Este estudo foi suportado por grant não. 81301-CA do Instituto Nacional do câncer. Agradecemos a Bob Carlson para assistência editorial, Dr. Peter Villalta Xun Ming para assistência de espectrometria de massa no recurso de compartilhado de bioquímica analítica do centro de câncer maçônico e Dr. Adam T. Zarth e Dr. Anna K. Michel por suas valiosas discussões e de entrada. O recurso de compartilhado de bioquímica analítica parcialmente financiado pela National câncer Instituto câncer centro suporte Grant CA-77598

1. materiais e procedimentos gerais <ol><li>Synthesize NNN conforme descrito anteriormente 15. Obter norcotinine, P450 2A6 Baculosomes, sistema de regeneração de NADPH, amortecedor da reação de 0,5 x e todos os outros produtos químicos ou solventes de fontes comerciais em grau reagente.</li>
	<li>Espectro RMN de registro em um espectrômetro de 500 MHz. Produto químico relatório turnos como partes por milhão (ppm). Usar a picos de solventes residuais como referências internas para 1 H-NMR (7,26 ppm CDCl 3) e 13 C-NMR (77,2 ppm CDCl 3). 
	Nota: Pico divisão utilizada as seguintes abreviações: s = singleto, d = dubleto, dd = dubleto de parelhas, dt = dubleto de trigêmeos, dq = dubleto de quartetos, ddd = dubleto de gibão de Parelhas e m = multiplet.</li>
	<li>Realizar a espectrometria de massa de alta resolução (HRMS) para compostos selecionados em um LTQ Orbitrap Velos e dados do relatório como m/z.</li>
	<li>Uso polygram pré-revestido placas de sílica gel TLC (40 mm x 80 mm, 0,2 mm de espessura) com indicador fluorescente de 254 nm para cromatografia de camada fina (TLC). Visualizar placas do TLC por irradiação de lâmpada UV.</li>
	<li>Realizar a cromatografia flash em um 60 Å, 70-150 malha sílica gel usando uma coluna de vidro de 1,5 x 15 cm.</li>
</ol> 2. Preparação de nitrosamide controle positivo (N &#8242;-nitrosonorcotinine, NNC) <ol><li>seco, em estufa durante a noite (16 h, ~ 140 ° C), um 25 mL, balão de fundo redondo contendo uma barra de agitação magnética. Pela manhã, fixe o balão sob um fluxo de N 2 enquanto estiver usando um borbulhador de óleo para manter o fluxo de 2 N taxa sob uma bolha por segundo. 
	Nota: Após o resfriamento, sem precauções para mantê-lo sob N 2 são necessárias.</li>
	<li>Em uma coifa, adicionar norcotinine (31,8 mg, 0.196 mmol), (5 mL) de anidrido acético e ácido acético (1 mL) no balão de refrigeração. Mexa essa mistura continuamente arrefecendo a 0 ° C, com um banho de água-gelo. 
	Atenção: Anidrido acético e ácido acético são corrosivos.</li>
	<li>Adicionar NaNO 2 (33,3 mg, 0.483 mmol) em uma parcela e continuamente, agitar a mistura por 2,5 h. acompanhar os progressos reação do TLC (100% AcOEt, R f = 0,19, consulte a etapa 1.4). 
	Nota: Durante este tempo, a mistura se tornará cada vez mais amarela com subida ocasional.</li>
	<li>Saciar a reação derramando a mistura em gelada H 2 O (18 mL). Extraia imediatamente a solução aquosa com 18 mL de CH 2 Cl 2 em um funil de separação de 100ml. Extrair a camada aquosa pelo menos 2 vezes adicionais com CH 2 Cl 2 (9 mL cada uma).</li>
	<li>Secar o organics em pool mais ~ 100 mg de MgSO 4 por 2 min. filtro e concentrar a solução por evaporação rotativa para produzir um óleo cru, amarelo. Aqueça o banho de água a 30 ° C durante a evaporação para remover o ácido acético residual. 
	Nota: O protocolo pode ser pausado aqui se o composto é dissolvido em CH 2 Cl 2 e a solução armazenada no escuro a 2-8 ° C.</li>
	<li>Purificar o composto cru por cromatografia em coluna (ver passo 1.5) utilizando sílica gel como fase estacionária e 100% AcOEt como o eluente 16. 
	Atenção: NNC e nitrosamides relacionados devem ser manuseados com cuidado, como eles são considerados cancerígenos humanos.</li>
	<li>Dissolver o composto puro no CDCl 3 e usar NMR (consulte a etapa 1.2) para confirmar a estrutura e determinar a molaridade desta solução 17. Armazene esta solução no escuro a 2-8 ° C até ser necessário. 
	Nota: Esta solução será usada como o controle positivo no ensaio em vitro (passo 3.5). Espectro RMN e mudanças químicas estão disponíveis nas informações de apoio.</li>
	<li>Com uma solução NNC pura, confirmar a precisão pai massa e determinar massas de íon produto por infusão direta em um espectrômetro de massa de alta resolução (HRMS) sob parâmetros descritos nas etapas 1.3 e 4.3. 
	Nota: Massas de produto serão usadas para a detecção deste composto em vitro metabolismo ensaio (passo 4.3).</li>
</ol> 3. Uma nitrosamina-P450 em vitro incubação de exemplo <ol><li>remover P450 2A6 Baculosomes, sistema de regeneração-Vivid-NADPH e 10mm NADP + solução de estoque de um freezer-80 ° C e deixe-os descongelar no gelo. Uma vez descongelado, diluir o Baculosomes e o sistema de regeneração de NADPH-1:10 e 01:50, respectivamente, em um tubo único 1 mL com 0,5 reação X Buffer. Da mesma forma, adicionar 3 μL do NADP + solução de estoque para 97 μL de 0.5 X reação Buffer. 
	Nota: NADP + é sensível à luz. Manter essa solução protegida por seu recipiente de embrulho em papel de alumínio. Soluções de enzima são sensíveis aos ciclos de gelo-degelo; Este limite a não mais de 2 ciclos. Preparar alíquotas conforme necessário para futuras experiências.</li>
	<li>Para cada incubação, adicionar 50 μL de solução de enzima (contendo 5 pmol P450) para um 1 mL do tubo contendo 40 μL de solução NNN 4 μM feitos com amortecedor da reação. Pre-incubar esta nova mistura por 2 min a 37 ° C, utilizando um banho de água e em seguida, adicionar 10 μL de solução diluída de NADP +. Incubar o sistema completo para 1 / 30 min a 37 ° C. 
	Nota: Usando intervalos de 5 min para tempos de incubação (por exemplo, 5, 10, 15 min, etc) irá fornecer um curso de tempo de formação suficiente do nitrosamide.</li>
	<li>Após o tempo de incubação desejado, saciar pelo primeiro adicionando 10 μl de 3.0 N ZnSO 4 e em seguida 10 μL de 3.0 N Ba(OH) 2. Vórtice formarão a esta solução e um precipitado branco. Centrifugar a amostra a 8000 x g, durante 4 min para o precipitado de Pelotas. 
	Nota: O procedimento não deve pausar a este passo como os nitrosamides formados limitaram a estabilidade em soluções aquosas. Longas pausas podem resultar em falsos negativos.</li>
	<li>Imediatamente pipetar o sobrenadante e analisar 2 μL por espectrometria de massa em tandem de alta resolução da nanoelectrospray-ionização positiva cromatografia líquida (LC-NSI +-HRMS/MS, passos 4,1-4,3).</li>
	<li>Para incubação do controle positivo, evaporar uma alíquota contendo 100 fmol de solução NNC sintetizada num tubo 1 mL sob um fluxo de N 2. Este frasco, adicione o sistema de enzima completa da etapa 3.2 e prossiga conforme descrito por etapas 3.3-3.4.</li>
	<li>Para incubação do controlo negativo, realizar o experimento como descritas (etapas 3,2-3,4), exceto a solução de substituir o 50 μL da enzima com 0.5 X amortecedor da reação.</li>
</ol> 4. Parâmetros de exemplo para a detecção de nitrosamide por LC-NSI +-HRMS/MS <ol><li>para o LC componente, aplicar o gradiente de várias etapa seguinte na etapa 4.2 para um sistema UPLC usando um comercial, mão-embalados 18 C18 (5 μm), 100 mm x 75 μm, coluna capilar de orifício μm 15.</li>
	<li>Usando 5 mM NH 4 OAc como solvente A e MeCN como solvente B, carregar a amostra na coluna executando a 5% B em 1 µ l/min de 0 - 5 min e em seguida, diminuindo a taxa de fluxo para 0.3 μL/min depois. Em seguida, execute um gradiente de 5 a 20% B 4 min, seguido por uma rampa para 55% B mais de 10 min e então re-equilibração a 5% B.</li>
	<li>Executar o LC-NSI +-HRMS/MS em um LTQ Orbitrap. Monitor para NNC por varredura completa e fragmentação de 2 MS. Executar uma varredura completa em uma resolução de 60.000 e extrair a massa exata do pai (192.07670) para uma tolerância em massa de 5 ppm. Fragmentação de 2 MS de uso para isolar o pai íons (2,0 amu) e fragmento por induzida por colisão dissociação (CID) com uma energia de colisão de 25 eV, resolução de 15.000 e verificação de tempo de 30 ms. extrair as massas precisas para íons de produto da NNC (m/z 192 m/z 134.04739 e 162.07874) para uma tolerância em massa de 5ppm.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Rom, W. N., Markowitz, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Environmental and Occupational Medicine. , 1226-1239 (2007).</li><li>Preussmann, R., Stewart, B. W., Searle, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Chemical Carcinogens, ACS Monograph 182. 2, 643-828 (1984).</li><li>Magee, P. N., Montesano, R., Preussmann, R., Searle, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Chemical Carcinogens. ACS monograph 173. , 491-625 (1976).</li><li>Zhu, A. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alaska+Native+smokers+and+smokeless+tobacco+users+with+slower+CYP2A6+activity+have+lower+tobacco+consumption,+lower+tobacco-specific+nitrosamine+exposure+and+lower+tobacco-specific+nitrosamine+bioactivation.">Alaska Native smokers and smokeless tobacco users with slower CYP2A6 activity have lower tobacco consumption, lower tobacco-specific nitrosamine exposure and lower tobacco-specific nitrosamine bioactivation.</a> Carcinogenesis. 34 (1), 93-101 (2013).</li><li>Mesi&#263;, M., Revis, C., Fishbein, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+structure+on+the+reactivity+of+alpha-hydroxydialkynitrosamines+in+aqueous+solutions.">Effects of structure on the reactivity of alpha-hydroxydialkynitrosamines in aqueous solutions.</a> J. Am. Chem. Soc. 118, 7412-7413 (1996).</li><li>Mochizuki, M., Anjo, T., Okada, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+N-alkyl-N-+(hydroxymethyl)nitrosamines+from+N-alkyl-N-+(hydroperoxymethyl)nitrosamines+by+deoxygenation.">Isolation and characterization of N-alkyl-N- (hydroxymethyl)nitrosamines from N-alkyl-N- (hydroperoxymethyl)nitrosamines by deoxygenation.</a> Tetrahedron Lett. 21, 3693-3696 (1980).</li><li>Guttenplan, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+cytosol+on+mutagenesis+induced+by+N-nitrosodimethylamine,+N-nitrosomethylurea+and+&#224;-acetoxy-N-nitrosodimethylamine+in+different+strains+of+Salmonella:evidence+for+different+ultimate+mutagens+from+N-nitrosodimethylmine.">Effects of cytosol on mutagenesis induced by N-nitrosodimethylamine, N-nitrosomethylurea and &#224;-acetoxy-N-nitrosodimethylamine in different strains of Salmonella:evidence for different ultimate mutagens from N-nitrosodimethylmine.