Questo lavoro è stato supportato da Korea Institute of Science e tecnologia programma istituzionale (n. progetti 2E26190 e 2E26170) e la Human Frontier Science Program (RGY0089/2012).

tutti i metodi descritti sono stati approvati dal comitato di uso del Korea Institute of Science e tecnologia e cura degli animali.
 1. preparare il Micro-drive e l'elettrodo <ol><li>micro-unità di montaggio.
	<ol><li>Stampa le parti della micro-drive (cursore, corpo e shell) 14 utilizzando una stampante 3D ad alta risoluzione. Assicurarsi che le parti non hanno difetti.</li>
		<li>Fissare il cursore nel corpo del micro-drive con una vite (dimensione 000-120 x 1/4).</li>
		<li>Saldare un dado (formato Hex 000-120 000 120/64) verso la punta della vite.</li>
		<li>Ruotare la vite in senso orario per spostare il cursore in alto o in senso antiorario per spostare verso il basso.</li>
		<li>Fissare il guscio al corpo con una vite (dimensione 000-120 x 1/4).</li>
	</ol></li> <li>Montaggio della sonda sull'unità micro-.
	<ol><li>Difficoltà il micro-unità in posizione orizzontale sotto un microscopio binoculare.</li>
		<li>Utilizzare un morsetto a coccodrillo piatto con imbottitura in gomma per afferrare il cavo della sonda silicio, mentre si toglie attentamente la sonda dal recinto della spedizione con il forcipe. Fissare il morsetto a coccodrillo per un manipolatore.</li>
		<li>Utilizzando il manipolatore, porre la sonda di silicio sul dispositivo di scorrimento di micro-unità, parallelo alla direzione di movimento.</li>
		<li>Applicare una goccia di cemento dentale (temperatura di polimerizzazione acrilico dentale materiale di riparazione) per fissare la sonda per il dispositivo di scorrimento. Correggere la posizione della sonda se è spostato. Colla non è raccomandato in quanto guarisce molto velocemente e rende difficile regolare nuovamente la posizione degli elettrodi.</li>
		<li>Fissare il connettore della sonda al titolare della C (supporto del connettore) con cemento dentale.</li>
	</ol></li> <li>Lavaggio e mettere colorante sulla sonda.
	<ol><li>Fix il Microdrive/sonda assemblaggio del dispositivo di pulizia sonda. Il dispositivo è dotato di 2 piccoli rotanti schiuma spugne (tamponi non sterili). Regolare il divario con il manipolatore.</li>
		<li>Bagnare le spugne con detersivi.</li>
		<li>Muovere lentamente la sonda su e giù tra le spugne, permettendo un tocco delicato. Monitorare il processo di pulizia sotto un microscopio.</li>
		<li>Sciacquare la sonda con acqua distillata. Immergere la sonda in alcool per la sterilizzazione.</li>
		<li>Dil applica (colorante fluorescente lipofilico) sul retro della tibia della sonda, utilizzando un tampone di gomma piuma. Questo vi permetterà in una fase successiva la visualizzazione delle posizioni di tibia nel cervello.</li>
	</ol></li> <li>Montaggio il cappello <ol><li>stampare le parti del cappello (piastra di testa, supporto del connettore e un coperchio) 14 utilizzando una stampante 3D. I 3 pezzi si incastrano per formare un involucro sigillato.</li>
		<li>Inserire dadi (dimensioni M2 e 00-90 00 90/4) nelle asole del piastra di testa e fissarlo con colla e cemento dentale.</li>
		<li>Inserire una rondella nello slot della PAC e difficoltà con cemento dentale.</li>
	</ol></li></ol> 2. Chirurgia per la fissazione del cappello sul cranio tutti gli strumenti utilizzati per la chirurgia sono preventivamente sterilizzati in autoclave. Viene utilizzato un dispositivo di perline calore secco forto sterilizzare strumenti che essere contaminati e devono essere sterilizzati durante l'intervento chirurgico.
<ol><li>Impostare il livello di isoflurane al 4% per l'inizio dell'anestesia. Mettere il mouse nella camera di anestesia per 5 min.</li>
	<li>Installare il mouse in un apparato stereotassica.</li>
	<li>Ridurre il livello di isoflurano a 1,5-2%. Regolare il livello durante l'intervento chirurgico in base allo stato animale, il tasso di respirazione e corpo temperatura 20.</li>
	<li>Applicare unguento oculare sugli occhi.</li>
	<li>Radere il cuoio capelluto e pulire la testa dell'animale con antisettico (iodopovidone). Mantenere condizioni asettiche durante tutte le fasi dell'intervento chirurgico.</li>
	<li>Inject bupivacaine (1 mg/kg) sotto il cuoio capelluto. Tagliare e rimuovere la parte della pelle parietale della testa del mouse utilizzando la forbice per esporre il cranio ai relativi bordi. Utilizzare soluzione salina e una spugna emostatica per pulire e controllare il sanguinamento durante l'intervento chirurgico.</li>
	<li>Rimuovere il periostio utilizzando uno strumento di raschietto.</li>
	<li>Trovare i punti di riferimento sul cranio 21: bregma, lambda, coronale e la sutura sagittale. Regolare la testa &#39; s angolo lungo l'asse sagittale, tale che il Bregma e lambda punti sono alla stessa altezza.</li>
	<li>Praticare due fori (~0.5 mm di diametro) nel cranio per gli elettrodi di riferimento e terra. I fori devono essere circa 1 mm caudale e laterale di 1 mm del Lambda.</li>
	<li>Inserire gli elettrodi di riferimento e di terra (viti di acciaio inox dimensioni miniatura 000-120 000 120/16 filo accoppiato ai connettori pin).</li>
	<li>Applica luce ultravioletta (UV) attivatore di dentina sul cranio di legame e quindi applicare la luce UV per 45-60 s.</li>
	<li>Applicare uno strato di cemento dentale sui bordi del cranio. Evitare la diffusione di cemento sulla pelle e capelli dei topi.</li>
	<li>Fissare la piastra di testa a un manipolatore stereotassica e posizionarlo sopra il cranio. Lentamente abbassare la piastra di testa fino a toccare leggermente il cranio e applicare il cemento dentale all'incrocio con il cranio. Lasciate che la cura di cemento dentale per 15 min.</li>
	<li>Rimuovere l'anestesia. Difficoltà un supporto del connettore e un berretto sulla testa-piastra. Mettere il mouse nella sua gabbia dopo aver dato un'iniezione sub-cutanea di ketaprofen 5 mg/kg.</li>
