극 (크기 000-120 000-120/16 미니어처 스테인리스 나사 와이어-핀 커넥터 결합) 삽입.</li>
	<li>적용 자외선 (UV) 두개골에 상 아질 활성기를 결합 한 다음 자외선 45-60 미에 대 한 적용</li>
	<li>는 두개골의 가장자리에 치과 시멘트의 레이어를 적용. 피부와 쥐의 머리에 시멘트를 확산 방지.</li>
	<li>Stereotaxic 조작에 머리 판을 해결 하 고 두개골 위에 위치. 천천히 머리 판 두개골, 약간 접촉 될 때까지 낮은 고 치과 시멘트와 두개골 접합에 적용 합니다. 15 분을 위한 치과 시멘트 치료 하자</li>
	<li>마 취를 제거합니다. 커넥터-보유자와 머리 판에 캡 수정. Ketaprofen의 하위 피부 주입을 주기 후에 그것의 감 금에서 마우스를 넣어 5 mg/kg.</li>
	<li>줄 ketaprofen의 하위 피부 주사 두 일을 신중 하 게 고통의 어떤 표시 든 지에 대 한 모니터에 대 한 5 mg/kg. 마우스는 일반적으로 20-40 분 이내 마 취에서 깨어나. 임 플 란 트 모자는 상대적으로 같은 마우스 아무 문제가 그들의 머리를 리프트 하 고, 미로에서 실행 하 고 등반을 그들의 집에 감 금 소의 가장자리에 빛 (3.34 g).</li>
</ol> 3. 행동 훈련 <ol><li>7 일 수술 후 회복 기간, 후 일 당 1 mL에 물 제한 시작.</li>
	<li>디딜 방 아 벨트를 만들기 위해 벨벳 직물 (1-2 m 5 c m)의 조각을 잘라 하 고 뜨거운 접착제를 사용 하 여 그것에 작은 물체를 수정. 마우스의 움직임을 방해 하기 위하여 벨트의 가장자리에 지어진된 개체 연결.</li>
	<li>함께 두 끝을 봉합 하 여 디딜 방 아의 바퀴에 벨트를 해결.</li>
	<li>머리 고정 플레이트의 슬롯에 머리 판의 2 개의 나사를 조여 여 디딜 방 아에 머리 고정 마우스 설치.</li>
	<li>머리 억제 물 보상에 대 한 디딜 방 아에 실행 하려면 마우스를 훈련 하는 시작. 핥 아 포트를 통해 물 보상을 제공 합니다. 처음 10 분, 하루에 3 번의 기간에 대 한 디딜 방 아 마우스를 입었다.</li>
	<li>마우스 머리 고정에 사용 되 면 (일반적으로 3 일 후), 벨트를 이동 하려면 시작으로 증가 훈련 세션 지속 시간 30 분을. 2-3 주 후, 일부 마우스 30 분 (벨트의 전체 회전 되는 재판)에 100 개 이상의 실험을 실행.</li>
	<li>행동 기록 실험에 대 한 최고의 공연을 보여주는 마우스 선택.</li>
</ol> 4. 프로브 실리콘의 주입 <ol><li>넣어 마 취 마우스.</li>
	<li>머리-플레이트를 고정 하 여 stereotaxic 장치에 마우스를 설치 합니다. 식 염 수로 두개골 표면 청소.</li>
	<li>찾을 stereotaxic 마커: bregma, 람다, 코로나와 화살 봉합. 삽입 지점에 거리를 측정 하 고 표시 합니다.</li>
	<li>얇고 투명 하 게 될 때까지 신중 하 게 뼈를 드릴. 축 축 하 고 시추 하는 동안 염 분 깨끗.</li>
	<li>남았다 뼈 및 정밀 힘을 사용 하 여 경질 문제를 신중 하 게 제거ps. 뇌 표면 염 분으로 항상 젖은 유지.</li>