</a> Carcinogenesis. 14, 1013-1019 (1993).</li><li>Elespuru, R. K., Saavedra, J. E., Kovatch, R. M., Lijinsky, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Examination+of+a-carbonyl+derivatives+of+nitrosodimethylamine+in+ethylnitrosomethyamine+as+putative+proximate+carcinogens.">Examination of a-carbonyl derivatives of nitrosodimethylamine in ethylnitrosomethyamine as putative proximate carcinogens.</a> Carcinogenesis. 14, 1189-1193 (1993).</li><li>Chow, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> ACS Symposium Series. 101, 13-37 (1979).</li><li>von Weymarn, L. B., Retzlaff, C., Murphy, S. 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P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidation+of+methyl+and+ethyl+nitrosamines+by+cytochrome+P450+2E1+and+2B1.">Oxidation of methyl and ethyl nitrosamines by cytochrome P450 2E1 and 2B1.</a> Biochemistry. 51 (50), 9995-10007 (2012).</li><li>Chowdhury, G., Calcutt, M. W., Guengerich, F. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidation+of+N-nitrosoalkylamines+by+human+cytochrome+P450+2A6:+sequential+oxidation+to+aldehydes+and+carboxylic+acids+and+analysis+of+reaction+steps.">Oxidation of N-nitrosoalkylamines by human cytochrome P450 2A6: sequential oxidation to aldehydes and carboxylic acids and analysis of reaction steps.</a> J Biol Chem. 285 (11), 8031-8044 (2010).</li><li>Carlson, E. S., Upadhyaya, P., Hecht, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+nitrosamide+formation+in+the+cytochrome+P450-mediated+metabolism+of+tobacco-specific+nitrosamines.">Evaluation of nitrosamide formation in the cytochrome P450-mediated metabolism of tobacco-specific nitrosamines.</a> Chem Res Toxicol. 29 (12), 2194-2205 (2016).</li><li>Amin, S., Desai, D., Hecht, S. S., Hoffmann, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+tobacco-specific+N-nitrosamines+and+their+metabolites+and+results+of+related+bioassays.">Synthesis of tobacco-specific N-nitrosamines and their metabolites and results of related bioassays.</a> Crit. Rev. Toxicol. 26, 139-147 (1996).</li><li>Clark, A. G., Wong, S. 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F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Importance+of+purity+evaluation+and+the+potential+of+quantitative+(1)H+NMR+as+a+purity+assay.">Importance of purity evaluation and the potential of quantitative (1)H NMR as a purity assay.</a> J Med Chem. 57 (22), 9220-9231 (2014).</li><li>van der Heeft, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microcapillary+column+switching+HPLC-electrospray+ionization+MS+system+for+the+direct+identification+of+peptides+presented+by+major+histocompatibility+complex+class+I+molecules.">A microcapillary column switching HPLC-electrospray ionization MS system for the direct identification of peptides presented by major histocompatibility complex class I molecules.</a> Anal Chem. 70 (18), 3742-3751 (1998).</li><li>White, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Chemistry+of+the+N-Alkyl-N-nitrosoamides.+I.+Methods+of+Preparation.">The Chemistry of the N-Alkyl-N-nitrosoamides. I. Methods of Preparation.</a> J. Am. Chem. Soc. 77, 6008-6010 (1955).</li><li>Patten, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+cytochrome+P450+2A6+and+3A4+as+major+catalysts+for+N'-nitrosonornicotine+alpha-hydroxylation+by+human+liver+microsomes.">Evidence for cytochrome P450 2A6 and 3A4 as major catalysts for N'-nitrosonornicotine alpha-hydroxylation by human liver microsomes.</a> Carcinogenesis. 18, 1623-1630 (1997).</li><li>Wong, H. L., Murphy, S. E., Hecht, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytochrome+P450+2A-catalyzed+metabolic+activation+of+structurally+similar+carcinogenic+nitrosamines:+N'-nitrosonornicotine+enantiomers,+N-nitrosopiperidine,+and+N-nitrosopyrrolidine.">Cytochrome P450 2A-catalyzed metabolic activation of structurally similar carcinogenic nitrosamines: N'-nitrosonornicotine enantiomers, N-nitrosopiperidine, and N-nitrosopyrrolidine.</a> Chem. Res. Toxicol. 18, 61-69 (2004).</li><li>Hecht, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemistry,+biology,+and+carcinogenicity+of+tobacco-specific+N-nitrosamines.">Biochemistry, biology, and carcinogenicity of tobacco-specific N-nitrosamines.</a> Chem. Res. Toxicol. 11, 559-603 (1998).</li><li>von Weymarn, L. B., Zhang, Q. Y., Ding, X., Hollenberg, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+8-methoxypsoralen+on+cytochrome+P450+2A13.">Effects of 8-methoxypsoralen on cytochrome P450 2A13.</a> Carcinogenesis. 26 (3), 621-629 (2005).</li></ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Elucidação do metabolismo de nitrosaminas é um componente crítico para a compreensão de sua carcinogenicidade. Desde que os envolvidos citocromo P450s e outras enzimas metabólicas são polimórficas, mais aplicação deste conhecimento potencialmente poderia identificar indivíduos de alto risco1,4. Novos dados indica que mais oxidação do α-hydroxynitrosamines, os presumíveis principais metabolitos de nitrosaminas envolvidos na ligação de DNA, para nitrosamides é possíveis; no entanto, isto não foi verdadeiramente testado uma vasta gama de substratos. Descrevemos um protocolo para determinar a extensão da oxidação processive de nitrosaminas para nitrosamides em vitro. Ampla aplicação desse método ajudará a determinar a importância desta via de metabolismo.
O método inicia-se através da elaboração de uma norma para a nitrosamide de interesse. No estudo, exemplo é NNC, um metabólito hipotético de carcinógeno tabaco NNN, uma substância cancerígena encontrada no tabaco produtos14,22. Conforme descrito, nitrosation de norcotinine não houve problemas com nenhum produto de lado discernível. O produto bruto foi contaminado por apenas a partida amida e ácido acético, que foram facilmente removida por cromatografia em coluna. Isto foi seguido por confirmação da estrutura por NMR e HRMS. Uma vantagem deste método é que é apropriado para praticamente qualquer amida, que permite que vários sistemas de nitrosamina/nitrosamide a ser investigada. Além disso, o uso de NMR para quantificação dá uma medida direta da molaridade da solução-padrão17. Isso permite que o armazenamento do composto sob condições inertes ao invés de medição que requerem por técnicas destrutivas como HPLC de fase reversa. Então várias diluições podem ser feitas de acordo com o desenho do experimento.
Com um controle positivo e um padrão de fragmentação de massa bem caracterizadas, método altamente sensível e seletivo LC-NSI+- HRMS/MS permite a detecção de nitrosamides em uma matriz relativamente complexa. Como mostrado, o método estima-se uma concentração de NNC de 1-10 nM ou 2-20 fmol na coluna apesar de 1000-fold excesso de começando nitrosamina, enzimas e outros cofactores. A sensibilidade e seletividade do método são devido ao uso de massa de alta resolução, que falta de sistemas de LC-MS padrão de monitoramento. Seleção de íon do pai com uma tolerância de 5 ppm em massa garante que somente compostos com a fórmula molecular desejado estão isolados. Da mesma forma, detecção de massa precisa dos dois íons mais abundantes produto juntamente com o seu tempo de retenção dá uma confirmação adicional do analito. Devido a isso, o método de espectrometria de massa requer que muitos parâmetros são otimizados, incluindo largura de isolamento, energia e tempo de varredura. O gradiente de LC também pode ser modificado para melhorar a sensibilidade como co eluição com outras substâncias limitará enchendo a armadilha do íon com o nitrosamide destino.
No exemplo estudo14, formação NNC foi menor. Com base na área em massa, NNC foi ~ 4000-fold menos abundante do que os produtos hidrolisados de α-hydroxyNNN21. Embora isto indica que NNC é um metabólito muito menor de NNN, outros sistemas podem ser diferentes. Couto et al. Encontrei a oxidação considerável, processive de dimetilnitrosamina e diethylnitrosamine; no entanto, o intermediário nitrosamide era indetectável sob suas condições12. É possível que analisando seu sistema pela técnica descrita aqui poderia revelar a formação de nitrosamide. Independentemente do seu nível de formação, a maior estabilidade do nitrosamides em relação ao α-hydroxynitrosamines pode indicar que estes compostos têm importância biológica, como eles mais prontamente devem transportar a célula.
Embora este método será aplicável à maioria dos sistemas de nitrosamina-enzima, existem algumas limitações. O mais significativo é que o método não é quantitativo. No experimento de exemplo, estimou-se formação da área de pico de espectrometria de massa de uma amostra de controle positivo. Para uma medição mais precisa, poderia ser desenvolvido um método de diluição de isótopos utilizando um nitrosamide desvendar rotulado. Outra abordagem poderia ser implementar uma estratégia de captura com compostos tais como acetyllysine - Nou N- acetilcisteína, mas isso não teve sucesso até à data em nossas mãos,14.
Outra limitação é a tendência de nitrosamides para hidrolisar facilmente9; assim, as amostras devem ser processadas individualmente. Isso diminui o fluxo de trabalho e impede que as amostras serem enviados para colaboradores para análise. Por último, note-se que, apesar de citocromo P450 2A6 e muitos outros estão disponíveis comercialmente, alguns exigem expressão de proteínas e a purificação para obter. Por exemplo, este ensaio foi aplicado a citocromo P450 2A1314, mas só está disponível após um processo de isolamento rigoroso23.
Em resumo, descrevemos um protocolo para a detecção de nitrosamides resultantes citocromo P450 catalisada por oxidação de nitrosaminas em vitro. O protocolo inclui uma síntese geral para um padrão de nitrosamide como um controle positivo e um em vitro citocromo P450 metabolismo ensaio usando LC-NSI+- HRMS/MS para a deteção. O estudo de exemplo, NNC foi detectada na incubação de todos os tempos que variam de 1-10 min, mas apenas como um metabólito menor de NNN. Aplicação do presente protocolo para outras nitrosaminas avaliará sua generalidade e o papel potencial dos nitrosamides na carcinogénese nitrosamina.