	<li>Dare Sub-cutanee iniezioni di ketaprofen 5 mg/kg per i prossimi due giorni e monitor con attenzione per qualsiasi segno di dolore. Topi in genere si sveglia dall'anestesia entro 20-40 min. L'impianto di cappello è relativamente leggero (3,34 gr), tale che topi non hanno problemi ad alzare la testa, eseguire in labirinti e salire sui bordi della loro gabbia a casa.</li>
</ol> 3. Formazione comportamentale <ol><li>dopo un periodo di recupero post-operatorio di 7 giorni, avviare la restrizione di acqua a 1 mL al giorno.</li>
	<li>Per rendere il nastro, tagliare un pezzo di tessuto in velluto (5 cm da 1-2 m) e correggere piccoli oggetti su di esso utilizzando la colla a caldo. Allegare oggetti eretti sui bordi della cintura in modo da non interferire con il movimento del mouse.</li>
	<li>Fissare la cinghia sulle ruote del tapis roulant suturando insieme le due estremità.</li>
	<li>Installare il mouse testa-fisso in tapis roulant inserendo e serrando le due viti della piastra di testa nelle fessure della piastra di testa-fissazione.</li>
	<li>Inizio formazione il mouse per eseguire testa-trattenuto sul tapis roulant per la ricompensa di acqua. Consegnare la ricompensa di acqua attraverso una porta di leccare. Inizialmente, mettere il mouse sul tapis roulant per periodi di 10 minuti, 3 volte al giorno.</li>
	<li>Come il mouse si abitua alla testa-fissazione e inizia a muoversi la cintura (in genere dopo circa 3 giorni), aumentare la sessione di allenamento durata 30 min. Dopo 2-3 settimane, alcuni topi eseguire più di 100 sperimentazioni in 30 min (una prova essendo una rotazione completa della cintura).</li>
	<li>Scegliere i topi che mostrano le migliori prestazioni comportamentali per gli esperimenti di registrazione.</li>
</ol> 4. L'impianto di silicone sonda <ol><li>mettere il mouse sotto anestesia.</li>
	<li>Installare il mouse nell'apparato stereotassica di testa-piastra di fissaggio. Pulire la superficie del cranio con soluzione fisiologica.</li>
	<li>Trovare marcatori stereotassica: bregma, lambda, coronale e la sutura sagittale. Misurare la distanza fino al punto di inserimento e segnare it.</li>
	<li>Trapano l'osso con attenzione fino a quando diventa sottile e trasparente. Inumidire e pulire con soluzione salina durante la foratura.</li>
	<li>Rimuovere attentamente l'osso assottigliata e la materia Dura usando la forza di precisionePS. Mantenere la superficie del cervello bagnato con soluzione fisiologica per tutto il tempo.</li>
	<li>Difficoltà l'assemblaggio di sonda Microdrive/silicio per un manipolatore stereotassica. Portare la sonda di silicio appena sopra il craniotomy. Avvitare il supporto del connettore della sonda silicio alla testa-piastra.</li>
	<li>Collegare gli elettrodi di registrazione amplificatore e riferimento di terra. Scudo del mouse con foglio di alluminio per proteggere dal rumore elettromagnetico. Avviare il sistema di registrazione per monitorare l'attività elettrica del cervello.</li>
	<li>Inserire lentamente la sonda di silicio nel cervello usando il micromanipolatore. Controllare continuamente i segnali elettrici, la distanza di manipolatore viaggiato e gli stinchi della sonda (assicurarsi che essi stanno penetrando nel cervello). Attività dell'unità è visibile nella corteccia, mentre la materia bianca sottostante è relativamente silenziosa. Attività dell'unità riappare quando gli stinchi toccare lo strato piramidale dell'ippocampo. Da questo punto, ritrarre il silicio sonda 200 µm (utilizzare il micro-drive, il giorno successivo per riportare la tibia nello strato piramidale).</li>
	<li>Coprire la superficie del cervello con una miscela di cera dell'osso e olio minerale.</li>
	<li>Difficoltà il micro-drive alla testa-piastra usando cemento dentale. Lasciate che la cura di cemento dentale per 15 min. Quindi scollegare l'unità di micro dal manipolatore stereotassica e mettiti il cappello.</li>
	<li>Mettere il mouse indietro nella sua gabbia e dare un'iniezione sub-cutanea di ketaprofen 5 mg/kg. Verifica di qualsiasi segno di dolore. Questa chirurgia è molto meno invasiva rispetto al primo e topi sono in genere attivi entro 45 min dopo si sveglia dall'anestesia. Tuttavia, lasciare che il mouse per recuperare un'intera giornata come la sonda di silicio ha bisogno di stabilizzare nel cervello.</li>
</ol> 5. Registrazione <ol><li>installare il mouse testa-fisso sul tapis roulant. Rimuovere il cappello cap.</li>
	<li>Collegare l'amplificatore di registrazione e avviare la registrazione.</li>
	<li>Il primo giorno, utilizzare il micro-drive per spostare la sonda di silicio nello strato piramidale dell'ippocampo. Ogni girata in senso antiorario della vite si muove la tibia 200 µm più profondo. Regolare la posizione di tibia lentamente (~ 20-50 µm alla volta) fino a ripple oscillazioni 13 e unità attività appaiono.</li>
	<li>Sui prossimi giorni, regolare la posizione del gambo e attendere ~ 1 h prima di registrare l'attività hippocampal mentre il mouse viene eseguito sulla cintura. Per mantenere la qualità del segnale buona registrazione per diversi giorni, rimuovere oggetti duri e soffitto dal mouse basso &#39; gabbia per minimizzare la probabilità che il cappello si imbatte in superfici dure.</li>
</ol> 6. Riprendendo la sonda <ol><li>mettere il mouse sotto anestesia.</li>
	<li>Installare il mouse nell'apparato stereotassica di testa-piastra di fissaggio. Rimuovere il cappello cap.</li>
	<li>Portare il manipolatore stereotassica appena sopra il micro-drive. Difficoltà il micro-drive per il manipolatore. Svitare il supporto del connettore dalla piastra di testa. Rimuovere la vite che collega il guscio e il corpo della micro-drive.</li>
	<li>Sotto la supervisione di microscopio binoculare, tirare lentamente l'assemblaggio sonda micro-unità/silicio con il manipolatore stereotassica, lasciando la parte di shell.</li>
	<li>Pulire la sonda del silicio con il dispositivo di pulizia.</li>
</ol>