	<li>Stereotaxic 조작에 마이크로 드라이브/실리콘 프로브 조립 수정. 바로 위에 craniotomy 실리콘 프로브를가지고. 나사 머리 접시에 실리콘 프로브 커넥터 홀더.</li>
	<li>녹음 앰프 및 접지/참조 전극 연결합니다. 방패 전자기 잡음 으로부터 보호 하기 위해 알루미늄 호 일로 마우스. 뇌의 전기 활동을 기록 시스템 시작.</li>
	<li>천천히는 micromanipulator를 사용 하 여 뇌에 실리콘 프로브를 삽입 합니다. 지속적으로 전기 신호, 조작 여행 거리 및 프로브의 정강이 확인 (그들은 두뇌에 있는 침투는 확인). 단위 활동 아래 백색 질은 상대적으로 침묵 하는 동안 대뇌 피 질에 표시 됩니다. 단위 활동에는 정강이 해 마의 피라미드 계층을 만질 때 다시 나타납니다. 이 시점에서 철회 실리콘 프로브 200 µ m (마이크로 드라이브를 다음날 사용 피라미드 계층에 다시 칼을가지고).</li>
	<li>뼈 왁 스, 미네랄 오일의 혼합물으로 뇌의 표면을 커버.</li>
	<li>치과 시멘트를 사용 하 여 머리 판에 마이크로 드라이브를 수정 합니다. 15 분 동안 치과 시멘트 치료 하자. 다음 stereotaxic 조작에서 마이크로 드라이브를 분리 하 고 다시 넣어 모자 모자.</li>
	<li>마우스 다시는 새 장에 넣고 ketaprofen의 하위 피부 주사를 주고 5 mg/kg. 고통의 어떤 표시 든 지를 확인 합니다. 이 수술은 첫 번째 보다 훨씬 덜 침략 그리고 마우스는 일반적으로 45 분 이내 활성 후 그들은 웨이크 업 마 취에서. 그러나, 마우스 실리콘 프로브 두뇌에 안정 하기 때문에 하루 종일 복구 하자.</li>
</ol> 5. 녹음 <ol><li>설치 마우스 머리 고정 디딜 방 아에. 모자 뚜껑 제거</li>
	<li>녹음 앰프를 연결 하 고 녹음을 시작.</li>
	<li>첫 날,를 사용 하 여 마이크로 드라이브 실리콘 프로브는 해 마의 피라미드 계층으로 이동. 나사 각 시계 반대 방향으로 회전 정강이 200 µ m 깊이 이동합니다. 생크 위치를 천천히 조정 (20 ~ 50 한 번에 µ m) 리플 진동 13 및 단위 활동 나타날 때까지.</li>
	<li>다음 일에 칼 위치를 조정 하 고 마우스 벨트에서 실행 하는 동안 hippocampal 활동을 기록 하기 전에 ~ 1 h를 기다려. 몇 일 동안 좋은 녹음 신호 품질을 유지 하려면 하드 개체를 제거 하 고 마우스에서 천장 낮은 &#39; 모자 하드 표면에 충돌 하는 기회를 최소화 하기 위해 s 케이지.</li>
</ol> 6. 복구 조사 <ol><li>넣어 마 취 마우스.</li>
	<li>머리-플레이트를 고정 하 여 stereotaxic 장치에 마우스를 설치 합니다. 모자 뚜껑 제거</li>
	<li>가지고 바로 위에 마이크로 드라이브 stereotaxic 조작. 마이크로 드라이브는 조작자를 수정 합니다. 나사 머리 접시에서 커넥터 홀더. 껍질과 마이크로 드라이브의 연결 나사를 제거.</li>
	<li>셸 부분 쌍 안 현미경 감독, 천천히 올려 stereotaxic 조작자와 마이크로 드라이브/실리콘 프로브 조립 남겨두고.</li>
	<li>실리콘 프로브 청소 장치 청소.</li>
</ol>