N-nitrosaminas são uma grande classe de substâncias cancerígenas encontradas na dieta, produtos do tabaco e o ambiente em geral; Eles também podem ser formados endogenamente no corpo humano1. Mais de 300 N -nitroso compostos foram testados e &#62; 90% foram avaliados como sendo cancerígenos em animais modelos2,3. Para expor sua carcinogenicidade, estes compostos primeiro devem ser ativados pelo citocromo P450s1,2,3. A pesquisa mostra que citocromo P450s oxidar prontamente nitrosaminas para α-hydroxynitrosamines (Figura 1), que são compostos altamente reativos com meia-vida de 5 ~ s antes de decompor-se espontaneamente para alkyldiazohydroxides. Este último pode alkylate DNA após a perda de H2O e N2. O DNA resultante adutos, se sem conserto, pode causar mutações que, em caso de crítica onco - ou genes supressores de tumor, levam ao desenvolvimento de câncer1. Por este motivo, muito esforço tem sido dispendido para adquirir um completo entendimento das vias metabólicas, adutos de DNA e a jusante dos metabolitos de oxidação do citocromo P450 de nitrosaminas cancerígenas. Este conhecimento tem potencial aplicação de avaliação de risco de câncer individual4.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56312/56312fig1.jpg"> 
Figura 1: Geral e metabolismo proposto de nitrosaminas. Nitrosaminas (1) são oxidadas por P450s para α-hydroxynitrosamines (2) que decompõem espontaneamente para alkyldiazohydroxides (3). Estes compostos podem ligar ao DNA para formar que adutos de DNA. Supor que 2 são mais oxidado P450s em nitrosamides 4. Estas diretamente podem vincular a DNA para formar o DNA romance adutos ou ser hidrolisado a 3 para formar que adutos de DNA conhecido. R1 e R2 representam qualquer grupo alquila. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56312/56312fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Embora a hipótese de α-hydroxynitrosamine é solidamente apoiada por dados abrangentes, existem algumas inconsistências; uma importante é a meia-vida curta de α-hydroxynitrosamines5,6. É conhecido que estes compostos são produzidos na membrana do retículo endoplasmático e posteriormente alquilação de DNA nuclear. Dado seu tempo de vida de alguns segundos, isso é intrigante como esses intermediários sobrevivem a viagem necessária embora o citosol. Uma hipótese é que uma parte da α-hydroxynitrosamines processively são oxidados nitrosamides7,8, que são bastante estáveis na comparação9. Isso provavelmente ocorrerá através de retenção do α-hydroxynitrosamines no sítio activo citocromo P450. Precedente para este tipo de oxidação tem sido visto com nicotina10, álcoois11e simples alkylnitrosamines12,13. Além disso, nitrosamides são agentes cancerígenos de acção directa2,3. Com base em sua reatividade9, estes compostos são acreditados produzir DNA adutos idênticos aos resultantes da α-hydroxynitrosamines, juntamente com o novo, inexplorado DNA adutos (Figura 1). Assim, esta hipótese explica não só o transporte através do citosol, mas também a formação de DNA danificar os produtos.
Neste trabalho, é descrito um protocolo geral para avaliar o em vitro citocromo P450 mediada por conversão de nitrosaminas para nitrosamides. A conversão anteriormente relatada de n- nitrosonornicotine (NNN) para n- nitrosonorcotinine (NNC) pelo citocromo P450 2A6 é mostrada como um exemplo14. Aplicação do presente protocolo para uma ampla gama de sistemas de enzima-substrato ajudará a determinar a importância de nitrosamides no metabolismo de nitrosamina global.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Norcotinine</td>
			<td>AKoS GmbH (Steinen, Germany)</td>
			<td>CAS 17708-87-1, AKoS AK0S006278969</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>695092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic Anhydride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>242845</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>431311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Barium Hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>433373</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Chloroform</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>151823</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC Acetonitrile</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>34998</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Sulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M7506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methylene Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>34856</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Nitrite</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>237213</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ViVid CYP2A6 Blue Screening Kit</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>PV6140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zinc Sulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>221376</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 mL tubes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AB0533</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mL round bottom flask</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z510424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>125 mL Erlenmeyer flask</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS4980125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>125 mL Separatory Funnel</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z261017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mL round bottom flask</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z278262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500 MHz NMR Spectrometer</td>
			<td>Bruker</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Allegra X-22R Centrifuge</td>
			<td>Beckman-Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LC vials</td>
			<td>ChromTech</td>
			<td>CTC&#8211;0957&#8211;BOND</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LTQ Orbitrap Velos</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic Stir bar</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z127035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NMR tube</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z274682</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P1000, P200, and P10 pipettes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotary evaporator</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z691410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RSLCnano UPLC system</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaking Water Bath</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>FSSWB15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stir plate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS6795420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PicoFrit Column</td>
			<td>New Objective</td>
			<td>PF3607515N5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luna C18, 5 um</td>
			<td>Phenomenex</td>
			<td>535913-1</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a general method for detecting nitrosamide formation in the in vitro metabolism of nitrosamines by cytochrome p450s

