이 연구 보조금에 의해 지원 되었다 아니. 캘리포니아-81301 국립 암 연구소에서. 우리 편집 지원에 대 한 칼 슨 밥, 박사 피터 Villalta 프리메이슨 암 센터의 분석 생화학 공유 리소스에서 질량 분석에 쉰 밍 박사 아담 T. Zarth 그리고 그들의 귀중 한 토론에 대 한 박사 안 나 공화국 미셸 감사 합니다. 그리고 입력. 분석 생화학 공유 리소스는 부분적으로 지원 하 여 국립 암 연구소 암 센터 지원 그랜트 CA-77598

1. 자료 및 일반 절차 <ol><li>종합 NNN 앞 15에서 설명한. Norcotinine, P450 2A6 Baculosomes, NADPH 재생 시스템, 0.5 x 반응 버퍼, 및 다른 모든 화학 시 약 급료에 상용 소스 로부터 용 매 또는.</li>
	<li>500 MHz 분석기에 기록 NMR 스펙트럼. 보고서 화학 당 부품으로 교대 백만 (ppm). 잔류 용 매 피크를 사용 하 여 내부 참조 1 H NMR (7.26 ppm CDCl 3)와 13 C NMR (77.2 ppm CDCl 3). 
	참고: 피크 분할은 다음과 같은 약어를 사용 하 고 있다: s 내의 d = 더블 릿, dd = = 남자, dt의 남자 용 상의 삼중 항, dq의 더블 릿 = 사중주, ddd의 더블 릿 = = 남자, 그리고 m의 남자 용 상의의 더블 릿 multiplet =.</li>
	<li>LTQ Orbitrap Velos와 m/z로 보고서 데이터에 선택 된 화합물에 대 한 고 분해능 질량 분석 (HRMS) 수행.</li>
	<li>사용 polygram 미리 254 nm 형광 표시기 얇은 층 크로마토그래피 (TLC)와 실리 카 젤 TLC 판 (40 m m x 80 m m, 두께 0.2 m m) 코팅. UV 램프 조사 하 여 TLC 번호판을 시각화.</li>
	<li>1.5 cm x 15 cm 유리 열을 사용 하 여 Å, 70-150 메쉬 실리 카 젤 60에 플래시 크로마토그래피를 수행.</li>
</ol> 2. Nitrosamide 긍정적인 통제의 준비 (N &#8242;-nitrosonorcotinine, NNC) <ol><li>건조, 하룻밤 오븐에서 (16 h, ~ 140 ° C), 25 mL, 둥근 바닥 플라스 크 자기 볶음 bar가 포함 된. 아침에 차가운 흐름의 N 2 N 2 흐름을 유지 하는 석유 bubbler를 사용 하는 동안 플라스 크 속도 초당 1 개 거품. 
	참고: 냉각 후, 아무 주의 N 2 플라스 크를 유지 하는 필요.</li>
	<li>연기 후드, norcotinine (31.8 mg, 0.196 mmol), 아세트산 무수 물 (5 mL), 및 초 산 (1 mL)을 추가 냉각된 플라스 크. 지속적으로 물이 얼음 욕조와 0 ° C에 냉각 하는 동안이 혼합물을 저 어. 
	주의: 아세트산 무수 물과 아세트산은 부식성.</li>
	<li>추가 나노 2 (33.3 mg, 0.483 mmol) 한 부분을 지속적으로 2.5 h. TLC에 의해 모니터 반응 진행에 대 한 혼합물을 저 어 (100 %EtOAc, R f = 0.19, 단계 1.4 참조). 
	참고:이 시간이 지남에 혼합 될 것입니다 점점 노란색 가끔 버블링.</li>
	<li>(18 mL) 얼음 처럼 차가운 H 2 O로 혼합물을 붓는 의해 반응을 끄다. 바로 채널 2 Cl 2 100 mL separatory 깔때기에 18 mL와 용액을 추출 합니다. 추출 물의 레이어 채널 2 Cl 2 (각 9 mL)와 적어도 2 추가 시간.</li>
	<li>풀링된 생명체 2 분 필터 MgSO 4 이상 ~ 100 mg을 건조 하 고 원유, 노랑, 석유를 회전 증발에 의해 솔루션을 집중. 증발 잔류 초 산을 제거 하는 동안 30 ° C에 물 목욕 열. 
	참고: 프로토콜 일시 중지할 수 있습니다 여기 화합물 채널 2 Cl 2와 2-8 ° c.에 어둠 속에 저장 하는 솔루션에 용 해 하는 경우</li>
	<li>칼럼 크로마토그래피에 의해 원유 화합물 정화 (단계 1.5 참조) 실리 카 젤을 사용 하 여 고정 위상 및 100%로 EtOAc eluent 16. 
	주의: NNC와 관련된 nitrosamides 처리 주의 그들은 인간의 발암 물질로 간주 됩니다.</li>
	<li>CDCl 3 순수 화합물을 녹이 고 NMR을 사용 하 여 (단계 1.2 참조) 구조를 확인 하 고이 솔루션 17의 몰 확인 하. 2-8 ° C까지 필요에 어둠 속에서이 솔루션을 저장. 
	참고:이 솔루션 (3.5 단계)의 체 외에 분석 결과에 긍정적인 컨트롤로 사용 됩니다. NMR 스펙트럼 및 화학 교대 지원 정보에서 사용할 수 있습니다.</li>
	<li>순수한 NNC 솔루션으로는 정확한 확인 질량 부모 고 1.3 및 4.3 단계에서 설명 하는 매개 변수에서 고해상도 질량 분 서 계 (HRMS)에 직접 주입 하 여 제품 이온 대중의 결정. 
	참고: 제품 질량 체 외에 대사 분석 결과 (4.3 단계)에서 화합물 검출을 위해 사용 됩니다.</li>
</ol> 3. 예제 nitrosamine P450 생체 외에서 부 화 <ol><li>-80 ° C 냉동 고에서 P450 2A6 Baculosomes, 생생한 NADPH 재생 시스템, 그리고 10 mM NADP + 재고 솔루션을 제거 하 고 얼음에 녹여 그들. 일단 해 동, 희석 Baculosomes 및 NADPH 재생 시스템 1: 10과 1:50, 0.5 X 반응 버퍼 단일 1 mL 튜브에 각각. 마찬가지로, 추가 반응 버퍼 X + 재고 솔루션 0.5 97 μ를 NADP의 3 μ. 
	참고: NADP +은 빛에 민감한입니다. 이 솔루션의 컨테이너 알루미늄 호 일에 감싸서 보호 유지. 효소 솔루션은 민감한 freeze-thaw 주기; 이 2 개 이상의 주기를 제한 합니다. Aliquots 미래 실험을 위한 필요에 따라 준비.</li>
	<li>각 보육에 대 한 추가 50 μ 효소 솔루션 (5 pmol P450 포함) 1 mL의 튜브 반응 버퍼와 4 μ M NNN 솔루션의 포함 40 μ. 미리 물을 욕조를 사용 하 여 37 ° C에서 2 분에 대 한이 새로운 혼합물을 품 어 고 희석된 NADP + 솔루션의 10 μ를 추가 합니다. 37에 1-30 분에 대 한 전체 시스템을 품 어 ° c. 
	참고: 보육 시간 5 분 간격을 사용 하 여 (예: 5, 10, 15 분, 등) 충분 한 nitrosamide 형성 시간 코스를 제공 합니다.</li>
	<li>원하는 보육 시간 후 3.0 N ZnSO 4의 첫 번째 추가 10 μ와 3.0 N Ba(OH)의 다음 10 μ 끄다 2. 소용돌이이 솔루션 및 백색 침전 물은 형성할 것 이다. 원심 침전 작은 4 분 8000 x g에서 샘플. 
	참고: 절차 해야 하지 일시 중지이 단계에서 수성 해결책에 있는 안정성을 제한 하는 구성 된 nitrosamides로 합니다. 허위 제외 어 긴 일시 중지 될 수 있습니다.</li>
	<li>즉시는 상쾌한 플라스틱 및 액체 크로마토그래피 긍정적인 nanoelectrospray-이온화 고해상도 탠덤 질량 분석에 의해 2 μ를 분석 (LC-NSI +-HRMS/MS, 4.1 4.3 단계).</li>
	<li>긍정적인 제어 외피에 대 한 흐름의 N 2 1 mL 튜브에 합성된 NNC 솔루션의 100 fmol을 포함 하는 약 수를 증발. 이 유리병에 3.2 단계에서 전체 효소 시스템을 추가 하 고 3.3-3.4 단계에 설명 된 대로 진행.</li>
	<li>부정적인 제어 외피 수행 실험 설명된 (3.2-3.4 단계)로 바꾸기는 50 μ 효소 반응 버퍼 X 0.5 솔루션 제외.</li>