<ol>
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저자는 공개 없다.

신경 활동의 만성 녹음은 hippocampal 장소 필드 같은 신경 과정을 이해 하는 데 중요 합니다. 만성 실리콘 프로브 implantantation를 수행 하는 접근 방식 그것은 상대적으로 간단에 전극 패키지를 복구 하는 사실에 의해 다른 방법7,18,,1920 에서 자체 구별 실험의 끝입니다. 장소 세포는 일반적으로 자유롭게 이동에서 공부 하는 동안 조건, 디딜 방 아 장치 하지만 크게 간소화 실험 설계 및 자료 분석, 그것은 또한 동안 최소한의 컨텍스트에서 장소 필드 메커니즘을 자세히 조사 하는 연구원 진부한 동물 궤도12의 많은 반복. 그것은 또한 훨씬 간단 하므로 3D 인쇄 바퀴, 1 차원 모션 센서와 마이크로컨트롤러 보다 가상 현실 시스템 구축.
안정적인 장소 필드 활동 많은 일 동안, 학습 관련 된 장기적인 네트워크 역학 조사에 대 한 중요 한 필수 기록 수 있습니다. 이 점에서 몇 가지 문제점을 고려해 야 합니다. 첫째, 실리콘 프로브 주위 뇌 조직 변성 및 흉터 형성의 프로세스 생성할 수 있습니다 스스로 장기 변화 활동 패턴에. 그러므로 신중 하 게 해야 할 뇌 조직에 손상을 최소화 하 고 혈관 혈액 모든 수술 절차에 대 한 중요 하다. 둘째, 뇌14전극 품으로 인해 연속 일 동안 개별 셀을 추적 하기 위해 상대적으로 어렵다. 이 점에서 적합 2 광자 현미경 및 마이크로-내 시경 더 좋을 수도 같은 기법을 이미징, 셀으로 정체성 셀21,22,23의 공간 구성과 형태에서 추적 될 수 있다 . 그들은 또한 허용 셀 수의 기간에 더 큰 수익률 기록 셀 유전자 식24에 대 한 직접적인 정보를 제공 합니다. 그러나, 깊은 두뇌 지구는 그들은 주로 칼슘 신호에 의존 한 활동 전위를 확인할 수 없는 때 이미징 기술을 매우 침략 적 있습니다. 따라서, 경도 연구에 대 한 최적 광학 및 electrophysiological 접근을 결합 수 있습니다.
마지막으로, 우리가 설명 하는 기술의 세트 전극, Neuropixels (https://www.janelia.org/lab/harris-lab-apig)와 optrodes11,25 를 포함 하 여 다른 유형의 쉽게 적응할 수 있습니다 지적 가치가 있다 , 26, hippocampal 장소 세포 이외의 실험 모델의 범위에 사용 될 수 있다. 3D 인쇄 기술의 빠른 진보와 함께 더욱 더 간단 하 고 실험실에 액세스할 수 추가 개선 및 녹음 및 행동 장치 사용자 지정 될 것입니다.

실리콘 프로브 electrophysiological 기록, 그들은 날카로운 프로필 조직 손상과 그들은 사이트1, 기록 밀도가 포장의 정확한 레이아웃을 제시를 최소화 설계 된 있다는 사실을 포함 하 여에 대 한 몇 가지 장점을 제시합니다 2,,34. 그들은 다른 종에서 인간3,,56, 다양 한 접근1,7을 포함 하 여 다양 한 시스템을 연구 하는 데 사용 됩니다. 그러나, 그들의 재발 사용은 그들의 비용, 취약성, 및 만성 실험을 위한 편리한 방법8부족 사실 때문에 여전히 상대적으로 제한 된. 3D 인쇄 기술의 최근 발전 장치 마이크로 드라이브 등이 섬세 한 전극의 쉽게 처리 수 있도록 헤드 플레이트의 사용자 지정 디자인을 가능한 만들었습니다. 첫 번째 단계에서 만성 실리콘 프로브14의 이식에 대 한 우리 개발 도구 집합을 사용 하는 방법을 설명 합니다.
장소 세포는 일반적으로 자유롭게 움직이는 동물 미로에서 실행을 사용 하 여 공부 하 고, 그러나 최근에 그들은 또한 조사 되었다 디딜 방 아 apparatii9 (그림 1A)와 가상 환경15 에서. 이러한 실험 방법은 그 동물 수 있을 머리-제 지, 2 광자 현미경15,16, 패치 클램프 및 optrode9,,1011 의 사용 하는 이점을 제공합니다 기술 쉽게, 동물 행동 및 환경 단서12향상 된 제어를 제공 하. 두 번째 단계에서 우리는 쥐 훈련과 디딜 방 아 장치에 장소 세포 활동을 기록 하는 절차를 발표할 예정 이다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Silicon Probe</td>
			<td>Neuronexus</td>
			<td>Buzsabi32</td>
			<td>Recording electrode</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recording system</td>
			<td>Intantech</td>
			<td>RHD2132/RHD2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3D printer</td>
			<td>Asiga</td>
			<td>Pico Plus 27</td>
			<td>High resolution printer for micro-drive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3D printer</td>
			<td>Stratasys</td>
			<td>Mojo</td>
			<td>Lower resolution printer for hat components</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereotaxic apparatus</td>
			<td>Kopf</td>
			<td>Model 963</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Binocular microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>M60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Treadmill apparatus</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>We build them</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

implantation of chronic silicon probes and recording of hippocampal place cells in an enriched treadmill apparatus