N-nitrosaminas são um grupo bem estabelecido de agentes cancerígenos ambientais, que requerem a oxidação do citocromo P450 que apresentam atividade. O mecanismo aceito de activação metabólica envolve a formação de α-hydroxynitrosamines que decompõem espontaneamente para agentes de alquilação de DNA. Acúmulo de danos ao DNA e mutações resultantes, em última análise, pode levar ao câncer. Novas evidências indicam que α-hydroxynitrosamines pode ser ainda mais oxidado para nitrosamides processively pelo citocromo P450s. Porque nitrosamides são geralmente mais estáveis do que α-hydroxynitrosamines e pode também alquilação de DNA, nitrosamides pode desempenhar um papel na carcinogênese. Neste relatório, descrevemos um protocolo geral para avaliar a produção de nitrosamide em vitro citocromo P450-catalisada do metabolismo de nitrosaminas. Este protocolo utiliza uma abordagem geral para a síntese da nitrosamides relevantes e um em vitro citocromo P450 metabolismo ensaio utilizando espectrometria de massa em tandem de ionização de alta resolução da cromatografia líquida-nanospray para a deteção. Esse método detectado n'- nitrosonorcotinine como um metabólito menor de n- nitrosonornicotine no estudo de exemplo. O método tem alta sensibilidade e deteção de massa seletivamente devida à precisão. Aplicação deste método para uma grande variedade de sistemas de nitrosamina-citocromo P450 ajudará a determinar a generalidade desta transformação. Porque citocromo P450s são polimórficos e variar em atividade, uma melhor compreensão da formação de nitrosamide poderia ajudar na avaliação do risco individual de câncer.