</ol> 4. LC-NSI +에 의해 nitrosamide 탐지에 대 한 매개 변수 예제-HRMS/MS <ol><li>LC에 대 한 구성 요소를 사용 하는 상업, 손 포장 18 C18 UPLC 시스템 단계 4.2에서에서 다음과 같은 여러 단계로 그라데이션 적용 (5 μ m), 100 m m x 75 μ m, 15 μ m 구멍 모 세관 칼럼.</li>
	<li>용 매와 용 매 b MeCN로 사용 하 여 5 mM NH 4 OAc 1 μ/분 5 %B 실행 하 여 열에 샘플을 로드 0-5 분, 그리고 다음 이후에 0.3 μ/분 유량을 둔화. 다음, 실행 그라디언트 5에서 20% 이상 4 분, 55% B 10 분 이상 램프 및 다음 5%를 다시 평형 b.</li>
	<li>수행 LC NSI +-LTQ Orbitrap에 HRMS/MS. 전체 검사와 MS 2 조각화 NNC 위한 모니터. 60, 000의 해상도에서 전체 검사를 수행 하 고 5 ppm의 대량 허용에 정확한 부모 질량 (192.07670)를 추출 합니다. 격리 하 부모 이온 (2.0 amu) 및 조각 충돌 유도 된 분리 (CID) 충돌 에너지 25 eV, 15000의 해상도의 여 고 30 양의 시간을 스캔 사용 MS 2 조각화 추출 NNC (m/z의 제품 이온에 대 한 정확한 질량 192 m/z 134.04739와 162.07874) 5 ppm의 대량 허용 오차에서.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Rom, W. N., Markowitz, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Environmental and Occupational Medicine. , 1226-1239 (2007).</li><li>Preussmann, R., Stewart, B. W., Searle, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Chemical Carcinogens, ACS Monograph 182. 2, 643-828 (1984).</li><li>Magee, P. N., Montesano, R., Preussmann, R., Searle, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Chemical Carcinogens. ACS monograph 173. , 491-625 (1976).</li><li>Zhu, A. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alaska+Native+smokers+and+smokeless+tobacco+users+with+slower+CYP2A6+activity+have+lower+tobacco+consumption,+lower+tobacco-specific+nitrosamine+exposure+and+lower+tobacco-specific+nitrosamine+bioactivation.">Alaska Native smokers and smokeless tobacco users with slower CYP2A6 activity have lower tobacco consumption, lower tobacco-specific nitrosamine exposure and lower tobacco-specific nitrosamine bioactivation.</a> Carcinogenesis. 34 (1), 93-101 (2013).</li><li>Mesi&#263;, M., Revis, C., Fishbein, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+structure+on+the+reactivity+of+alpha-hydroxydialkynitrosamines+in+aqueous+solutions.">Effects of structure on the reactivity of alpha-hydroxydialkynitrosamines in aqueous solutions.</a> J. Am. Chem. Soc. 118, 7412-7413 (1996).</li><li>Mochizuki, M., Anjo, T., Okada, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+N-alkyl-N-+(hydroxymethyl)nitrosamines+from+N-alkyl-N-+(hydroperoxymethyl)nitrosamines+by+deoxygenation.">Isolation and characterization of N-alkyl-N- (hydroxymethyl)nitrosamines from N-alkyl-N- (hydroperoxymethyl)nitrosamines by deoxygenation.</a> Tetrahedron Lett. 21, 3693-3696 (1980).</li><li>Guttenplan, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+cytosol+on+mutagenesis+induced+by+N-nitrosodimethylamine,+N-nitrosomethylurea+and+&#224;-acetoxy-N-nitrosodimethylamine+in+different+strains+of+Salmonella:evidence+for+different+ultimate+mutagens+from+N-nitrosodimethylmine.">Effects of cytosol on mutagenesis induced by N-nitrosodimethylamine, N-nitrosomethylurea and &#224;-acetoxy-N-nitrosodimethylamine in different strains of Salmonella:evidence for different ultimate mutagens from N-nitrosodimethylmine.</a> Carcinogenesis. 14, 1013-1019 (1993).</li><li>Elespuru, R. K., Saavedra, J. E., Kovatch, R. 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E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CYP2A6-+and+CYP2A13-catalyzed+metabolism+of+the+nicotine+delta5'(1')iminium+ion.">CYP2A6- and CYP2A13-catalyzed metabolism of the nicotine delta5'(1')iminium ion.</a> J. Pharmacol. Exp. Ther. 343 (2), 307-315 (2012).</li><li>Bell-Parikh, L. C., Guengerich, F. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetics+of+cytochrome+P450+2E1-catalyzed+oxidation+of+ethanol+to+acetic+acid+via+acetaldehyde.">Kinetics of cytochrome P450 2E1-catalyzed oxidation of ethanol to acetic acid via acetaldehyde.</a> J Biol Chem. 274 (34), 23833-23840 (1999).</li><li>Chowdhury, G., Calcutt, M. W., Nagy, L. D., Guengerich, F. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidation+of+methyl+and+ethyl+nitrosamines+by+cytochrome+P450+2E1+and+2B1.">Oxidation of methyl and ethyl nitrosamines by cytochrome P450 2E1 and 2B1.</a> Biochemistry. 51 (50), 9995-10007 (2012).</li><li>Chowdhury, G., Calcutt, M. W., Guengerich, F. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidation+of+N-nitrosoalkylamines+by+human+cytochrome+P450+2A6:+sequential+oxidation+to+aldehydes+and+carboxylic+acids+and+analysis+of+reaction+steps.">Oxidation of N-nitrosoalkylamines by human cytochrome P450 2A6: sequential oxidation to aldehydes and carboxylic acids and analysis of reaction steps.</a> J Biol Chem. 285 (11), 8031-8044 (2010).</li><li>Carlson, E. S., Upadhyaya, P., Hecht, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+nitrosamide+formation+in+the+cytochrome+P450-mediated+metabolism+of+tobacco-specific+nitrosamines.">Evaluation of nitrosamide formation in the cytochrome P450-mediated metabolism of tobacco-specific nitrosamines.</a> Chem Res Toxicol. 29 (12), 2194-2205 (2016).</li><li>Amin, S., Desai, D., Hecht, S. S., Hoffmann, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+tobacco-specific+N-nitrosamines+and+their+metabolites+and+results+of+related+bioassays.">Synthesis of tobacco-specific N-nitrosamines and their metabolites and results of related bioassays.</a> Crit. Rev. Toxicol. 26, 139-147 (1996).</li><li>Clark, A. G., Wong, S. 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F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Importance+of+purity+evaluation+and+the+potential+of+quantitative+(1)H+NMR+as+a+purity+assay.">Importance of purity evaluation and the potential of quantitative (1)H NMR as a purity assay.</a> J Med Chem. 57 (22), 9220-9231 (2014).</li><li>van der Heeft, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microcapillary+column+switching+HPLC-electrospray+ionization+MS+system+for+the+direct+identification+of+peptides+presented+by+major+histocompatibility+complex+class+I+molecules.">A microcapillary column switching HPLC-electrospray ionization MS system for the direct identification of peptides presented by major histocompatibility complex class I molecules.</a> Anal Chem. 70 (18), 3742-3751 (1998).</li><li>White, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Chemistry+of+the+N-Alkyl-N-nitrosoamides.+I.+Methods+of+Preparation.">The Chemistry of the N-Alkyl-N-nitrosoamides. I. Methods of Preparation.</a> J. Am. Chem. Soc. 77, 6008-6010 (1955).</li><li>Patten, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+cytochrome+P450+2A6+and+3A4+as+major+catalysts+for+N'-nitrosonornicotine+alpha-hydroxylation+by+human+liver+microsomes.">Evidence for cytochrome P450 2A6 and 3A4 as major catalysts for N'-nitrosonornicotine alpha-hydroxylation by human liver microsomes.</a> Carcinogenesis. 18, 1623-1630 (1997).</li><li>Wong, H. L., Murphy, S. E., Hecht, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytochrome+P450+2A-catalyzed+metabolic+activation+of+structurally+similar+carcinogenic+nitrosamines:+N'-nitrosonornicotine+enantiomers,+N-nitrosopiperidine,+and+N-nitrosopyrrolidine.">Cytochrome P450 2A-catalyzed metabolic activation of structurally similar carcinogenic nitrosamines: N'-nitrosonornicotine enantiomers, N-nitrosopiperidine, and N-nitrosopyrrolidine.</a> Chem. Res. Toxicol. 18, 61-69 (2004).</li><li>Hecht, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemistry,+biology,+and+carcinogenicity+of+tobacco-specific+N-nitrosamines.">Biochemistry, biology, and carcinogenicity of tobacco-specific N-nitrosamines.</a> Chem. Res. Toxicol. 11, 559-603 (1998).</li><li>von Weymarn, L. B., Zhang, Q. Y., Ding, X., Hollenberg, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+8-methoxypsoralen+on+cytochrome+P450+2A13.">Effects of 8-methoxypsoralen on cytochrome P450 2A13.</a> Carcinogenesis. 26 (3), 621-629 (2005).</li></ol>

