Este trabalho foi apoiado pela University of Chicago Women&#39;s Board, o Wendy Will Case Fund, e da Universidade de Chicago Comprehensive Cancer Center Grant Grant (P30 CA014599). Gostaríamos de agradecer ao Flow Cytometry Core da Universidade de Chicago por sua ajuda na criação deste experimento, bem como outros membros do laboratório de de Jong, particularmente Leslie Pedraza e Sean McConnell.

Todos os procedimentos com peixe-zebra foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) na Universidade de Chicago. A Universidade de Chicago é credenciada pela Associação para Avaliação e Acreditação de Laboratório Animal Care (AAALAC). 1. Geração e isolamento de células T-ALL marcadas fluorescentemente em Zebrafish <ol><li> Microinjeção em embriões de peixe-zebra singênico <ol><li> Utilizando kits comercialmente disponíveis, isolar o ADN plasmídico de rag2 : c-myc e rag2 : proteína fluorescente verde ( rag2 : GFP) contendo repetições terminais invertidas reconhecidas por tol2 transposase (ver Tabela de Materiais para fonte de ADN plasmídico) 12 e eluir o ADN Em água estéril. NOTA: O GFP é usado neste estudo, mas qualquer proteína fluorescente funcionará. </li><li> Preparar pCS2-transposase (tol2) RNA <ol><li> Isolar o ADN plasmídico tol2 utilizando kits comercialmente disponíveis (ver tele Tabela de Materiais para a fonte de ADN de plasmídeo) 12 e elui-se o ADN em água estéril. </li><li> Incubar 1 ug de ADN tol2 a 37 ° C durante 1 h com 5 unidades de enzima de restrição de Notl no tampão apropriado para linearizar o plasmídeo. Calor-inactivar o NotI a 65 ° C durante 20 min. </li><li> Transcrever o ARN tol2 com polimerase de ARN de SP6 do ADN linearizado utilizando um kit de transcrição de ARN disponível comercialmente 13. Armazenar o ARN em alíquotas de uso único, a -80 ° C. </li></ol></li><li> Preparar a mistura de injecção em gelo pela adição de 250 ng de RAG2: ADN de plasmídeo c-myc, 250 ng de RAG2: GFP plasmídeo de ADN, 150 ng de ARN tol2, e 0,5 mL de fenol vermelho. Ajustar o volume para 10 mL com água isenta de nuclease. </li><li> Injectar ~ 1 nL de mistura de injecção para a célula de um estádio de uma célula de embrião do peixe-zebra singeneicos utilizando um micro-injector e a agulha puxada a partir de um tubo capilar de vidro, seguindo anteriormente estabemétodos cido 8, 14. NOTA: peixe-zebra Singênico gerado por partenogénese 15 são utilizados aqui para eliminar a heterogeneidade genética e rejeição imunitária após o transplante. No entanto, também pode ser utilizado de tipo selvagem de peixe-zebra ou qualquer estirpe desejada. </li><li> Remover embriões mortos, subdesenvolvidos, ou malformados às 24 h e 48 h pós-injecção 16. </li><li> Coloque o peixe injectado no sistema de peixe aos 6 dias pós-injecção e levantá-los de acordo com o protocolo padrão de 6. </li></ol></li><li> Rastreio de peixe-zebra injectada e acompanhar o crescimento tumoral <ol><li> Aos 21 dias pós-injecção, colocar uma única larva injectado em uma gota de meio de embriões em uma placa de Petri e tela de fluorescência de GFP por meio de um microscópio de epifluorescência (excitação de passagem de banda: 470/40, de passagem de banda de emissão: 525/50) 8. NOTA: larvas do peixe que hAve integrada tanto rag2 : c-myc e rag2 : GFP terá um timo fluorescente verde (peixe positivo) e pode já exibir a expansão de células fluorescentes verdes malignas para além do timo. Todos os peixes com um GFP + timo irão desenvolver um GFP + T-ALL. As larvas que não demonstram a integração dos plasmídeos não terão quaisquer células fluorescentes verdes (peixes negativos). </li><li> Separar os peixes negativos (com base numa falta de fluorescência) num tanque diferente e monitorizar os peixes novamente aos 28 e 35 dias após a injecção. Aos 28 