Baseado no trabalho de branco et al. 19, norcotinine nitrosados para NNC foi limpa e de alto rendimento (80-92%) para produzir um padrão para o experimento em vitro . Evidências estruturais para uma bem sucedida reação foi obtida a partir de análises espectroscópicas, incluindo 1H-NMR, 13C-NMR, acolhedor e HSQC (informações de apoio), juntamente com o HRMS que confirmou a massa pai [M + H]+ dentro de 5 ppm do valor teórico (Figura 2). Fragmentação de2 MS de NNC foi usada para determinar as massas de íon produto mais abundantes. O íon de massa e produto de determinado pai precisos massas foram usadas no método do ensaio in vitro - HRMS/MS, LC-NSI+. Se armazenados no escuro a 2-8 ° C, a solução NNC é estável pelo menos 3 meses. Como se trata de uma reação muito geral, tem aplicação a qualquer amida de 2°.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56312/56312fig2.jpg"> 
Figura 2: HRMS e HRMS2 espectro do NNC. A) massa de pai exata do NNC com tolerância de 5 ppm em massa: calculado: [M + H]+ = 192.07675, Found: 192.07670. B) MS2 fragmentação de m/z 192 com uma largura de isolamento de 2,0 amu. Os dois íons de produto mais abundantes são 134.04739 e 162.07875. Reproduzido com permissão da Chem. res. Toxicol., 2016, 29, pp 2194-2205. Copyright 2016 American Chemical Society. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56312/56312fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
NNC sintetizado foi utilizado como padrão para o ensaio de metabolismo em vitro P450. Citocromo P450 2A6 foi usado porque é conhecido por ser um catalisador eficiente de NNN oxidação20. Da mesma forma, a concentração de NNN foi definida para 2 μM como calcula o Km para α-hidroxilação21. Nas condições cromatográficas descritas, NNC sintético elutes ~17.5 min com picos bem resolvidos em ambos o pai íon e íon produto canais. Em conformidade com o controle positivo, observou-se formação de NNC na incubação do 1, 5 e 10 min.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56312/56312fig3.jpg"> 
Figura 3: Cromatogramas de LC-NSI-HRMS resultantes da incubação do 2A6 de NNN-citocromo P450. Para todas as seções, o cromatograma top é o pai preciso massa extraído de verificação completa para NNC. Os cromatogramas médio e inferior são duas massas de íon precisas dos produtos extraídas de fragmentação de2 MS para NNC. Seções são as seguintes: NNC padrão (A), NNC-citocromo P450 2A6 incubação do contendo todas as enzimas relevantes e cofactores com tempos de incubação de 1 min (B), (C) de 5 min e 10 min (D). RT = tempo de retenção; MA = massa área. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56312/56312fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
NNC níveis foram máximas em 5 min e diminuíram em pontos de tempo mais tarde. Níveis de quantificação relativa usando NNC sintética como um padrão estimado NNC máxima para ser 10 nM. No controle negativo falta o sistema P450, sem formação de NNC foi detectada (dados não mostrados), assim indicando conversão enzimática foi necessária. Juntos, este protocolo mostra evidência direta para a conversão de NNN NNC pelo P450 2A6, embora a extensão da formação é menor em comparação com α-hidroxilação de NNN.