<ol>
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Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Registrazione cronica dell'attività neuronale è fondamentale per comprendere i processi neurali quali campi posto hippocampal. Il nostro approccio per eseguire cronica silicio sonda implantantation si distingue da altri metodi7,18,19,20 dal fatto che è relativamente semplice recuperare il pacchetto di elettrodo a alla fine dell'esperimento. Mentre le cellule posto in genere vengono studiate in liberi di muoversi condizioni, l'apparato di tapis roulant semplifica non solo notevolmente il disegno sperimentale e analisi dei dati, permette anche ai ricercatori di scrutare posto campo meccanismi in contesti minimi durante molte ripetizioni di traiettorie animale stereotipato12. È anche molto più semplice da costruire rispetto ai sistemi di realtà virtuale, poiché richiede solo la stampa 3D ruote, sensori di movimento unidimensionale e un microcontrollore.
Stabile posto campo attività potrebbero essere registrati nel corso di molti giorni, un requisito importante per indagare le dinamiche a lungo termine di rete associate all'apprendimento. A questo proposito, si devono considerare alcuni problemi. In primo luogo, i processi di formazione di tessuto cerebrale in degenerazione e cicatrice intorno le sonde in silicone potrebbero essi stessi generare variazioni a lungo termine a modelli di attività. Pertanto è importante per tutte le procedure chirurgiche essere fatto con attenzione per causare danni minimi ai tessuti del cervello e vasi sanguigni. In secondo luogo, è relativamente difficile tenere traccia di singole celle per giorni consecutivi, a causa delle derive di elettrodi nel cervello14. A questo proposito, tecniche di imaging come microscopia del due-fotone e micro-endoscopia potrebbe essere meglio adatto, come cella identità possono essere rintracciati dalla morfologia e la configurazione spaziale di cellule21,22,23 . Consentono inoltre una maggiore resa in termini di numero delle cellule registrata e fornire informazioni dirette sulla cella gene espressioni24. Tuttavia, tecniche di imaging sono piuttosto invasivi quando regioni profonde del cervello sono interessate e non possono risolvere i potenziali di azione singoli come essi si basano principalmente su segnali di calcio. Quindi, potrebbe essere una soluzione ottimale per gli studi longitudinali di combinare approcci sia ottici che elettrofisiologici.
Infine, vale la pena notare che l'insieme delle tecniche che abbiamo descritto potrebbe essere facilmente adattabile per altri tipi di elettrodo, tra cui Neuropixels (https://www.janelia.org/lab/harris-lab-apig) e optrodes11,25 , 26e può essere utilizzato in una gamma di modelli sperimentali diversi dalle cellule ippocampali posto. Con i rapidi progressi nella tecnologia di stampa 3D, l'ulteriore miglioramento e personalizzazione dei dispositivi di registrazioni e comportamentali dovrebbe diventare più semplice e accessibile ai laboratori.