저자는 공개 없다.

니트로의 신진 대사를 elucidating 그들의 성에 이해 하는 중요 한 구성 요소입니다. 이기 때문에 관련 된 시 토 크롬 P450s와 다른 대사 효소 다형, 더욱이 지식을 응용 프로그램 식별할 수 있는 잠재적으로 위험이 높은 개인1,4. 새로운 데이터의 α-hydroxynitrosamines, DNA 바인딩에 관련 된 니트로의 추정된 주요 대사 산물을 더 산화, nitrosamides 하는 것은 가능 합니다; 그러나, 이것은 엄격 하 게 테스트 되지 기판의 넓은 범위에 걸쳐. 우리는 nitrosamides 체 외에 니트로의 processive 산화의 정도 결정 하기 위한 프로토콜을 설명 했습니다. 이 방법의 다양 한 응용 물질 대사의이 루트의 전반적인 중요성을 결정 하는 데 도움이 됩니다.
메서드는 표준 관심의 nitrosamide에 대 한 준비 하 여 시작 합니다. 예를 들어 연구에서는 NNC, 담배 발암 물질 NNN, 담배 제품14,22에 발암 물질의 가설된 대사 산물입니다. 설명 했 듯이, norcotinine의 니트로 뚜렷한 측면 제품을 원활 하 게 진행 됐다. 원유 제품만 시작 아 미드와 초 산, 열 착 색 인쇄기에 의해 쉽게 제거 했다에 의해 오염 되었다. 이것은 NMR와 HRMS 구조의 확인에 의해 선행 되었다. 이 방법의 장점은 조사를 여러 nitrosamine/nitrosamide 시스템을 수 있는 거의 모든 아 미드에 대 한 적합 하다는 것입니다. 또한, 정량에 대 한 NMR의 사용 표준 솔루션17몰의 직접 측정을 제공합니다. 역 상 HPLC 등 파괴적인 기술에 의해 불활성 조건 보다는 필요한 측정에서 화합물의 저장 수 있습니다. 그런 다음 다양 한 희석 실험 디자인에 맞게 만들 수 있습니다.
긍정적인 통제와 잘 특징이 대량 조각 패턴, 매우 민감하고 선택적 LC-NSI+-HRMS/MS 메서드는 비교적 복잡 한 행렬에 nitrosamides의 검색을 수 있습니다. 같이, 메서드는 1-10 nM 또는 2-20 fmol에 열 시작 nitrosamine, 효소, 다른 공동 인자 1000-fold 초과도 불구 하 고 NNC 농도 추정. 감도 및 선택 방법의 모니터링, 어떤 표준 LC-MS 시스템 부족 높은 해상도의 사용 예정 이다. 5 ppm 대량 공차와 부모 이온 선택 원하는 분자 공식으로 화합물만 격리 됩니다 보장 합니다. 마찬가지로, 그들의 보존 기간에 따라 두 가지 가장 풍부한 제품 이온의 정확한 질량 감지 추가 분석 확인을 제공합니다. 이 때문에, 질량 분석 방법은 많은 매개 변수 격리 너비, 충돌 에너지 및 검색 시간을 포함 하 여 최적화 된 필요 합니다. LC 그라데이션 또한 다른 물질과 공동 차입 작성 이온 트랩 대상 nitrosamide 제한으로 감도 개선 하기 위해 수정할 수 있습니다.
예를 들어 연구14, NNC 형성 사소한 했다. NNC는 대량 지역에 따라, ~ 4000-fold 적은 α-hydroxyNNN21의 분해 제품 보다 풍부. 이 나타내는 NNC는 NNN의 아주 사소한 대사 산물, 다른 시스템 다 수 있습니다. 게 외. dimethylnitrosamine 및 diethylnitrosamine;의 상당한, processive 산화를 발견 그러나, nitrosamide 중간 그들의 조건12에서 감지 되지 않았습니다. 여기에 설명 된 기술에 의해 그들의 시스템을 reanalyzing nitrosamide 형성을 계시 할 수 있었다 가능 하다. 그들의 형성 수준에 α-hydroxynitrosamines에 비해 nitrosamides의 높은 안정성으로 그들은 더 쉽게 셀을 전송 한다 이러한 화합물은 생물 학적 중요성을 나타낼 수 있습니다.
이 메서드는 대부분 nitrosamine 효소 시스템에 적용 될 것입니다, 하지만 몇 가지 제한이 있습니다. 가장 중요 한 것은 메서드는 양적. 예를 들어 실험에서 형성 긍정적인 컨트롤 샘플의 대량 spectrometric 피크 지역에서 추정 되었다. 보다 정확한 측정을 위해 isotopically 이라는 nitrosamide를 활용 하 여 동위 원소 희석 방법 개발 될 수 있습니다. 또 다른 방법은 N-acetyllysine 또는 N-진, 같은 화합물으로 트래핑 전략을 구현할 것 이라고 하지만이 우리의 손에14날짜에 실패 했다.
또 다른 한계는 nitrosamides의 경향을 쉽게9; 따라서 샘플을 개별적으로 처리 해야 합니다. 이 워크플로 속도가 느려집니다 하 고 샘플 분석에 대 한 공동 작업자를 전송 하지 않도록 합니다. 마지막으로, 그 시 토 크롬 P450 2A6 그리고 많은 다른 상업적으로 사용할 수 있지만, 일부 필요 단백질 표정과 정화를 주목 한다. 예,이 분석 결과 시 토 크롬 P450 2A1314에 적용 했다 하지만 그것은 엄격한 격리 프로세스23후 사용할 수만.
요약, 우리는 nitrosamides 시 토 크롬 P450 촉매 산화 니트로 체 외에서 발생을 탐지 하기 위한 프로토콜을 설명 했습니다. 프로토콜에는 긍정적인 제어 및 생체 외에서 시 토 크롬 P450 물질 대사 분석 결과 검색에 대 액정-NSI+-HRMS/MS를 사용 nitrosamide 표준에 대 한 일반적인 합성 포함 되어 있습니다. 예 연구에 NNC는 모든 외피까지 NNN의 사소한 대사 산물 뿐 아니라 1-10 분에서 시간에 검색 되었습니다. 다른 니트로에이 프로토콜의 응용 프로그램의 일반 및 nitrosamine 발암에 nitrosamides의 잠재적인 역할을 평가할 것입니다.