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A General Method for Detecting Nitrosamide Formation in the In Vitro Metabolism of Nitrosamines by Cytochrome P450s

Α-hidroxilação de nitrosaminas cancerígenas pelo citocromo P450s é a aceita via metabólica que produz o DNA de danos intermediários, que causam mutações. No entanto, novos dados indicam mais pode ocorrer oxidação para nitrosamides. Descrevemos um general método para a detecção de nitrosamides produzidos a partir de em vitro citocromo P450-catalisada metabolismo de nitrosaminas.

Um método geral para detectar a formação de Nitrosamide no metabolismo In Vitro de nitrosaminas por citocromo P450s

N-nitrosamines are a well-established group of environmental carcinogens, which require cytochrome P450 oxidation to exhibit activity. The accepted ...

a-general-method-for-detecting-nitrosamide-formation-vitro-metabolism

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Cancer Research

A General Method for Detecting Nitrosamide Formation in the In Vitro Metabolism of Nitrosamines by Cytochrome P450s

9.9K visualizações.  University of Minnesota. Α-hidroxilação de nitrosaminas cancerígenas pelo citocromo P450s é a aceita via metabólica que produz o DNA de danos intermediários, que causam mutações. No entanto, novos dados indicam mais pode ocorrer oxidação para nitrosamides. Descrevemos um general método para a detecção de nitrosamides produzidos a partir de em vitro citocromo P450-catalisada metabolismo de nitrosaminas.

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The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

Drosophila melanogaster has emerged as a powerful experimental system for functional and mechanistic studies of tumor development and progression in the context of a whole organism. Sophisticated techniques to generate genetic mosaics facilitate induction of visually marked, genetically defined clones surrounded by normal tissue. The clones can be analyzed through diverse molecular, cellular and omics approaches. This study describes how to generate fluorescently labeled clonal tumors of varying malignancy in the eye/antennal imaginal discs (EAD) of Drosophila larvae using the Mosaic Analysis with a Repressible Cell Marker (MARCM) technique. It describes procedures how to recover the mosaic EAD and brain from the larvae and how to process them for simultaneous imaging of fluorescent transgenic reporters and antibody staining. To facilitate molecular characterization of the mosaic tissue, we describe a protocol for isolation of total RNA from the EAD. The dissection procedure is suitable to recover EAD and brains from any larval stage. The fixation and staining protocol for imaginal discs works with a number of transgenic reporters and antibodies that recognize Drosophila proteins. The protocol for RNA isolation can be applied to various larval organs, whole larvae, and adult flies. Total RNA can be used for profiling of gene expression changes using candidate or genome-wide approaches. Finally, we detail a method for quantifying invasiveness of the clonal tumors. Although this method has limited use, its underlying concept is broadly applicable to other quantitative studies where cognitive bias must be avoided.

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

This protocol demonstrates how to generate fluorescently marked, genetically defined clonal tumors in the Drosophila eye/antennal imaginal discs (EAD). It describes how to dissect the EAD and brain from the third instar larvae and how to process them to visualize and quantify gene expression changes and tumor invasiveness.

o<em&gt; Drosophila</em&gt; Imaginal Modelo Disc Tumor: visualização e quantificação da expressão gênica e invasão tumoral Usando Mosaicos Genéticos

Drosophila melanogaster has emerged as a powerful experimental system for functional and mechanistic studies of tumor development and progression in the ...

Pesquisa do câncer

Evaporation-reducing Culture Condition Increases the Reproducibility of Multicellular Spheroid Formation in Microtiter Plates

Tumor models that closely imitate in vivo conditions are becoming increasingly popular in drug discovery and development for the screening of potential anti-cancer drugs. Multicellular tumor spheroids (MCTSes) effectively mimic the physiological conditions of solid tumors, making them excellent in vitro models for lead optimization and target validation. Out of the various techniques available for MCTS culture, the liquid-overlay method on agarose is one of the most inexpensive methods for MCTS generation. However, the reliable transfer of MCTS cultures using liquid-overlay for high-throughput screening may be compromised by a number of limitations, including the coating of microtiter plates (MPs) with agarose and the irreproducibility of uniform MCTS formation across wells. MPs are significantly prone to edge effects that result from excessive evaporation of medium from the exterior of the plate, preventing the use of the entire plate for drug tests. This manuscript provides detailed technical improvements to the liquid-overlay technique to increase the scalability and reproducibility of uniform MCTS formation. Additionally, details on a simple, semi-automatic, and universally applicable software tool for the evaluation of MCTS features after drug treatment is presented.

The uneven loss of medium from microtiter plates affects the reproducibility of uniform multicellular tumor spheroid formation. Improving culture conditions to reduce significant medium loss will improve the reproducibility of spheroid formation and the results of spheroid-based assays using the liquid-overlay technique.

A evaporação de redução de Cultura condição aumenta a reprodutibilidade da Formação multicelular esferoidal em placas de microtitulação

Tumor models that closely imitate in vivo conditions are becoming increasingly popular in drug discovery and development for the screening of potential ...

A Unified Methodological Framework for Vestibular Schwannoma Research

Vestibular schwannomas are the most common neoplasms of the cerebellopontine angle, making up 6-8% percent of all intracranial growths. Though these tumors cause sensorineural hearing loss in up to 95% of affected individuals, the molecular mechanisms underlying this hearing loss remain elusive. This article outlines the steps established in our laboratory to facilitate the collection and processing of various primary human tissue samples for downstream research applications integral to the study of vestibular schwannomas. Specifically, this work describes a unified methodological framework for the collection, processing, and culture of Schwann and schwannoma cells from surgical samples. This is integrated with parallel processing steps now considered essential for current research: the collection of tumor and nerve secretions, the preservation of RNA and the extraction of protein from collected tissues, the fixation of tissue for the preparation of sections, and the exposure of primary human cells to adeno-associated viruses for application to gene therapy. Additionally, this work highlights the translabyrinthine surgical approach to collect this tumor as a unique opportunity to obtain human sensory epithelium from the inner ear and perilymph. Tips to improve experimental quality are provided and common pitfalls highlighted.