Punte in silicio presentano diversi vantaggi per registrazioni elettrofisiologiche, compreso il fatto che essi sono progettati con profili taglienti, riducendo al minimo il danno tissutale e che essi presentano un layout preciso di densamente registrazione siti1, 2,3,4. Essi sono utilizzati per studiare i vari sistemi in specie differenti, compreso gli esseri umani3,5,6, con diversi approcci1,7. Ancora, il loro uso ricorrente è ancora relativamente limitato a causa del loro costo, fragilità e il fatto che i metodi utili per gli esperimenti cronici mancano8. Gli avanzamenti recenti nella tecnologia di stampa 3D hanno reso possibile la progettazione personalizzata di dispositivi come micro-Drive e testa-piastre per consentire una più facile gestione di questi elettrodi delicati. In una prima fase, descriveremo come costruire e utilizzare un insieme di strumenti che abbiamo sviluppato per l'impianto di silicone cronica sonde14.
Mentre le cellule di posizione sono in genere studiate usando gli animali liberi di muoversi in esecuzione in labirinti, recentemente essi sono stati studiati anche in ambienti virtuali15 e tapis roulant apparatii9 (Figura 1A). Questi metodi sperimentali offrono il vantaggio che gli animali possono essere testa-trattenuto, rendendo l'uso di microscopio 2 fotoni15, patch-clamp16e optrode9,10,11 tecniche più facile, oltre a fornire maggiore controllo sul comportamento animale e stimoli ambientali12. In una seconda fase, vi presentiamo le procedure per la formazione di topi e registrare l'attività delle cellule di posto in un apparato di tapis roulant.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Silicon Probe</td>
			<td>Neuronexus</td>
			<td>Buzsabi32</td>
			<td>Recording electrode</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recording system</td>
			<td>Intantech</td>
			<td>RHD2132/RHD2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3D printer</td>
			<td>Asiga</td>
			<td>Pico Plus 27</td>
			<td>High resolution printer for micro-drive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3D printer</td>
			<td>Stratasys</td>
			<td>Mojo</td>
			<td>Lower resolution printer for hat components</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereotaxic apparatus</td>
			<td>Kopf</td>
			<td>Model 963</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Binocular microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>M60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Treadmill apparatus</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>We build them</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

implantation of chronic silicon probes and recording of hippocampal place cells in an enriched treadmill apparatus

Un requisito importante per comprendere la funzione del cervello è l'identificazione del comportamento e l'attività delle cellule correla. Punte in silicio sono avanzati elettrodi per registrazioni elettrofisiologiche su larga scala dell'attività neuronale, ma le procedure per il loro impianto cronica sono ancora poco sviluppate. L'attività delle cellule ippocampali posto è noto per correlare con la posizione di un animale nell'ambiente, ma i meccanismi di fondo sono ancora poco chiari. Per studiare le cellule posto, qui descriviamo un insieme di tecniche che vanno dalla fabbricazione dei dispositivi per sonda di silicio cronica gli impianti per il monitoraggio delle attività di campo posto in un apparato di tapis roulant cue-arricchita. Un micro-drive e un cappello sono costruiti da raccordo e fissare insieme le parti in plastica stampata in 3D. Una sonda di silicio è montata su micro-unità, pulita e rivestita con la tintura. Un primo intervento chirurgico viene eseguito per correggere il cappello sul cranio di un mouse. Piccoli punti di riferimento sono fabbricati e attaccate alla cintura di un tapis roulant. Il mouse è addestrato per eseguire testa-fisso sul tapis roulant. Un secondo intervento chirurgico viene eseguito per impiantare la sonda di silicio nell'ippocampo, seguendo quali segnali elettrofisiologici a banda larga sono registrati. Infine, la sonda di silicio è recuperata e pulita per il riutilizzo. L'analisi dell'attività delle cellule posto in tapis roulant rivela una diversità di meccanismi di campo, delineando il beneficio dell'approccio.