e 35 dias após a injeção, anestesiar o peixe com 0,02% de tricaína tamponada (MS-222) em água do sistema de peixes antes do rastreio. </li><li> Coloque cada larva zebrafish que é positivo para um timo marcado fluorescentemente ou um tumor marcado fluorescentemente em um tanque individual para monitorar o crescimento do tumor três vezes por semana. </li></ol></li><li> A recolha de células T-ALL marcadas fluorescentemente a partir do peixe de tumor primário <ol><li> Preparar pelo menos 20 ml de soro fetal de bovino inactivado pelo calor 10% em 0,9x tampão fosfato salino (FBS / PBS). </li><li> Adicionar 1 mL de FBS / PBS a um frasco de sal de sódio de heparina (300 unidades). </li><li> Seleccionar peixe portadores de tumores em mais de 50% do corpo, ou aqueles peixes que tem dificuldade em comer ou natação. Sacrificar o peixe por sobredosagem com eles tricaina ou por imersão em água gelada. Confirmar a morte por falta de um movimento de emalhar e os batimentos cardíacos. </li><li> Utilizar uma lâmina de barbear para remover a cabeça do peixe. </li><li> Lava-se a cavidade do peixe com a solução de heparina, para remover os glóbulos vermelhos em excesso. <ol><li> Usando uma pipeta, injectar 100 ul de solução de heparina (preparado no passo 1.3.2) na cavidade do corpo do peixe. Remover todo o líquido que sai (irá conter os glóbulos) e pipeta-lo para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. </li><li> Usar uma nova ponta de pipeta para lavar o corpo de novo. Executar, pelo menos, três lavagens, ou até que o líquido que sai aparecer livre de blOod. </li><li> Descarte todo o líquido das lavagens nos passos 1.3.5.1 e 1.3.5.2, uma vez que não será utilizado em análises adicionais. </li></ol></li><li> Recolher as células de leucemia. <ol><li> Injectar 100 μL de FBS / PBS na cavidade corporal do peixe. </li><li> Aplique suave pressão para o exterior do corpo do peixe com a ponta da pipeta para espremer / empurrar as células tumorais. NOTA: Se esta etapa é realizada usando um microscópio de dissecação, as células tumorais derramando fora da cavidade do corpo será evidente. </li><li> Recolher o líquido e as células de cada lavagem em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. </li><li> Repita os passos 1.3.6.1-1.3.6.3 até a maioria das células tumorais serem coletadas (geralmente 5-10 vezes). Recolher todas as células tumorais no mesmo tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. Manter as células à temperatura ambiente. </li></ol></li><li> Misturam-se as células tumorais recolhidas do passo 1.3.6 pipetando-as suavemente para dissociar os aglomerados de células. Filtrar a suspensão de células através de um 4Filtro de malha de 0 μm. Lavar o filtro 1-2 vezes com 100 μL de FBS / PBS. Manter as células à temperatura ambiente. </li><li> Misture 2 μL de suspensão celular com 18 μL de azul de tripano (0,4%, diluído 1:10 e filtrado) num novo tubo. Carregar 10 μL num hemocitómetro e contar o número de células fluorescentes vivas (não azuis) para calcular o número de células tumorais isoladas. NOTA: As células GFP-negativas não-azuis são provavelmente células T normais não malignas e não devem ser contadas. São necessárias pelo menos 2 x IO6 células para corar as células com Hoechst 33342. </li></ol></li></ol> 2. Coloração das células T-ALL marcadas fluorescentemente com Hoechst 33342 para identificar a população lateral <ol><li> Diluir Hoechst 33342 1:10 com H 2 O nuclease-livre para fazer a concentração de trabalho de 1 mg / mL. Armazenar o corante a 4 ° C e no escuro. </li><li> Preparar uma solução 100 mM de verapamil por dissolução de 49,1 mg em 1 mL de sulfóxido de dimetilo (DMSO). NOTA: Verapamil é um inibidor de transportadores ABC e é um importante controle para experimentos de populações