The goal of this protocol is to outline the collection and processing of human surgical samples for multiple downstream applications in vestibular schwannoma and Schwann cell research.

Um quadro metodológico unificado para pesquisa de Schwannoma vestibular

Vestibular schwannomas are the most common neoplasms of the cerebellopontine angle, making up 6-8% percent of all intracranial growths. Though these ...

Moving Upwards: A Simple and Flexible In Vitro Three-dimensional Invasion Assay Protocol

Although 3D invasion assays have been developed, the challenge remains to study cells without affecting the integrity of their microenvironment. Traditional 3D assays such as the Boyden Chamber require that cells are displaced from the original culture location and moved to a new environment. Not only does this disrupt the cellular processes that are intrinsic to the microenvironment, but it often results in a loss of cells. These problems are especially challenging when dealing with cells that are either rare, or extremely sensitive to their microenvironment. Here, we describe the development of a 3D invasion assay that avoids both concerns. In this assay, cells are plated within a small well and an ECM matrix containing a chemoattractant is laid atop the cells. This requires no cell displacement, and allows the cells to invade upwards into the matrix. In this assay, cell invasion as well as cell morphology can be assessed within the collagen gel. Using this assay, we characterize the invasive capacity of rare and sensitive cells; the hybrid cells resulting from fusion between breast cancer cells MCF7 and mesenchymal/multipotent stem/stroma cells (MSCs).

Moving Upwards: A Simple and Flexible In Vitro Three-dimensional Invasion Assay Protocol

This protocol describes an inverted vertical invasion assay that could be used to quantify the migration and invasion capabilities of cells in a three-dimensional setting while preserving the cell microenvironment. This assay is suitable for rare and/or sensitive cells.

Se movendo para cima: Um simples e flexível em Vitro invasão tridimensional protocolo do ensaio

Although 3D invasion assays have been developed, the challenge remains to study cells without affecting the integrity of their microenvironment. ...

Phosphopeptide Enrichment Coupled with Label-free Quantitative Mass Spectrometry to Investigate the Phosphoproteome in Prostate Cancer

Phosphoproteomics involves the large-scale study of phosphorylated proteins. Protein phosphorylation is a critical step in many signal transduction pathways and is tightly regulated by kinases and phosphatases. Therefore, characterizing the phosphoproteome may provide insights into identifying novel targets and biomarkers for oncologic therapy. Mass spectrometry provides a way to globally detect and quantify thousands of unique phosphorylation events. However, phosphopeptides are much less abundant than non-phosphopeptides, making biochemical analysis more challenging. To overcome this limitation, methods to enrich phosphopeptides prior to the mass spectrometry analysis are required. We describe a procedure to extract and digest proteins from tissue to yield peptides, followed by an enrichment for phosphotyrosine (pY) and phosphoserine/threonine (pST) peptides using an antibody-based and/or titanium dioxide (TiO2)-based enrichment method. After the sample preparation and mass spectrometry, we subsequently identify and quantify phosphopeptides using liquid chromatography-mass spectrometry and analysis software.

This protocol describes a procedure to extract and enrich phosphopeptides from prostate cancer cell lines or tissues for an analysis of the phosphoproteome via mass spectrometry-based proteomics.

Enriquecimento de Fosfopeptida acoplado com espectrometria de massa livre de rótulo quantitativa para investigar o Phosphoproteome no câncer de próstata

Phosphoproteomics involves the large-scale study of phosphorylated proteins. Protein phosphorylation is a critical step in many signal transduction ...

Detection of Lung Tumor Progression in Mice by Ultrasound Imaging

With ~1.6 million victims per year, lung cancer contributes tremendously to the worldwide burden of cancer. Lung cancer is partly driven by genetic alterations in oncogenes such as the KRAS oncogene, which constitutes ~25% of lung cancer cases. The difficulty in therapeutically targeting KRAS-driven lung cancer partly stems from having poor models that can mimic the progression of the disease in the lab. We describe a method that permits the relative quantification of primary KRAS lung tumors in a Cre-inducible LSL-KRAS G12D mouse model via ultrasound imaging. This method relies on brightness (B)-mode acquisition of the lung parenchyma. Tumors that are initially formed in this model are visualized as B-lines and can be quantified by counting the number of B-lines present in the acquired images. These would represent the relative tumor number formed on the surface of the mouse lung. As the formed tumors develop with time, they are perceived as deep clefts within the lung parenchyma. Since the circumference of the formed tumor is well-defined, calculating the relative tumor volume is achieved by measuring the length and width of the tumor and applying them in the formula used for tumor caliper measurements. Ultrasound imaging is a non-invasive, fast and user-friendly technique that is often used for tumor quantifications in mice. Although artifacts may appear when obtaining ultrasound images, it has been shown that this imaging technique is more advantageous for tumor quantifications in mice compared to other imaging techniques such as computed tomography (CT) imaging and bioluminescence imaging (BLI). Researchers can investigate novel therapeutic targets using this technique by comparing lung tumor initiation and progression between different groups of mice.

This protocol describes the steps taken to induce KRAS lung tumors in mice as well as the quantification of formed tumors by ultrasound imaging. Small tumors are visualized in early timepoints as B-lines. At later timepoints, relative tumor volume measurements are achieved by the measurement tool in the ultrasound software.

Detecção de Progressão do Tumor Pulmonar em Camundongos por ultrassom

With ~1.6 million victims per year, lung cancer contributes tremendously to the worldwide burden of cancer. Lung cancer is partly driven by genetic ...