Un mouse in primo luogo è stato addestrato per eseguire su una cintura lunga due metri priva di spunti (Figura 1). Dopo l'impianto dell'elettrodo, una nuova cinghia della stessa lunghezza, ma che presenta 3 paia di stecche è stato installato sul tapis roulant, al fine di generare rappresentazioni spaziali allocentriche12,14. Segnali a banda larga sono stati registrati a una frequenza di campionamento di 30.000 Hz, utilizzando un sistema di 250 canali di registrazione (scheda amplificatore con scheda di interfaccia USB e su misura Labview interfaccia) e due punte in silicio (Figura 1A, 4 Tibia, 8 siti per tibia) impiantati in CA1 e CA3 (Figura 1B). Unità sono state rilevate utilizzando una funzione di soglia sui segnali filtrati passa-alto (0.8-5 kHz). Isolamento delle cellule è stato effettuato usando una punta semi-automatica l'ordinamento metodo15,16,17. Il movimento avanti/indietro del tapis roulant è stato monitorato mediante LED e fotosensore coppie e registrata da canali di input digitale del sistema di registrazione.
Una media di cellule 148±35 (mean±s.e.m) potrebbe essere isolata in ogni sessione, tra cui 38.4±3.5% hanno mostrato l'attività di collocazione chiara campo (Figura 2). I campi di posto erano relativamente stabili in molti studi clinici, in entrambi il giorno iniziale di registrazione (Figura 2A) o dopo diversi giorni di esposizione alla cintura acciaccata ( Figura 2eFigura 2B ). Diversi tipi di rappresentazioni spaziali potrebbero essere individuati. Alcune cellule hanno mostrato ripetute posto campi correlati con l'identità dei segnali (Figura 2A), mentre altre cellule hanno mostrato un luogo unico campo (Figura 2)12. Quindi, potremmo registrare le cellule ippocampali posto sopra parecchi giorni e identificare una varietà di meccanismi di campo, due importanti requisiti per studiare i meccanismi e le dinamiche associate a memoria, apprendimento e navigazione spaziale.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56438/56438fig1.jpg"> 
Figura 1: apparato di sonda e tapis roulant Silicon. (A) layout tibia e sito della sonda di silicio. (B) sito di impianto. (C) apparato di tapis roulant e il layout degli spunti sulla cintura. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56438/56438fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56438/56438fig2v2.jpg"> 
Figura 2: registrazione cronica delle cellule posto. (A) colore codificato rappresentazione del luogo campi (in alto), spike auto-Correlogramma (in basso a sinistra) e spike forme d'onda (in basso a destra) per un esempio di cella registrati il giorno 1. (B-C) Stesso che (A) per gli esempi di cellule registrata il giorno 5 (C) e 3 (B). <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56438/56438fig2v2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

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Implantation of Chronic Silicon Probes and Recording of Hippocampal Place Cells in an Enriched Treadmill Apparatus

Vengono descritti i diversi passi per impiantare microleve cronica e registrare posto cellule nei topi che vengono fissati a testa in esecuzione su un apparato di tapis roulant cue-arricchita.

Impianto di silicio cronica sonde e registrazione delle cellule ippocampali posto in un apparato di tapis roulant arricchito

An important requisite for understanding brain function is the identification of behavior and cell activity correlates. Silicon probes are advanced ...

implantation-chronic-silicon-probes-recording-hippocampal-place-cells

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

12.6K Views.  Korea Institute of Science and Technology. Vengono descritti i diversi passi per impiantare microleve cronica e registrare posto cellule nei topi che vengono fissati a testa in esecuzione su un apparato di tapis roulant cue-arricchita.

Video: Implantation of Chronic Silicon Probes and Recording of Hippocampal Place Cells in an Enriched Treadmill Apparatus

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding fundamental biological mechanisms. Striking progress has been particularly evident in Drosophila, whose extensive toolkit of mutants and transgenic lines provides a convenient model to study evolutionarily-conserved developmental and cell biological mechanisms. We are interested in understanding the mechanisms that control cell fate specification in the adult peripheral nervous system (PNS) in Drosophila. Bristles that cover the head, thorax, abdomen, legs and wings of the adult fly are individual mechanosensory organs, and have been studied as a model system for understanding mechanisms of Notch-dependent cell fate decisions. Sensory organ precursor (SOP) cells of the microchaetes (or small bristles), are distributed throughout the epithelium of the pupal thorax, and are specified during the first 12 hours after the onset of pupariation. After specification, the SOP cells begin to divide, segregating the cell fate determinant Numb to one daughter cell during mitosis. Numb functions as a cell-autonomous inhibitor of the Notch signaling pathway.
Here, we show a method to follow protein dynamics in SOP cell and its progeny within the intact pupal thorax using a combination of tissue-specific Gal4 drivers and GFP-tagged fusion proteins 1,2.This technique has the advantage over fixed tissue or cultured explants because it allows us to follow the entire development of an organ from specification of the neural precursor to growth and terminal differentiation of the organ. We can therefore directly correlate changes in cell behavior to changes in terminal differentiation. Moreover, we can combine the live imaging technique with mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) system to assess the dynamics of tagged proteins in mitotic SOPs under mutant or wildtype conditions. Using this technique, we and others have revealed novel insights into regulation of asymmetric cell division and the control of Notch signaling activation in SOP cells (examples include references 1-6,7 ,8).