뇌 기능을 이해 하기 위한 중요 한 필요한 행동의 식별 이며 세포 활동 연결. 실리콘 감지기 전극 신경 활동의 대규모 electrophysiological 녹음에 대 한 고급 하지만 그들의 만성 이식에 대 한 절차는 아직도 저 개발. Hippocampal 장소 세포의 활동은 환경에서 동물의 위치와 상관 관계를 알려져 있지만 근본적인 메커니즘은 아직 명확 하지 않다. 장소 세포 조사, 여기 우리가 만성 실리콘 프로브에 대 한 장치의 제조 이르기까지 디딜 방 아 큐 농축 장치에 장소 필드 활동의 모니터링을 이식 하는 기술의 세트를 설명 합니다. 마이크로 드라이브와 모자 및 3D 인쇄 플라스틱 부품을 함께 고정 하 여 만들어집니다. 실리콘 프로브 마이크로 드라이브에 탑재, 청소, 이며 염료와 코팅. 첫 번째 수술에는 마우스의 두개골 모자를 해결 하기 위해 수행 됩니다. 작은 랜드마크 조작 하는 디딜 방 아의 벨트에 연결 된. 마우스 머리 고정을 실행 하는 훈련은 디딜 방 아에. 두 번째 수술은 이식 해 마, 어떤 광대역 electrophysiological 신호가 기록 됩니다 다음에 실리콘 프로브를 수행 됩니다. 마지막으로, 실리콘 프로브 회수 이며 재사용에 대 한 청소. 디딜 방 아에서 장소 세포 활동의 분석 다양을 한 접근의 혜택을 설명 하는 장소 필드 메커니즘을 보여준다.

마우스 처음 신호 (그림 1C) 없는 2 미터 긴 벨트에서 실행 하도록 훈련 되었다. 전극 이식, 동일한 길이의 새로운 벨트를 따라 하지만 3 쌍의 단서를 제시, 디딜 방 아에 allocentric 공간 표현12,14을 생성 하기 위해 설치 되었다. 광대역 신호 250 채널 녹화 시스템 (증폭기 보드 USB 인터페이스 보드 및 Labview 인터페이스 맞춤)를 사용 하 여 두 개의 실리콘 프로브 (그림 1A, 4 정강이, 정강이 당 8 사이트) 이식 30000 Hz의 샘플링 레이트에서 기록 되었다 CA1 및 CA3 (그림 1B). 단위가 패스 필터링 된 신호에 임계값 기능을 사용 하 여 검색 (0.8-5 kHz). 셀 격리 방법15,,1617정렬 자동 장전 식 스파이크를 사용 하 여 수행 되었다. 디딜 방 아의 앞 으로/뒤로 동작 LED를 사용 하 여 모니터링은 포토 센서 커플 하 고 녹화 시스템의 디지털 입력된 채널에 의해 기록 된.
148±35 셀 (mean±s.e.m)의 평균 중 38.4±3.5% 보여주었다 명확 장소 필드 활동 (그림 2) 각 세션에서 고립 될 수 있다. 장소 필드 했다 상대적으로 안정적인에 많은 예 심을 통해 (그림 2A)를 녹화 또는 문장을된 벨트 (그림 2B 및 그림 2C)에 노출의 몇 일 후에 초기 날. 공간 표현의 종류를 분별 수 있습니다. 일부 셀 반복된 장소 필드 동안 다른 셀 보여준 독특한 장소 필드 (그림 2C)12(그림 2A), 신호의 id와 상관을 보였다. 따라서, 우리 몇 일 동안 hippocampal 장소 세포를 기록 하 고 장소 필드 메커니즘, 메커니즘 및 공간 탐색, 학습, 및 메모리와 관련 된 역학 공부에 대 한 두 가지 중요 한 요건의 다양성을 확인할 수 있습니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56438/56438fig1.jpg"> 
그림 1: 실리콘 프로브 및 디딜 방 아 장치. 실리콘 감지기의 (A) 생크 및 사이트 레이아웃. (B) 주입 사이트. (C) 디딜 방 아 장비와 벨트에 단서의 레이아웃. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56438/56438fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56438/56438fig2v2.jpg"> 
그림 2: 장소 세포의 만성 녹음. (A) 색상 코딩 장소 필드 (맨 위)의 표현, 자동-correlogram (하단 왼쪽) 스파이크 및 1 일에 기록 된 셀 예제에 대 한 파형 (오른쪽 아래) 스파이크. (B-C) (A) 예 셀 동일 주 3 (B)에 하루 5 (C) 기록. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56438/56438fig2v2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

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Implantation of Chronic Silicon Probes and Recording of Hippocampal Place Cells in an Enriched Treadmill Apparatus

우리는 만성 실리콘 프로브를 이식 하 고 마우스는 디딜 방 아 큐 농축 장치에 실행 머리 고정에 장소 세포를 기록 하는 다양 한 단계를 설명 합니다.