In Vitro Evaluation of Oncogenic Transformation in Human Mammary Epithelial Cells

Tumorigenesis is a multi-step process in which cells acquire capabilities&#160;that allow their growth, survival, and dissemination under hostile conditions. Different tests seek to identify and quantify these hallmarks of cancerous cells; however, they often focus on a single aspect of cellular transformation and, in fact, multiple tests are required for their proper characterization. The purpose of this work is to provide researchers with a set of tools to assess cellular transformation in vitro from a broad perspective, thereby making it possible to draw sound conclusions.
A sustained proliferative signaling activation is the major feature of tumoral tissues and can be easily monitored under in vitro conditions by calculating the number of population doublings achieved over time. Besides, the growth of cells in 3D cultures allows their interaction with surrounding cells, resembling what occurs in vivo. This enables the evaluation of cellular aggregation and, together with immunofluorescent labeling of distinctive cellular markers, to obtain information on another relevant feature of tumoral transformation: the loss of proper organization. Another remarkable characteristic of transformed cells is their capacity to grow without attachment to other cells and to the extracellular matrix, which can be evaluated with the anchorage assay.
Detailed experimental procedures to evaluate cell growth rate, to perform immunofluorescent labeling of cell lineage markers in 3D cultures, and to test anchorage-independent cell growth in soft agar are provided. These methodologies are optimized for Breast Primary Epithelial Cells (BPEC) due to its relevance in breast cancer; however, procedures can be applied to other cell types after some adjustments.

This protocol provides experimental in vitro tools to evaluate the transformation of human mammary cells. Detailed steps to follow-up cell proliferation rate, anchorage-independent growth capacity, and distribution of cell lineages in 3D cultures with basement membrane matrix are described.

Avaliação In Vitro da Transformação Oncogênica em Células Epiteliais Mamárias Humanas

Tumorigenesis is a multi-step process in which cells acquire capabilities&#160;that allow their growth, survival, and dissemination under hostile ...

Monitoring Breast Cancer Growth and Metastatic Colony Formation in Mice using Bioluminescence

Breast cancer is a frequent heterogeneous malignancy and the second leading cause of mortality in women, mainly due to distant organ metastasis. Several animal models have been generated, including the widely used orthotopic mouse models, where cancer cells are injected into the mammary fat pad. However, these models cannot help monitor tumor growth kinetics and metastatic colonization. Cutting-edge tools to monitor cancer cells in real time in mice will significantly advance the understanding of tumor biology. 
Here, breast cancer cell lines stably expressing luciferase and green fluorescent protein (GFP) were established. Specifically, this technique contains two sequential steps initiated by measuring the luciferase activity in vitro and followed by the implantation of the cancer cells into mammary fat pads of nonobese diabetic-severe combined immunodeficiency (NOD-SCID) mice. After the injection, both the tumor growth and metastatic colonization are monitored in real time by the noninvasive bioluminescence imaging system. Then, the quantification of GFP-expressing metastases in the lungs will be examined by fluorescence microscopy to validate the observed bioluminescence results. This sophisticated system combining luciferase and fluorescence-based detection tools evaluates cancer metastasis in vivo, which has great potential for use in breast cancer therapeutics and disease management.

Here, we describe a noninvasive monitoring method involving luciferase and green fluorescent protein expression in various breast cancer cell lines. This protocol provides a technique to monitor tumor formation and metastatic colonization in real time in mice.

Monitoramento do crescimento do câncer de mama e formação de colônia metastática em camundongos usando bioluminescência

Breast cancer is a frequent heterogeneous malignancy and the second leading cause of mortality in women, mainly due to distant organ metastasis. Several ...

Exploring the Arginine Methylome by Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy

Protein-bound arginine is commonly methylated in many proteins and regulates their function by altering the physicochemical properties, their interaction with other molecules, including other proteins or nucleic acids. This work presents an easily implementable protocol for quantifying arginine and its derivatives, including asymmetric and symmetric dimethylarginine (ADMA and SDMA, respectively) and monomethyl arginine (MMA). Following protein isolation from biological body fluids, tissues, or cell lysates, a simple method for homogenization, precipitation of proteins, and protein hydrolysis is described. Since the hydrolysates contain many other components, such as other amino acids, lipids, and nucleic acids, a purification step using solid-phase extraction (SPE) is essential. SPE can either be performed manually using centrifuges or a pipetting robot. The sensitivity for ADMA using the current protocol is about 100 nmol/L. The upper limit of detection for arginine is 3 mmol/L due to SPE saturation. In summary, this protocol describes a robust method, which spans from biological sample preparation to NMR-based detection, providing valuable hints and pitfalls for successful work when studying the arginine methylome.

The present protocol describes the preparation and quantitative measurement of free and protein-bound arginine and methyl-arginines by 1H-NMR spectroscopy.

Explorando o metiloma de arginina por espectroscopia de ressonância magnética nuclear

Protein-bound arginine is commonly methylated in many proteins and regulates their function by altering the physicochemical properties, their interaction ...

Simultaneous Imaging and Flow-Cytometry-based Detection of Multiple Fluorescent Senescence Markers in Therapy-Induced Senescent Cancer Cells

Chemotherapeutic drugs can induce irreparable DNA damage in cancer cells, leading to apoptosis or premature senescence. Unlike apoptotic cell death, senescence is a fundamentally different machinery restraining&#160;propagation of cancer cells. Decades of scientific studies have revealed the complex pathological effects of senescent cancer cells in tumors and microenvironments that modulate cancer cells and stromal cells. New evidence suggests that senescence is a potent prognostic factor during cancer treatment, and therefore rapid and accurate detection of senescent cells in cancer samples is essential. This paper presents a method to visualize and detect therapy-induced senescence (TIS) in cancer cells. Diffuse large B-cell lymphoma (DLBCL) cell lines were treated with mafosfamide (MAF) or daunorubicin (DN) and examined for the senescence marker, senescence-associated &#946;-galactosidase (SA-&#946;-gal), the DNA synthesis marker 5-ethynyl-2&#8242;-deoxyuridine (EdU), and the DNA damage marker gamma-H2AX (&#947;H2AX). Flow cytometer imaging can help generate high-resolution single-cell images in a short period of time to simultaneously visualize and quantify the three markers in cancer cells.

Here we present a flow cytometry-based method for visualization and quantification of multiple senescence-associated markers in single cells.

Detecção simultânea baseada em imagens e flutometria de marcadores de senescência fluorescentes múltiplas em células cancerígenas senescentes induzidas por terapia

Chemotherapeutic drugs can induce irreparable DNA damage in cancer cells, leading to apoptosis or premature senescence. Unlike apoptotic cell death, ...