N-니트로 사 민 다이어트, 담배 제품 및 일반 환경;에 있는 발암 물질의 큰 클래스는 1인체에서를 endogenously 형성 수 있습니다 또한. 이상의 300 N-nitroso 화합물 테스트 및 &#62; 90%에서 발암 성 평가 했다 동물 모델2,3. 그들의 성에 전시, 먼저이 화합물 시 토 크롬 P450s1,,23에 의해 작동 한다. 연구는 시 토 크롬 P450s 쉽게 산화 α-hydroxynitrosamines (그림 1)는 ~ 5의 반감기와 반응성이 매우 높은 화합물에 니트로 자발적으로 alkyldiazohydroxides를 분해 하기 전에 s. 후자는 H2O N2의 손실 후에 DNA을 알 수 있습니다. 결과 DNA adducts unrepaired, 암 개발1이어질 중요 onco-또는 종양 억제기 유전자는 돌연변이 일으킬 수 있습니다. 이러한 이유로, 많은 노력 변화 통로의 완전 한 이해를 얻으려고 소비 되어, DNA adducts, 그리고 발암 성 니트로의 시 토 크롬 P450 산화의 다운스트림 대사 산물. 이 지식에 개별 암 위험 평가4잠재적인 응용 프로그램 합니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56312/56312fig1.jpg"> 
그림 1: 일반 및 니트로의 제안 된 대사. (1) 니트로 P450s α-hydroxynitrosamines (2) 자발적으로 alkyldiazohydroxides (3)을 분해 하는에 산화 됩니다. 이러한 화합물 형태로 DNA adducts DNA에 바인딩할 수 있습니다. 그것을 가정 했다 그 2 는 nitrosamides 4P450s에 의해 더 산화 된다. 이러한 형태로 소설 DNA adducts 또는 3 알려진된 DNA adducts 형태로 분해 DNA에 직접 바인딩할 수 있습니다. R1 과 R2 알 킬 그룹을 나타냅니다. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56312/56312fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
Α-hydroxynitrosamine 가설을 단단하게 광범위 한 데이터에 의해 지원 됩니다, 하지만 몇 가지 불일치;는 주요 것은 α-hydroxynitrosamines5,6의 짧은 반감기 이다. 이러한 화합물 바인딩과 그물 막에 생산 고 나중 핵 DNA를 알 알려져 있다. 몇 초 그들의 일생을 감안할 때, 그것은 어떻게 이러한 중간체 살아남을 필요한 여행 하지만 cytosol 수수께끼 이다. 하나의 가설은 이다 α-hydroxynitrosamines의 부분 산화 processively는 nitrosamides7,8, 비교9에서 매우 안정적입니다. 이것은 아마도 시 토 크롬 P450 활성 사이트에서 α-hydroxynitrosamines의 보존을 통해 발생 합니다. 산화의이 유형에 대 한 전례가 니코틴10, 알콜11, 그리고 간단한 alkylnitrosamines12,13보아 왔다. 또한, nitrosamides는 직접 연기 발암 물질2,3. 9그들의 반응 따라, 이러한 화합물 생산 DNA adducts 함께 새로운 α-hydroxynitrosamines에서 인 동일 하, 미개척된 DNA adducts (그림 1) 추정 된다. 따라서,이 가설 뿐만 아니라 설명 한다 cytosol, 통해 전송 하지만 또한 DNA의 형성 제품 손상.
이 문서에는 생체 외에서 시 토 크롬 P450 중재 변환 니트로의 nitrosamides 평가 하기 위한 일반 프로토콜을 설명 합니다. N ′-nitrosonorcotinine (NNC) 시 토 크롬 P450 2A6에 의해 n ′-nitrosonornicotine (NNN)의 이전에 보고 된 변환 예제14로 전시 됩니다. 다양 한 기질-효소 시스템에이 프로토콜의 응용 프로그램 전반적인 nitrosamine 대사 nitrosamides의 중요성을 결정 하는 데 도움이 됩니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Norcotinine</td>
			<td>AKoS GmbH (Steinen, Germany)</td>
			<td>CAS 17708-87-1, AKoS AK0S006278969</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>695092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic Anhydride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>242845</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>431311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Barium Hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>433373</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Chloroform</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>151823</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC Acetonitrile</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>34998</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Sulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M7506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methylene Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>34856</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Nitrite</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>237213</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ViVid CYP2A6 Blue Screening Kit</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>PV6140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zinc Sulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>221376</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 mL tubes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AB0533</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mL round bottom flask</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z510424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>125 mL Erlenmeyer flask</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS4980125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>125 mL Separatory Funnel</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z261017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mL round bottom flask</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z278262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500 MHz NMR Spectrometer</td>
			<td>Bruker</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Allegra X-22R Centrifuge</td>
			<td>Beckman-Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LC vials</td>
			<td>ChromTech</td>
			<td>CTC&#8211;0957&#8211;BOND</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LTQ Orbitrap Velos</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic Stir bar</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z127035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NMR tube</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z274682</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P1000, P200, and P10 pipettes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotary evaporator</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z691410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RSLCnano UPLC system</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaking Water Bath</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>FSSWB15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stir plate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS6795420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PicoFrit Column</td>
			<td>New Objective</td>
			<td>PF3607515N5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luna C18, 5 um</td>
			<td>Phenomenex</td>
			<td>535913-1</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a general method for detecting nitrosamide formation in the in vitro metabolism of nitrosamines by cytochrome p450s

N-니트로 시 토 크롬 P450 산화 전시 활동을 요구 하는 환경 발암 물질의 기초가 튼튼한 그룹. 대사 활성화의 허용된 메커니즘 저절로 DNA alkylating 에이전트를 분해 하는 α-hydroxynitrosamines의 대형을 포함 한다. DNA 손상의 결과 돌연변이 축적 궁극적으로 암으로 이어질 수 있습니다. 새로운 증거는 α-hydroxynitrosamines 수 수 추가 산화 nitrosamides에 processively 시 토 크롬 P450s에 의해 나타냅니다. Nitrosamides α-hydroxynitrosamines 보다 일반적으로 더 안정 하 고 또한 DNA를 알 수 있습니다, 때문에 nitrosamides 발암에 역할을 재생할 수 있습니다. 이 보고서에서 우리는 니트로의 생체 외에서 시 토 크롬 P450 촉매 물질 대사에서 nitrosamide 생산을 평가 하기 위한 일반 프로토콜을 설명 합니다. 이 프로토콜 관련 nitrosamides 및 생체 외에서 시 토 크롬 P450 물질 대사 분석 결과 검색에 대 한 액체 착 색 인쇄기-nanospray 이온화 높은 해상도 탠덤 질량 분석을 사용 하 여 합성 하는 일반적인 접근 방식을 활용 합니다. 이 방법은 n ′-예제 연구에서 nitrosonornicotine의 작은 대사 산물으로 n ′-nitrosonorcotinine를 감지. 메서드는 높은 감도 및 선택적으로 인해 정확한 대량 검출. 다양 한 nitrosamine-시 토 크롬 P450 시스템에이 방법의 응용이이 변환의 일반 성을 결정 하는 데 도움이 됩니다. 시 토 크롬 P450s 다형성을 활동에서 변화 하기 때문에 개별 암 위험 평가에 도움이 수 nitrosamide 대형의 더 나은 이해.

백인 외의 작업을 기반으로 합니다. 19, norcotinine 되었고 NNC에 니트로 소화 깔끔하게 높은 수율 (80-92%)에서 생체 외에서 실험에 대 한 표준 생산 하. 성공적인 반응에 대 한 구조적 증거 1H NMR, 13C NMR, 아늑한, 그리고 부모 질량 [M + H] 확인 HRMS 함께 HSQC (지원 정보)를 포함 하 여 분 광 분석에서 얻은+ 의 5 ppm 이내는 이론적인 값 (그림 2)입니다. MS2 조각화 NNC의 가장 풍부한 제품 이온 질량을 결정 하기 위해 사용 되었다. 대 중에서 체 외 분석 결과의 LC-NSI+-HRMS/MS 방법에서 사용 되었다 결정된 정확한 부모 질량과 제품 이온. 2-8 ° C에서 어둠 속에 저장 하는 경우 NNC 솔루션 3 개월 이상에 대 한 안정적입니다. 이것은 매우 일반적인 반응, 그것은 어떤 2 ° 아 미드를 응용 프로그램.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56312/56312fig2.jpg"> 
그림 2: HRMS와 HRMS NNC의2 스펙트럼. 5 ppm의 대량 허용 오차 NNC의 A) 정확한 부모 질량: 계산: [M + H]+ = 192.07675, 발견: 192.07670. 2.0 amu의 격리 폭 m/z 192의 B) MS2 조각. 두 개의 가장 풍부한 제품 이온은 134.04739 및 162.07875. 화학 res. Toxicol., 2016, 29, pp 2194-2205에서 허가로 증 쇄. 저작권 2016 미국 화학 사회입니다. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56312/56312fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
합성된 NNC는 생체 외에서 P450 대사 분석 결과 대 한 표준으로 이용 되었다. 시 토 크롬 P450 2A6 NNN 산화20의 효과적인 촉매로 알려져 있다 때문에 사용 되었다. 마찬가지로, 그것은 α-hydroxylation21Km 에 근접 NNN 농도 2 μ M으로 설정 했다. 설명 하는 컬럼에 조건에서 합성 NNC elutes 부모 이온 제품 이온에서 잘 해결 봉우리 ~17.5 분 채널. 긍정적인 통제에 따라 NNC의 형성은 1, 5, 및 10 분 외피에 지적 했다.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56312/56312fig3.jpg"> 
그림 3: LC NSI HRMS chromatograms NNN-시 토 크롬 P450 2A6 외피에서 발생. 모든 섹션에 대 한 최고 크로마 대량 NNC에 대 한 전체 검색에서 추출 된 정확한 부모입니다. 중간과 하단 chromatograms는 두 정확한 제품 이온 대중의 NNC의 MS2 조각에서 추출. 섹션은 다음과 같습니다: NNC 표준 (A), NNC-시 토 크롬 P450 2A6 외피 포함 하는 모든 관련 효소와 cofactors 인큐베이션 타임 1 분 (B), (C), 5 분 및 10 분 (D). RT = 보존 시간; MA = 대량 지역. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56312/56312fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
NNC 수준 5 분에 최대한 고 나중 시간 포인트 감소. 상대 정량 표준 추정 최대 NNC 합성 NNC를 사용 하 여 레벨 10 nM. P450 시스템 부족 부정적인 컨트롤에서 전혀 NNC 형성 검색된 (데이터 표시 되지 않음), 따라서 나타내는 효소 변환 필요 했다. 함께,이 프로토콜 P450 2A6에 의해 NNC NNN의 변환에 대 한 직접 증거를 보여줍니다 형성의 정도 사소한에 비해 NNN의 α-hydroxylation.