만성 실리콘 프로브 및 녹음 풍부한 디딜 방 아 장치에 Hippocampal 장소 세포의 이식

An important requisite for understanding brain function is the identification of behavior and cell activity correlates. Silicon probes are advanced ...

implantation-chronic-silicon-probes-recording-hippocampal-place-cells

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

12.6K 조회수.  Korea Institute of Science and Technology. 우리는 만성 실리콘 프로브를 이식 하 고 마우스는 디딜 방 아 큐 농축 장치에 실행 머리 고정에 장소 세포를 기록 하는 다양 한 단계를 설명 합니다.

비디오: Implantation of Chronic Silicon Probes and Recording of Hippocampal Place Cells in an Enriched Treadmill Apparatus

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding fundamental biological mechanisms. Striking progress has been particularly evident in Drosophila, whose extensive toolkit of mutants and transgenic lines provides a convenient model to study evolutionarily-conserved developmental and cell biological mechanisms. We are interested in understanding the mechanisms that control cell fate specification in the adult peripheral nervous system (PNS) in Drosophila. Bristles that cover the head, thorax, abdomen, legs and wings of the adult fly are individual mechanosensory organs, and have been studied as a model system for understanding mechanisms of Notch-dependent cell fate decisions. Sensory organ precursor (SOP) cells of the microchaetes (or small bristles), are distributed throughout the epithelium of the pupal thorax, and are specified during the first 12 hours after the onset of pupariation. After specification, the SOP cells begin to divide, segregating the cell fate determinant Numb to one daughter cell during mitosis. Numb functions as a cell-autonomous inhibitor of the Notch signaling pathway.
Here, we show a method to follow protein dynamics in SOP cell and its progeny within the intact pupal thorax using a combination of tissue-specific Gal4 drivers and GFP-tagged fusion proteins 1,2.This technique has the advantage over fixed tissue or cultured explants because it allows us to follow the entire development of an organ from specification of the neural precursor to growth and terminal differentiation of the organ. We can therefore directly correlate changes in cell behavior to changes in terminal differentiation. Moreover, we can combine the live imaging technique with mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) system to assess the dynamics of tagged proteins in mitotic SOPs under mutant or wildtype conditions. Using this technique, we and others have revealed novel insights into regulation of asymmetric cell division and the control of Notch signaling activation in SOP cells (examples include references 1-6,7 ,8).

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

In this video, we describe a method for live cell imaging of asymmetrically dividing sensory organ progenitor cells and epidermal cells in intact Drosophila pupae

손상의 감각 오르간 전구체 세포 라이브 셀 이미징 Drosophila Pupae

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding ...

연구

신경과학

Recording Large-scale Neuronal Ensembles with Silicon Probes in the Anesthetized Rat

Large scale electrophysiological recordings from neuronal ensembles offer the opportunity to investigate how the brain orchestrates the wide variety of behaviors from the spiking activity of its neurons. One of the most effective methods to monitor spiking activity from a large number of neurons in multiple local neuronal circuits simultaneously is by using silicon electrode arrays1-3.
Action potentials produce large transmembrane voltage changes in the vicinity of cell somata. These output signals can be measured by placing a conductor in close proximity of a neuron. If there are many active (spiking) neurons in the vicinity of the tip, the electrode records combined signal from all of them, where contribution of a single neuron is weighted by its 'electrical distance'. Silicon probes are ideal recording electrodes to monitor multiple neurons because of a large number of recording sites (+64) and a small volume. Furthermore, multiple sites can be arranged over a distance of millimeters, thus allowing for the simultaneous recordings of neuronal activity in the various cortical layers or in multiple cortical columns (Fig. 1). Importantly, the geometrically precise distribution of the recording sites also allows for the determination of the spatial relationship of the isolated single neurons4. Here, we describe an acute, large-scale neuronal recording from the left and right forelimb somatosensory cortex simultaneously in an anesthetized rat with silicon probes (Fig. 2).

Extracellular recordings of neuronal activity using silicon probes in the anesthetized rat will be described. This technique allows information to be obtained across multiple brain areas from more than 100 neurons simultaneously. It provides information with single cell resolution about neuronal ensembles dynamics in multiple local circuits.