laterais. A adição de verapamilo a amostras irá inibir a capacidade dos transportadores ABC de efluxar o corante Hoechst 33342. Portanto, uma verdadeira população lateral desaparecerá quando o verapamil for adicionado à amostra. </li><li> Coloque um banho-maria a 28 ° C. </li><li> Preparar amostras e controles no escuro, adicionando células e soluções a fluorescência ativado por classificador de células (FACS) tubos. <ol><li> Prepare as amostras adicionando 10 6 células, 15 μL de Hoechst 33342 a 1 mg / mL e 2,5 μL de DMSO a um tubo FACS. Ajustar o volume para 1 mL com FBS / PBS. </li><li> Preparar os controlos adicionando 10 6 células, 15 μL de Hoechst 33342 a 1 mg / mL e 2,5 μL de verapamil 100 mM a um tubo FACS. Ajustar o volume para 1 mL com FBS / PBS. NOTA: Recomenda-se um mínimo de 10 6 células / amostra, mas é preferível a coloração de células, especialmente se a população lateralcélulas de iões serão classificados para análise posterior. Não exceder 10 6 células / ml, e manter a concentração de Hoechst 33342 a 15 ug / mL. Se 10 x 10 6 culas s coradas, o volume total da reacção é de 10 ml. </li></ol></li><li> Incubar em um banho de ua 28 ° C no escuro durante 120 min. </li><li> Após a incubação, colocar as células imediatamente em gelo e mantê-los no escuro. </li><li> Sedimentar as células a 4 ° C durante 6 min a 300 x g. Remover o sobrenadante. Lava-se com 1 mL de FBS / PBS. </li><li> Sedimentar as células a 4 ° C durante 6 min a 300 x g. Remover o sobrenadante. Ressuspender as células em 1 ml de FBS / PBS. </li><li> Manter a 4 ° C até à separação de células. </li><li> 15 min antes da separação de células, adiciona-se 2 mL de iodeto de propídio estoque (PI) (1 mg / mL) para cada 1 mL de FBS / PBS (concentração final: 2 ug / ml). Misture bem. </li></ol> 3. Use FACS encontrar o População Side dentro do T-ALL população de células fluorescente etiquetado <ol><li&gt; Analisar os T-ALL suspensões de células coradas de peixe-zebra em um classificador de células equipado com um laser de UV para a Hoechst 33342 corante de excitação e um laser de 488 nm para a excitação PI e para a detecção dos GFP + células T-ALL. </li><li> Determine um portão para o ao vivo, GFP + T-ALL células. <ol><li> Uso de dispersão frontal (FSC) e dispersão lateral área (SSC) a porta para fora detritos. NOTA: FSC é usado para distinguir o tamanho celular e SSC é usado para distinguir a granularidade da célula. </li><li> Use FSC eo SSC width para discriminar dobletes. NOTA: Não há três componentes identificados pelo citetro de fluxo detectores: área, altura e largura. Área é normalmente usado para medir a fluorescência da célula. Largura mede a tempo de voo e é o dobro da largura, se duas células são aglutinados. </li><li> Para as células tumorais vivas, desenhar uma porta em torno das células positivas para GFP e negativas para PI usando os detectores apropriados (por exemplo, FITC para GFP e PerCP Cy5-5 para PI). </li></ol></li><li&gt; No portão de células vivas, medir a Hoechst 33342 fluorescência através dos filtros de banda Hoechst azul e Hoechst vermelhos (450/50 e 670/30, respectivamente). NOTA: A população lado, se estiver presente, será evidente após este está configurado. Importante, a população lado deve desaparecer no controlo verapamil em ordem para que possa ser considerada uma população lado verdadeiro. </li><li> Se a classificação de células da população lado para outras experiências, utilizar o grande ponta do bocal (100? M) e recolher as células num tubo de FACS contendo 3 mL de 100% de FBS. Utilizar uma ponta maior do bocal (100 um) em vez da ponta menor (70? M) para melhorar a viabilidade celular, após separação. </li></ol>

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Os autores não têm nada a revelar.