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A General Method for Detecting Nitrosamide Formation in the In Vitro Metabolism of Nitrosamines by Cytochrome P450s

시 토 크롬 P450s에 의해 발암 성 니트로의 α-hydroxylation는 돌연변이 일으키는 원인이 되는 DNA 손상 중간체 생산 허용된 신진 대사 통로. 그러나, 새 데이터 나타냅니다 nitrosamides 산화 추가 발생할 수 있습니다. 우리는 일반 설명 nitrosamides을 탐지 하기 위한 방법 체 외에서 시 토 크롬 P450 촉매의 물질 대사 니트로에서 생산.

체 외에 대사 시 토 크롬 P450s에 의해 니트로의 Nitrosamide 형성을 탐지 하기 위한 일반적인 방법

N-nitrosamines are a well-established group of environmental carcinogens, which require cytochrome P450 oxidation to exhibit activity. The accepted ...

a-general-method-for-detecting-nitrosamide-formation-vitro-metabolism

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Cancer Research

A General Method for Detecting Nitrosamide Formation in the In Vitro Metabolism of Nitrosamines by Cytochrome P450s

9.9K 조회수.  University of Minnesota. 시 토 크롬 P450s에 의해 발암 성 니트로의 α-hydroxylation는 돌연변이 일으키는 원인이 되는 DNA 손상 중간체 생산 허용된 신진 대사 통로. 그러나, 새 데이터 나타냅니다 nitrosamides 산화 추가 발생할 수 있습니다. 우리는 일반 설명 nitrosamides을 탐지 하기 위한 방법 체 외에서 시 토 크롬 P450 촉매의 물질 대사 니트로에서 생산.

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The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

Drosophila melanogaster has emerged as a powerful experimental system for functional and mechanistic studies of tumor development and progression in the context of a whole organism. Sophisticated techniques to generate genetic mosaics facilitate induction of visually marked, genetically defined clones surrounded by normal tissue. The clones can be analyzed through diverse molecular, cellular and omics approaches. This study describes how to generate fluorescently labeled clonal tumors of varying malignancy in the eye/antennal imaginal discs (EAD) of Drosophila larvae using the Mosaic Analysis with a Repressible Cell Marker (MARCM) technique. It describes procedures how to recover the mosaic EAD and brain from the larvae and how to process them for simultaneous imaging of fluorescent transgenic reporters and antibody staining. To facilitate molecular characterization of the mosaic tissue, we describe a protocol for isolation of total RNA from the EAD. The dissection procedure is suitable to recover EAD and brains from any larval stage. The fixation and staining protocol for imaginal discs works with a number of transgenic reporters and antibodies that recognize Drosophila proteins. The protocol for RNA isolation can be applied to various larval organs, whole larvae, and adult flies. Total RNA can be used for profiling of gene expression changes using candidate or genome-wide approaches. Finally, we detail a method for quantifying invasiveness of the clonal tumors. Although this method has limited use, its underlying concept is broadly applicable to other quantitative studies where cognitive bias must be avoided.

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

This protocol demonstrates how to generate fluorescently marked, genetically defined clonal tumors in the Drosophila eye/antennal imaginal discs (EAD). It describes how to dissect the EAD and brain from the third instar larvae and how to process them to visualize and quantify gene expression changes and tumor invasiveness.

그만큼<em&gt; 초파리</em&gt; 가상적인 디스크 종양 모델 : 유전 모자이크를 사용하여 유전자 발현 및 종양 침윤의 시각화 및 정량화

Drosophila melanogaster has emerged as a powerful experimental system for functional and mechanistic studies of tumor development and progression in the ...

연구

암 연구학

Evaporation-reducing Culture Condition Increases the Reproducibility of Multicellular Spheroid Formation in Microtiter Plates

Tumor models that closely imitate in vivo conditions are becoming increasingly popular in drug discovery and development for the screening of potential anti-cancer drugs. Multicellular tumor spheroids (MCTSes) effectively mimic the physiological conditions of solid tumors, making them excellent in vitro models for lead optimization and target validation. Out of the various techniques available for MCTS culture, the liquid-overlay method on agarose is one of the most inexpensive methods for MCTS generation. However, the reliable transfer of MCTS cultures using liquid-overlay for high-throughput screening may be compromised by a number of limitations, including the coating of microtiter plates (MPs) with agarose and the irreproducibility of uniform MCTS formation across wells. MPs are significantly prone to edge effects that result from excessive evaporation of medium from the exterior of the plate, preventing the use of the entire plate for drug tests. This manuscript provides detailed technical improvements to the liquid-overlay technique to increase the scalability and reproducibility of uniform MCTS formation. Additionally, details on a simple, semi-automatic, and universally applicable software tool for the evaluation of MCTS features after drug treatment is presented.

The uneven loss of medium from microtiter plates affects the reproducibility of uniform multicellular tumor spheroid formation. Improving culture conditions to reduce significant medium loss will improve the reproducibility of spheroid formation and the results of spheroid-based assays using the liquid-overlay technique.