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

In this video, we describe a method for live cell imaging of asymmetrically dividing sensory organ progenitor cells and epidermal cells in intact Drosophila pupae

Live-cellula Imaging di cellule sensoriali Precursore in Organo intatto Drosophila Pupae

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding ...

Ricerca

Neuroscienze

Recording Large-scale Neuronal Ensembles with Silicon Probes in the Anesthetized Rat

Large scale electrophysiological recordings from neuronal ensembles offer the opportunity to investigate how the brain orchestrates the wide variety of behaviors from the spiking activity of its neurons. One of the most effective methods to monitor spiking activity from a large number of neurons in multiple local neuronal circuits simultaneously is by using silicon electrode arrays1-3.
Action potentials produce large transmembrane voltage changes in the vicinity of cell somata. These output signals can be measured by placing a conductor in close proximity of a neuron. If there are many active (spiking) neurons in the vicinity of the tip, the electrode records combined signal from all of them, where contribution of a single neuron is weighted by its 'electrical distance'. Silicon probes are ideal recording electrodes to monitor multiple neurons because of a large number of recording sites (+64) and a small volume. Furthermore, multiple sites can be arranged over a distance of millimeters, thus allowing for the simultaneous recordings of neuronal activity in the various cortical layers or in multiple cortical columns (Fig. 1). Importantly, the geometrically precise distribution of the recording sites also allows for the determination of the spatial relationship of the isolated single neurons4. Here, we describe an acute, large-scale neuronal recording from the left and right forelimb somatosensory cortex simultaneously in an anesthetized rat with silicon probes (Fig. 2).

Extracellular recordings of neuronal activity using silicon probes in the anesthetized rat will be described. This technique allows information to be obtained across multiple brain areas from more than 100 neurons simultaneously. It provides information with single cell resolution about neuronal ensembles dynamics in multiple local circuits.

Registrazione Ensembles neuronali su larga scala con sonde di silicio sotto Rat anestetizzati

Large scale electrophysiological recordings from neuronal ensembles offer the opportunity to investigate how the brain orchestrates the wide variety of ...

Surgical Implantation of Chronic Neural Electrodes for Recording Single Unit Activity and Electrocorticographic Signals

The success of long-term electrophysiological recordings often depends on the quality of the implantation surgery. Here we provide useful information for surgeons who are learning the process of implanting electrode systems. We demonstrate the implantation procedure of both a penetrating and a surface electrode. The surgical process is described from start to finish, including detailed descriptions of each step throughout the procedure. It should also be noted that this video guide is focused towards procedures conducted in rodent models and other small animal models. Modifications of the described procedures are feasible for other animal models.

We provide useful information for surgeons who are learning the process of implanting chronic neural recording electrodes. Techniques for both penetrating and surface electrode systems are described in a rodent animal model.

Impianto chirurgico di elettrodi neurali cronici per la registrazione di attività singola unità e segnali Electrocorticographic

The success of long-term electrophysiological recordings often depends on the quality of the implantation surgery.  Here we provide useful information for ...

Large-scale Recording of Neurons by Movable Silicon Probes in Behaving Rodents

A major challenge in neuroscience is linking behavior to the collective activity of neural assemblies. Understanding of input-output relationships of neurons and circuits requires methods with the spatial selectivity and temporal resolution appropriate for mechanistic analysis of neural ensembles in the behaving animal, i.e. recording of representatively large samples of isolated single neurons. Ensemble monitoring of neuronal activity has progressed remarkably in the past decade in both small and large-brained animals, including human subjects1-11. Multiple-site recording with silicon-based devices are particularly effective because of their scalability, small volume and geometric design.
Here, we describe methods for recording multiple single neurons and local field potential in behaving rodents, using commercially available micro-machined silicon probes with custom-made accessory components. There are two basic options for interfacing silicon probes to preamplifiers: printed circuit boards and flexible cables. Probe supplying companies (<a href="http://www.neuronexustech.com/" >http://www.neuronexustech.com/</a>; <a href="http://www.sbmicrosystems.com/">http://www.sbmicrosystems.com/</a>; <a href="http://www.acreo.se/">http://www.acreo.se/</a>) usually provide the bonding service and deliver probes bonded to printed circuit boards or flexible cables. Here, we describe the implantation of a 4-shank, 32-site probe attached to flexible polyimide cable, and mounted on a movable microdrive. Each step of the probe preparation, microdrive construction and surgery is illustrated so that the end user can easily replicate the process.

We describe methods for large-scale recording of multiple single units and local field potential in behaving rodents with silicon probes. Drive fabrication, probe attachment to the drive and probe implantation processes are illustrated in sufficient details for easy replication.

Su larga scala di registrazione dei neuroni da sonde mobili in silicio Comportarsi Roditori

A major challenge in neuroscience is linking behavior to the collective activity of neural assemblies. Understanding of input-output relationships of ...