Anesthetized 쥐의 실리콘 프로브와 함께 대규모의 연결 Ensembles 녹음하기

Large scale electrophysiological recordings from neuronal ensembles offer the opportunity to investigate how the brain orchestrates the wide variety of ...

Surgical Implantation of Chronic Neural Electrodes for Recording Single Unit Activity and Electrocorticographic Signals

The success of long-term electrophysiological recordings often depends on the quality of the implantation surgery. Here we provide useful information for surgeons who are learning the process of implanting electrode systems. We demonstrate the implantation procedure of both a penetrating and a surface electrode. The surgical process is described from start to finish, including detailed descriptions of each step throughout the procedure. It should also be noted that this video guide is focused towards procedures conducted in rodent models and other small animal models. Modifications of the described procedures are feasible for other animal models.

We provide useful information for surgeons who are learning the process of implanting chronic neural recording electrodes. Techniques for both penetrating and surface electrode systems are described in a rodent animal model.

단일 유닛 활동과 Electrocorticographic 신호를 녹음하기 위해 만성 신경 전극 외과 이식

The success of long-term electrophysiological recordings often depends on the quality of the implantation surgery.  Here we provide useful information for ...

Large-scale Recording of Neurons by Movable Silicon Probes in Behaving Rodents

A major challenge in neuroscience is linking behavior to the collective activity of neural assemblies. Understanding of input-output relationships of neurons and circuits requires methods with the spatial selectivity and temporal resolution appropriate for mechanistic analysis of neural ensembles in the behaving animal, i.e. recording of representatively large samples of isolated single neurons. Ensemble monitoring of neuronal activity has progressed remarkably in the past decade in both small and large-brained animals, including human subjects1-11. Multiple-site recording with silicon-based devices are particularly effective because of their scalability, small volume and geometric design.
Here, we describe methods for recording multiple single neurons and local field potential in behaving rodents, using commercially available micro-machined silicon probes with custom-made accessory components. There are two basic options for interfacing silicon probes to preamplifiers: printed circuit boards and flexible cables. Probe supplying companies (<a href="http://www.neuronexustech.com/" >http://www.neuronexustech.com/</a>; <a href="http://www.sbmicrosystems.com/">http://www.sbmicrosystems.com/</a>; <a href="http://www.acreo.se/">http://www.acreo.se/</a>) usually provide the bonding service and deliver probes bonded to printed circuit boards or flexible cables. Here, we describe the implantation of a 4-shank, 32-site probe attached to flexible polyimide cable, and mounted on a movable microdrive. Each step of the probe preparation, microdrive construction and surgery is illustrated so that the end user can easily replicate the process.

We describe methods for large-scale recording of multiple single units and local field potential in behaving rodents with silicon probes. Drive fabrication, probe attachment to the drive and probe implantation processes are illustrated in sufficient details for easy replication.

설치류를 행동에 이동 가능한 실리콘 프로브에 의한 뉴런의 대규모 녹화

A major challenge in neuroscience is linking behavior to the collective activity of neural assemblies. Understanding of input-output relationships of ...

Design and Assembly of an Ultra-light Motorized Microdrive for Chronic Neural Recordings in Small Animals

The ability to chronically record from populations of neurons in freely behaving animals has proven an invaluable tool for dissecting the function of neural circuits underlying a variety of natural behaviors, including navigation1 , decision making 2,3, and the generation of complex motor sequences4,5,6. Advances in precision machining has allowed for the fabrication of light-weight devices suitable for chronic recordings in small animals, such as mice and songbirds. The ability to adjust the electrode position with small remotely controlled motors has further increased the recording yield in various behavioral contexts by reducing animal handling.6,7
 Here we describe a protocol to build an ultra-light motorized microdrive for long-term chronic recordings in small animals. Our design evolved from an earlier published version7, and has been adapted for ease-of use and cost-effectiveness to be more practical and accessible to a wide array of researchers. This proven design 8,9,10,11 allows for fine, remote positioning of electrodes over a range of ~ 5 mm and weighs less than 750 mg when fully assembled. We present the complete protocol for how to build and assemble these drives, including 3D CAD drawings for all custom microdrive components.

The design, fabrication and assembly of an ultra-light motorized microdrive is described. The device provides a cost-effective and easy-to-use solution for chronic recordings of single units in small behaving animals.