증발 감소 문화 조건은 미세 적정 플레이트에서 다세포 회전 타원체 형성의 재현성을 증가

Tumor models that closely imitate in vivo conditions are becoming increasingly popular in drug discovery and development for the screening of potential ...

A Unified Methodological Framework for Vestibular Schwannoma Research

Vestibular schwannomas are the most common neoplasms of the cerebellopontine angle, making up 6-8% percent of all intracranial growths. Though these tumors cause sensorineural hearing loss in up to 95% of affected individuals, the molecular mechanisms underlying this hearing loss remain elusive. This article outlines the steps established in our laboratory to facilitate the collection and processing of various primary human tissue samples for downstream research applications integral to the study of vestibular schwannomas. Specifically, this work describes a unified methodological framework for the collection, processing, and culture of Schwann and schwannoma cells from surgical samples. This is integrated with parallel processing steps now considered essential for current research: the collection of tumor and nerve secretions, the preservation of RNA and the extraction of protein from collected tissues, the fixation of tissue for the preparation of sections, and the exposure of primary human cells to adeno-associated viruses for application to gene therapy. Additionally, this work highlights the translabyrinthine surgical approach to collect this tumor as a unique opportunity to obtain human sensory epithelium from the inner ear and perilymph. Tips to improve experimental quality are provided and common pitfalls highlighted.

The goal of this protocol is to outline the collection and processing of human surgical samples for multiple downstream applications in vestibular schwannoma and Schwann cell research.

Vestibular Schwannoma 연구를위한 통합 방법론 체계

Vestibular schwannomas are the most common neoplasms of the cerebellopontine angle, making up 6-8% percent of all intracranial growths. Though these ...

Moving Upwards: A Simple and Flexible In Vitro Three-dimensional Invasion Assay Protocol

Although 3D invasion assays have been developed, the challenge remains to study cells without affecting the integrity of their microenvironment. Traditional 3D assays such as the Boyden Chamber require that cells are displaced from the original culture location and moved to a new environment. Not only does this disrupt the cellular processes that are intrinsic to the microenvironment, but it often results in a loss of cells. These problems are especially challenging when dealing with cells that are either rare, or extremely sensitive to their microenvironment. Here, we describe the development of a 3D invasion assay that avoids both concerns. In this assay, cells are plated within a small well and an ECM matrix containing a chemoattractant is laid atop the cells. This requires no cell displacement, and allows the cells to invade upwards into the matrix. In this assay, cell invasion as well as cell morphology can be assessed within the collagen gel. Using this assay, we characterize the invasive capacity of rare and sensitive cells; the hybrid cells resulting from fusion between breast cancer cells MCF7 and mesenchymal/multipotent stem/stroma cells (MSCs).

Moving Upwards: A Simple and Flexible In Vitro Three-dimensional Invasion Assay Protocol

This protocol describes an inverted vertical invasion assay that could be used to quantify the migration and invasion capabilities of cells in a three-dimensional setting while preserving the cell microenvironment. This assay is suitable for rare and/or sensitive cells.

위쪽으로 이동: 간단 하 고 유연한 생체 외에서 3 차원 침공 분석 실험 프로토콜

Although 3D invasion assays have been developed, the challenge remains to study cells without affecting the integrity of their microenvironment. ...

Phosphopeptide Enrichment Coupled with Label-free Quantitative Mass Spectrometry to Investigate the Phosphoproteome in Prostate Cancer

Phosphoproteomics involves the large-scale study of phosphorylated proteins. Protein phosphorylation is a critical step in many signal transduction pathways and is tightly regulated by kinases and phosphatases. Therefore, characterizing the phosphoproteome may provide insights into identifying novel targets and biomarkers for oncologic therapy. Mass spectrometry provides a way to globally detect and quantify thousands of unique phosphorylation events. However, phosphopeptides are much less abundant than non-phosphopeptides, making biochemical analysis more challenging. To overcome this limitation, methods to enrich phosphopeptides prior to the mass spectrometry analysis are required. We describe a procedure to extract and digest proteins from tissue to yield peptides, followed by an enrichment for phosphotyrosine (pY) and phosphoserine/threonine (pST) peptides using an antibody-based and/or titanium dioxide (TiO2)-based enrichment method. After the sample preparation and mass spectrometry, we subsequently identify and quantify phosphopeptides using liquid chromatography-mass spectrometry and analysis software.

This protocol describes a procedure to extract and enrich phosphopeptides from prostate cancer cell lines or tissues for an analysis of the phosphoproteome via mass spectrometry-based proteomics.

전립선 암에 있는 Phosphoproteome를 조사 하기 위해 양적 라벨 무료 질량 분석으로 결합 된 Phosphopeptide 농축

Phosphoproteomics involves the large-scale study of phosphorylated proteins. Protein phosphorylation is a critical step in many signal transduction ...

Detection of Lung Tumor Progression in Mice by Ultrasound Imaging

With ~1.6 million victims per year, lung cancer contributes tremendously to the worldwide burden of cancer. Lung cancer is partly driven by genetic alterations in oncogenes such as the KRAS oncogene, which constitutes ~25% of lung cancer cases. The difficulty in therapeutically targeting KRAS-driven lung cancer partly stems from having poor models that can mimic the progression of the disease in the lab. We describe a method that permits the relative quantification of primary KRAS lung tumors in a Cre-inducible LSL-KRAS G12D mouse model via ultrasound imaging. This method relies on brightness (B)-mode acquisition of the lung parenchyma. Tumors that are initially formed in this model are visualized as B-lines and can be quantified by counting the number of B-lines present in the acquired images. These would represent the relative tumor number formed on the surface of the mouse lung. As the formed tumors develop with time, they are perceived as deep clefts within the lung parenchyma. Since the circumference of the formed tumor is well-defined, calculating the relative tumor volume is achieved by measuring the length and width of the tumor and applying them in the formula used for tumor caliper measurements. Ultrasound imaging is a non-invasive, fast and user-friendly technique that is often used for tumor quantifications in mice. Although artifacts may appear when obtaining ultrasound images, it has been shown that this imaging technique is more advantageous for tumor quantifications in mice compared to other imaging techniques such as computed tomography (CT) imaging and bioluminescence imaging (BLI). Researchers can investigate novel therapeutic targets using this technique by comparing lung tumor initiation and progression between different groups of mice.

This protocol describes the steps taken to induce KRAS lung tumors in mice as well as the quantification of formed tumors by ultrasound imaging. Small tumors are visualized in early timepoints as B-lines. At later timepoints, relative tumor volume measurements are achieved by the measurement tool in the ultrasound software.

초음파 화상 진찰에 의하여 마우스에 있는 폐 종양 진행의 탐지

With ~1.6 million victims per year, lung cancer contributes tremendously to the worldwide burden of cancer. Lung cancer is partly driven by genetic ...