Design and Assembly of an Ultra-light Motorized Microdrive for Chronic Neural Recordings in Small Animals

The ability to chronically record from populations of neurons in freely behaving animals has proven an invaluable tool for dissecting the function of neural circuits underlying a variety of natural behaviors, including navigation1 , decision making 2,3, and the generation of complex motor sequences4,5,6. Advances in precision machining has allowed for the fabrication of light-weight devices suitable for chronic recordings in small animals, such as mice and songbirds. The ability to adjust the electrode position with small remotely controlled motors has further increased the recording yield in various behavioral contexts by reducing animal handling.6,7
 Here we describe a protocol to build an ultra-light motorized microdrive for long-term chronic recordings in small animals. Our design evolved from an earlier published version7, and has been adapted for ease-of use and cost-effectiveness to be more practical and accessible to a wide array of researchers. This proven design 8,9,10,11 allows for fine, remote positioning of electrodes over a range of ~ 5 mm and weighs less than 750 mg when fully assembled. We present the complete protocol for how to build and assemble these drives, including 3D CAD drawings for all custom microdrive components.

The design, fabrication and assembly of an ultra-light motorized microdrive is described. The device provides a cost-effective and easy-to-use solution for chronic recordings of single units in small behaving animals.

Progettazione e assemblaggio di un ultraleggero motorizzato per Microdrive croniche Recordings neurali in animali di piccola taglia

The ability to chronically record from populations of neurons in freely behaving animals has proven an invaluable tool for dissecting the function of ...

Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs through activation of their ion channels and neurotransmitter receptors, and process information in part through activity-dependent release of gliotransmitters. Furthermore, astrocytes constitute the main uptake system for glutamate, contribute to potassium spatial buffering, as well as to GABA clearance. These cells therefore constantly monitor synaptic activity, and are thereby sensitive indicators for alterations in synaptically-released glutamate, GABA and extracellular potassium levels. Additionally, alterations in astroglial uptake activity or buffering capacity can have severe effects on neuronal functions, and might be overlooked when characterizing physiopathological situations or knockout mice. Dual recording of neuronal and astroglial activities is therefore an important method to study alterations in synaptic strength associated to concomitant changes in astroglial uptake and buffering capacities. Here we describe how to prepare hippocampal slices, how to identify stratum radiatum astrocytes, and how to record simultaneously neuronal and astroglial electrophysiological responses. Furthermore, we describe how to isolate pharmacologically the synaptically-evoked astroglial currents.

The preparation of acute brain slices from isolated hippocampi, as well as the simultaneous electrophysiological recordings of astrocytes and neurons in stratum radiatum during stimulation of schaffer collaterals is described. The pharmacological isolation of astroglial potassium and glutamate transporter currents is demonstrated.

Due registrazioni elettrofisiologiche di sinapticamente-evocati Risposte astrogliale e neuronale in acute fettine di ippocampo

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

Fiber-optic Implantation for Chronic Optogenetic Stimulation of Brain Tissue

Elucidating patterns of neuronal connectivity has been a challenge for both clinical and basic neuroscience. Electrophysiology has been the gold standard for analyzing patterns of synaptic connectivity, but paired electrophysiological recordings can be both cumbersome and experimentally limiting. The development of optogenetics has introduced an elegant method to stimulate neurons and circuits, both in vitro1 and in vivo2,3. By exploiting cell-type specific promoter activity to drive opsin expression in discrete neuronal populations, one can precisely stimulate genetically defined neuronal subtypes in distinct circuits4-6. Well described methods to stimulate neurons, including electrical stimulation and/or pharmacological manipulations, are often cell-type indiscriminate, invasive, and can damage surrounding tissues. These limitations could alter normal synaptic function and/or circuit behavior. In addition, due to the nature of the manipulation, the current methods are often acute and terminal. Optogenetics affords the ability to stimulate neurons in a relatively innocuous manner, and in genetically targeted neurons. The majority of studies involving in vivo optogenetics currently use a optical fiber guided through an implanted cannula6,7; however, limitations of this method include damaged brain tissue with repeated insertion of an optical fiber, and potential breakage of the fiber inside the cannula. Given the burgeoning field of optogenetics, a more reliable method of chronic stimulation is necessary to facilitate long-term studies with minimal collateral tissue damage. Here we provide our modified protocol as a video article to complement the method effectively and elegantly described in Sparta et al.8 for the fabrication of a fiber optic implant and its permanent fixation onto the cranium of anesthetized mice, as well as the assembly of the fiber optic coupler connecting the implant to a light source. The implant, connected with optical fibers to a solid-state laser, allows for an efficient method to chronically photostimulate functional neuronal circuitry with less tissue damage9 using small, detachable, tethers. Permanent fixation of the fiber optic implants provides consistent, long-term in vivo optogenetic studies of neuronal circuits in awake, behaving mice10 with minimal tissue damage.

The development of optogenetics now provides the means to precisely stimulate genetically defined neurons and circuits, both in vitro and in vivo. Here we describe the assembly and implantation of a fiber optic for chronic photostimulation of brain tissue.

Fibra ottica Impianto per la Stimolazione Optogenetic cronica del tessuto cerebrale

Elucidating patterns of neuronal connectivity has been a challenge for both clinical and basic neuroscience. Electrophysiology has been the gold standard ...