작은 동물의 만성 신경 레코딩을위한 초경량 동력 Microdrive의 설계 및 조립

The ability to chronically record from populations of neurons in freely behaving animals has proven an invaluable tool for dissecting the function of ...

Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs through activation of their ion channels and neurotransmitter receptors, and process information in part through activity-dependent release of gliotransmitters. Furthermore, astrocytes constitute the main uptake system for glutamate, contribute to potassium spatial buffering, as well as to GABA clearance. These cells therefore constantly monitor synaptic activity, and are thereby sensitive indicators for alterations in synaptically-released glutamate, GABA and extracellular potassium levels. Additionally, alterations in astroglial uptake activity or buffering capacity can have severe effects on neuronal functions, and might be overlooked when characterizing physiopathological situations or knockout mice. Dual recording of neuronal and astroglial activities is therefore an important method to study alterations in synaptic strength associated to concomitant changes in astroglial uptake and buffering capacities. Here we describe how to prepare hippocampal slices, how to identify stratum radiatum astrocytes, and how to record simultaneously neuronal and astroglial electrophysiological responses. Furthermore, we describe how to isolate pharmacologically the synaptically-evoked astroglial currents.

The preparation of acute brain slices from isolated hippocampi, as well as the simultaneous electrophysiological recordings of astrocytes and neurons in stratum radiatum during stimulation of schaffer collaterals is described. The pharmacological isolation of astroglial potassium and glutamate transporter currents is demonstrated.

급성 Hippocampal 슬라이스에 Synaptically-evoked Astroglial와 Neuronal 응답의 듀얼 Electrophysiological 레코딩

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

Fiber-optic Implantation for Chronic Optogenetic Stimulation of Brain Tissue

Elucidating patterns of neuronal connectivity has been a challenge for both clinical and basic neuroscience. Electrophysiology has been the gold standard for analyzing patterns of synaptic connectivity, but paired electrophysiological recordings can be both cumbersome and experimentally limiting. The development of optogenetics has introduced an elegant method to stimulate neurons and circuits, both in vitro1 and in vivo2,3. By exploiting cell-type specific promoter activity to drive opsin expression in discrete neuronal populations, one can precisely stimulate genetically defined neuronal subtypes in distinct circuits4-6. Well described methods to stimulate neurons, including electrical stimulation and/or pharmacological manipulations, are often cell-type indiscriminate, invasive, and can damage surrounding tissues. These limitations could alter normal synaptic function and/or circuit behavior. In addition, due to the nature of the manipulation, the current methods are often acute and terminal. Optogenetics affords the ability to stimulate neurons in a relatively innocuous manner, and in genetically targeted neurons. The majority of studies involving in vivo optogenetics currently use a optical fiber guided through an implanted cannula6,7; however, limitations of this method include damaged brain tissue with repeated insertion of an optical fiber, and potential breakage of the fiber inside the cannula. Given the burgeoning field of optogenetics, a more reliable method of chronic stimulation is necessary to facilitate long-term studies with minimal collateral tissue damage. Here we provide our modified protocol as a video article to complement the method effectively and elegantly described in Sparta et al.8 for the fabrication of a fiber optic implant and its permanent fixation onto the cranium of anesthetized mice, as well as the assembly of the fiber optic coupler connecting the implant to a light source. The implant, connected with optical fibers to a solid-state laser, allows for an efficient method to chronically photostimulate functional neuronal circuitry with less tissue damage9 using small, detachable, tethers. Permanent fixation of the fiber optic implants provides consistent, long-term in vivo optogenetic studies of neuronal circuits in awake, behaving mice10 with minimal tissue damage.

The development of optogenetics now provides the means to precisely stimulate genetically defined neurons and circuits, both in vitro and in vivo. Here we describe the assembly and implantation of a fiber optic for chronic photostimulation of brain tissue.

뇌 조직의 만성 Optogenetic의 자극을위한 광섬유 주입

Elucidating patterns of neuronal connectivity has been a challenge for both clinical and basic neuroscience. Electrophysiology has been the gold standard ...