In Vitro Evaluation of Oncogenic Transformation in Human Mammary Epithelial Cells

Tumorigenesis is a multi-step process in which cells acquire capabilities&#160;that allow their growth, survival, and dissemination under hostile conditions. Different tests seek to identify and quantify these hallmarks of cancerous cells; however, they often focus on a single aspect of cellular transformation and, in fact, multiple tests are required for their proper characterization. The purpose of this work is to provide researchers with a set of tools to assess cellular transformation in vitro from a broad perspective, thereby making it possible to draw sound conclusions.
A sustained proliferative signaling activation is the major feature of tumoral tissues and can be easily monitored under in vitro conditions by calculating the number of population doublings achieved over time. Besides, the growth of cells in 3D cultures allows their interaction with surrounding cells, resembling what occurs in vivo. This enables the evaluation of cellular aggregation and, together with immunofluorescent labeling of distinctive cellular markers, to obtain information on another relevant feature of tumoral transformation: the loss of proper organization. Another remarkable characteristic of transformed cells is their capacity to grow without attachment to other cells and to the extracellular matrix, which can be evaluated with the anchorage assay.
Detailed experimental procedures to evaluate cell growth rate, to perform immunofluorescent labeling of cell lineage markers in 3D cultures, and to test anchorage-independent cell growth in soft agar are provided. These methodologies are optimized for Breast Primary Epithelial Cells (BPEC) due to its relevance in breast cancer; however, procedures can be applied to other cell types after some adjustments.

This protocol provides experimental in vitro tools to evaluate the transformation of human mammary cells. Detailed steps to follow-up cell proliferation rate, anchorage-independent growth capacity, and distribution of cell lineages in 3D cultures with basement membrane matrix are described.

인간 유방 상피 세포에 있는 종양원성 변환의 시험관 내 평가

Tumorigenesis is a multi-step process in which cells acquire capabilities&#160;that allow their growth, survival, and dissemination under hostile ...

Monitoring Breast Cancer Growth and Metastatic Colony Formation in Mice using Bioluminescence

Breast cancer is a frequent heterogeneous malignancy and the second leading cause of mortality in women, mainly due to distant organ metastasis. Several animal models have been generated, including the widely used orthotopic mouse models, where cancer cells are injected into the mammary fat pad. However, these models cannot help monitor tumor growth kinetics and metastatic colonization. Cutting-edge tools to monitor cancer cells in real time in mice will significantly advance the understanding of tumor biology. 
Here, breast cancer cell lines stably expressing luciferase and green fluorescent protein (GFP) were established. Specifically, this technique contains two sequential steps initiated by measuring the luciferase activity in vitro and followed by the implantation of the cancer cells into mammary fat pads of nonobese diabetic-severe combined immunodeficiency (NOD-SCID) mice. After the injection, both the tumor growth and metastatic colonization are monitored in real time by the noninvasive bioluminescence imaging system. Then, the quantification of GFP-expressing metastases in the lungs will be examined by fluorescence microscopy to validate the observed bioluminescence results. This sophisticated system combining luciferase and fluorescence-based detection tools evaluates cancer metastasis in vivo, which has great potential for use in breast cancer therapeutics and disease management.

Here, we describe a noninvasive monitoring method involving luciferase and green fluorescent protein expression in various breast cancer cell lines. This protocol provides a technique to monitor tumor formation and metastatic colonization in real time in mice.

생체 발광을 사용하여 마우스의 유방암 성장 및 전이성 콜로니 형성 모니터링

Breast cancer is a frequent heterogeneous malignancy and the second leading cause of mortality in women, mainly due to distant organ metastasis. Several ...

Exploring the Arginine Methylome by Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy

Protein-bound arginine is commonly methylated in many proteins and regulates their function by altering the physicochemical properties, their interaction with other molecules, including other proteins or nucleic acids. This work presents an easily implementable protocol for quantifying arginine and its derivatives, including asymmetric and symmetric dimethylarginine (ADMA and SDMA, respectively) and monomethyl arginine (MMA). Following protein isolation from biological body fluids, tissues, or cell lysates, a simple method for homogenization, precipitation of proteins, and protein hydrolysis is described. Since the hydrolysates contain many other components, such as other amino acids, lipids, and nucleic acids, a purification step using solid-phase extraction (SPE) is essential. SPE can either be performed manually using centrifuges or a pipetting robot. The sensitivity for ADMA using the current protocol is about 100 nmol/L. The upper limit of detection for arginine is 3 mmol/L due to SPE saturation. In summary, this protocol describes a robust method, which spans from biological sample preparation to NMR-based detection, providing valuable hints and pitfalls for successful work when studying the arginine methylome.

The present protocol describes the preparation and quantitative measurement of free and protein-bound arginine and methyl-arginines by 1H-NMR spectroscopy.

핵자기공명분광법에 의한 아르기닌 메틸롬 탐구

Protein-bound arginine is commonly methylated in many proteins and regulates their function by altering the physicochemical properties, their interaction ...

Simultaneous Imaging and Flow-Cytometry-based Detection of Multiple Fluorescent Senescence Markers in Therapy-Induced Senescent Cancer Cells

Chemotherapeutic drugs can induce irreparable DNA damage in cancer cells, leading to apoptosis or premature senescence. Unlike apoptotic cell death, senescence is a fundamentally different machinery restraining&#160;propagation of cancer cells. Decades of scientific studies have revealed the complex pathological effects of senescent cancer cells in tumors and microenvironments that modulate cancer cells and stromal cells. New evidence suggests that senescence is a potent prognostic factor during cancer treatment, and therefore rapid and accurate detection of senescent cells in cancer samples is essential. This paper presents a method to visualize and detect therapy-induced senescence (TIS) in cancer cells. Diffuse large B-cell lymphoma (DLBCL) cell lines were treated with mafosfamide (MAF) or daunorubicin (DN) and examined for the senescence marker, senescence-associated &#946;-galactosidase (SA-&#946;-gal), the DNA synthesis marker 5-ethynyl-2&#8242;-deoxyuridine (EdU), and the DNA damage marker gamma-H2AX (&#947;H2AX). Flow cytometer imaging can help generate high-resolution single-cell images in a short period of time to simultaneously visualize and quantify the three markers in cancer cells.

Here we present a flow cytometry-based method for visualization and quantification of multiple senescence-associated markers in single cells.

치료 유도 노인성 암 세포에서 다중 형광 노화 마커의 동시 이미징 및 유동 세포 측정 기반 검출

Chemotherapeutic drugs can induce irreparable DNA damage in cancer cells, leading to apoptosis or premature senescence. Unlike apoptotic cell death, ...