Electrophysiological Method for Recording Intracellular Voltage Responses of Drosophila Photoreceptors and Interneurons to Light Stimuli In Vivo

Voltage responses of insect photoreceptors and visual interneurons can be accurately recorded with conventional sharp microelectrodes. The method described here enables the investigator to measure long-lasting (from minutes to hours) high-quality intracellular responses from single Drosophila R1-R6 photoreceptors and Large Monopolar Cells (LMCs) to light stimuli. Because the recording system has low noise, it can be used to study variability among individual cells in the fly eye, and how their outputs reflect the physical properties of the visual environment. We outline all key steps in performing this technique. The basic steps in constructing an appropriate electrophysiology set-up for recording, such as design and selection of the experimental equipment are described. We also explain how to prepare for recording by making appropriate (sharp) recording and (blunt) reference electrodes. Details are given on how to fix an intact fly in a bespoke fly-holder, prepare a small window in its eye and insert a recording electrode through this hole with minimal damage. We explain how to localize the center of a cell's receptive field, dark- or light-adapt the studied cell, and to record its voltage responses to dynamic light stimuli. Finally, we describe the criteria for stable normal recordings, show characteristic high-quality voltage responses of individual cells to different light stimuli, and briefly define how to quantify their signaling performance. Many aspects of the method are technically challenging and require practice and patience to master. But once learned and optimized for the investigator's experimental objectives, it grants outstanding in vivo neurophysiological data.

Electrophysiological Method for Recording Intracellular Voltage Responses of Drosophila Photoreceptors and Interneurons to Light Stimuli In Vivo

Sharp microelectrodes enable accurate electrophysiological characterization of photoreceptor and visual interneuron output in living Drosophila. Here we show how to use this method to record high-quality voltage responses of individual cells to controlled light stimulation. This method is ideal for studying neural information processing in insect compound eyes.

Metodo elettrofisiologiche per la registrazione intracellulare di tensione Risposte di<em&gt; Drosophila</em&gt; Fotorecettori e Interneuroni a luce stimoli<em&gt; In Vivo</em

Voltage responses of insect photoreceptors and visual interneurons can be accurately recorded with conventional sharp microelectrodes. The method ...

Quantification of Endosome and Lysosome Motilities in Cultured Neurons Using Fluorescent Probes

In the brain, membrane trafficking systems play important roles in regulating neuronal functions, such as neuronal morphology, synaptic plasticity, survival, and glial communications. To date, numerous studies have reported that defects in these systems cause various neuronal diseases. Thus, understanding the mechanisms underlying vesicle dynamics may provide influential clues that could aid in the treatment of several neuronal disorders. Here, we describe a method for quantifying vesicle motilities, such as motility distance and rate of movement, using a software plug-in for the ImageJ platform. To obtain images for quantification, we labeled neuronal endosome-lysosome structures with EGFP-tagged vesicle marker proteins and observed the movement of vesicles using a time-lapse microscopy. This method is highly useful and simplify measuring vesicle motility in neurites, such as axons and dendrites, as well as in the soma of both neurons and glial cells. Furthermore, this method can be applied to other cell lines, such as fibroblasts and endothelial cells. This approach could provide a valuable advancement of our understanding of membrane trafficking.

The investigation of membrane trafficking is crucial for understanding neuronal functions. Here, we introduce a method for quantifying vesicle motility in neurons. This is a convenient method that can be adapted to the quantification of membrane trafficking in the nervous system.

Quantificazione delle endosomi e dei motivi di lisosomi nei neuroni coltivati ​​utilizzando sonde fluorescenti

In the brain, membrane trafficking systems play important roles in regulating neuronal functions, such as neuronal morphology, synaptic plasticity, ...

Chronic Transcranial Electrical Stimulation and Intracortical Recording in Rats

Transcranial electrical stimulation (TES) is a powerful and relatively simple approach to diffusely influence brain activity either randomly or in a closed-loop event-triggered manner. Although many studies are focusing on the possible benefits and side-effects of TES in healthy and pathologic brains, there are still many fundamental open questions regarding the mechanism of action of the stimulation. Therefore, there is a clear need for a robust and reproducible method to test the acute and the chronic effects of TES in rodents. TES can be combined with regular behavioral, electrophysiological, and imaging techniques to investigate neuronal networks in vivo. The implantation of transcranial stimulation electrodes does not impose extra constraints on the experimental design while it offers a versatile, flexible tool to manipulate brain activity. Here we provide a detailed, step-by-step protocol to fabricate and implant transcranial stimulation electrodes to influence brain activity in a temporally constrained manner for months.

This detailed protocol describes transcranial stimulation electrode placement on the temporal bone in order to investigate the short- and long-term effects of transcranial electrical stimulation in freely moving rats.

Stimolazione elettrica transcranica cronica e registrazione intracorticale in ratti

Transcranial electrical stimulation (TES) is a powerful and relatively simple approach to diffusely influence brain activity either randomly or in a ...