Electrophysiological Method for Recording Intracellular Voltage Responses of Drosophila Photoreceptors and Interneurons to Light Stimuli In Vivo

Voltage responses of insect photoreceptors and visual interneurons can be accurately recorded with conventional sharp microelectrodes. The method described here enables the investigator to measure long-lasting (from minutes to hours) high-quality intracellular responses from single Drosophila R1-R6 photoreceptors and Large Monopolar Cells (LMCs) to light stimuli. Because the recording system has low noise, it can be used to study variability among individual cells in the fly eye, and how their outputs reflect the physical properties of the visual environment. We outline all key steps in performing this technique. The basic steps in constructing an appropriate electrophysiology set-up for recording, such as design and selection of the experimental equipment are described. We also explain how to prepare for recording by making appropriate (sharp) recording and (blunt) reference electrodes. Details are given on how to fix an intact fly in a bespoke fly-holder, prepare a small window in its eye and insert a recording electrode through this hole with minimal damage. We explain how to localize the center of a cell's receptive field, dark- or light-adapt the studied cell, and to record its voltage responses to dynamic light stimuli. Finally, we describe the criteria for stable normal recordings, show characteristic high-quality voltage responses of individual cells to different light stimuli, and briefly define how to quantify their signaling performance. Many aspects of the method are technically challenging and require practice and patience to master. But once learned and optimized for the investigator's experimental objectives, it grants outstanding in vivo neurophysiological data.

Electrophysiological Method for Recording Intracellular Voltage Responses of Drosophila Photoreceptors and Interneurons to Light Stimuli In Vivo

Sharp microelectrodes enable accurate electrophysiological characterization of photoreceptor and visual interneuron output in living Drosophila. Here we show how to use this method to record high-quality voltage responses of individual cells to controlled light stimulation. This method is ideal for studying neural information processing in insect compound eyes.

의 기록 세포 내 전압 응답에 대한 전기 생리 방법<em&gt; 초파리</em&gt; 빛 자극에 광수와의 interneurons<em&gt; 생체</em

Voltage responses of insect photoreceptors and visual interneurons can be accurately recorded with conventional sharp microelectrodes. The method ...

Quantification of Endosome and Lysosome Motilities in Cultured Neurons Using Fluorescent Probes

In the brain, membrane trafficking systems play important roles in regulating neuronal functions, such as neuronal morphology, synaptic plasticity, survival, and glial communications. To date, numerous studies have reported that defects in these systems cause various neuronal diseases. Thus, understanding the mechanisms underlying vesicle dynamics may provide influential clues that could aid in the treatment of several neuronal disorders. Here, we describe a method for quantifying vesicle motilities, such as motility distance and rate of movement, using a software plug-in for the ImageJ platform. To obtain images for quantification, we labeled neuronal endosome-lysosome structures with EGFP-tagged vesicle marker proteins and observed the movement of vesicles using a time-lapse microscopy. This method is highly useful and simplify measuring vesicle motility in neurites, such as axons and dendrites, as well as in the soma of both neurons and glial cells. Furthermore, this method can be applied to other cell lines, such as fibroblasts and endothelial cells. This approach could provide a valuable advancement of our understanding of membrane trafficking.

The investigation of membrane trafficking is crucial for understanding neuronal functions. Here, we introduce a method for quantifying vesicle motility in neurons. This is a convenient method that can be adapted to the quantification of membrane trafficking in the nervous system.

형광 프로브를 이용한 배양 된 뉴런의 엔도 좀과 리소좀 기능의 정량화

In the brain, membrane trafficking systems play important roles in regulating neuronal functions, such as neuronal morphology, synaptic plasticity, ...

Chronic Transcranial Electrical Stimulation and Intracortical Recording in Rats

Transcranial electrical stimulation (TES) is a powerful and relatively simple approach to diffusely influence brain activity either randomly or in a closed-loop event-triggered manner. Although many studies are focusing on the possible benefits and side-effects of TES in healthy and pathologic brains, there are still many fundamental open questions regarding the mechanism of action of the stimulation. Therefore, there is a clear need for a robust and reproducible method to test the acute and the chronic effects of TES in rodents. TES can be combined with regular behavioral, electrophysiological, and imaging techniques to investigate neuronal networks in vivo. The implantation of transcranial stimulation electrodes does not impose extra constraints on the experimental design while it offers a versatile, flexible tool to manipulate brain activity. Here we provide a detailed, step-by-step protocol to fabricate and implant transcranial stimulation electrodes to influence brain activity in a temporally constrained manner for months.

This detailed protocol describes transcranial stimulation electrode placement on the temporal bone in order to investigate the short- and long-term effects of transcranial electrical stimulation in freely moving rats.

만성 Transcranial 전기 자극 및 쥐 Intracortical 녹음

Transcranial electrical stimulation (TES) is a powerful and relatively simple approach to diffusely influence brain activity either randomly or in a ...