O ensaio de população lateral é altamente sensível; Portanto, pequenas alterações no protocolo podem resultar em uma dificuldade na detecção de células populacionais laterais. Em primeiro lugar, a temperatura durante o passo de coloração é específica para cada sistema de animal / célula. Para sistemas de mamíferos, o ensaio de população lateral é tipicamente realizado a 37 ° C 2 . Quando as células T-ALL de zebrafish foram incubadas a 37 ° C, muitas das células morreram, o que tornou esta temperatura de incubação inaceitável (dados não apresentados). Quando Kobayashi e colaboradores (2008) dissecaram a medula óssea de peixe-zebra para o ensaio de população lateral, as incubações foram realizadas a 25 ° C 5 . Esta temperatura de incubação não foi suficiente para células T-ALL de peixe-zebra, uma vez que resultou num perfil fraco de Hoechst 33342 (dados não apresentados). No protocolo aqui descrito, uma temperatura de incubação de 28 ° C era óptima para manter a viabilidade celular e para conseguir um perfil forte de Hoechst 33342. Uma segunda condição para o ensaio população lado que requer consideração e ensaios anteriores é a concentração de Hoechst 33342. Se a concentração de Hoechst 33342 é demasiado baixo, a população lateral pode não ser visível, ou o fenótipo população lado (tingir capacidade de efluxo) pode falsamente ser aumentado, a identificação de células da população mais laterais que se encontram efectivamente presentes dois. Por outro lado, demasiado elevada de uma concentração de Hoechst 33342 pode ser tóxico para as células. Para zebrafish T ALL-células, 15 ug / mL Hoechst 33342 incubadas durante 120 minutos, é a combinação óptima. Concentrações mais baixas de Hoechst 33342 foram testados para zebrafish T ALL-células, mas a população lado nem sempre foi evidente (dados não mostrados). Um tempo total de incubação de 90 minutos foi suficiente para detectar uma população lado, mas o número máximo de células da população secundários foi observada após 120 minutos de tempo de incubação. Como reportado anteriormente para s de mamíferos<html> fo r, nem todos os tumores terá uma população detectável lateral 17, 18, 19. Usando este método, observa-se uma população lado em 14 de 17 t-alls testadas (dados não mostrados). Tendo isolado as células da população lado de t-alls, este método deverá ser aplicável a outros modelos de tumor de peixe-zebra. Dentro do peixe-zebra heterogénea LLA-T de tumor, as células de leucemia de início (PBR) são capazes de reiniciando o crescimento do tumor e, como tal, são acreditados responsável para recorrência e metástase do cancro. Actualmente, não existe nenhum método no peixe-zebra que permite o isolamento potencial do PBR in vivo. Calcular a frequência LIC requer transplantação de células de tumor a uma diluição limitante 8, 10. estudos publicados anteriormente com peixe-zebra clonal identificaram que os PBR compõem 0,1-1,4% de células T-ALL primários&quot;xref&quot;&gt; 10. Aqui, a variabilidade semelhante na frequência de células da população secundários (0,2-1,0%) do peixe-zebra clonal T-alls é reportado (Figura 2). São necessários mais estudos para determinar se a população lado é enriquecida em PBR; no entanto, a semelhança entre as gamas de frequência LIC e a percentagem de células da população em lado estes T-alls suporta esta hipótese. Enquanto o ensaio de população lado é sensível e nem sempre é fácil de realizar, o ensaio permite aos investigadores, pela primeira vez, para isolar uma população rara de células em peixes-zebra LLA-T que pode ter estaminais ou células progenitoras propriedades. Existem actualmente não há marcadores da superfície celular disponíveis em peixes-zebra para identificar as células de haste ou progenitoras semelhantes; daí, a capacidade de isolar a população lado é muito promissora. As aplicações futuras deste método incluem limite de experiências de transplante de diluição ordenada população lado T-ALL de células para avaliar o enriquecimento de LICs. Além disso, este método permitirá características que definem LICs para ser elucidado, incluindo os mecanismos moleculares que governam LICs em zebrafish T-ALL. Estes experimentos poderiam fornecer pontos de partida para a descoberta de novos alvos terapêuticos para T-ALL.

O ensaio população lado capitaliza sobre a capacidade aumentada de determinadas células dentro de um tecido que efluxo o corante de ligao ao ADN Hoechst 33342, devido aos elevados níveis da cassete de ligao de ATP (ABC) proteínas transportadoras sobre a membrana celular. As células que efluxo o corante Hoechst 33342 pode ser identificado utilizando análise de citometria de fluxo duplo comprimento de onda após o corante é excitada por um laser de UV. Este ensaio foi utilizado pela primeira vez para identificar células estaminais hematopoiéticas murinas (HSCs) 1, mas foi uma vez utilizado para identificar populações de células estaminais / progenitoras em muitos tecidos e tipos de cancro (revisto em referência 2). No entanto, nem todas as populações de células têm uma população lado, e nem todas as populações laterais são enriquecidas para as células estaminais / progenitoras. O peixe-zebra é um poderoso vertebrado sistema modelo genético para o estudo do cancro humano 3, 4, com um número de vantagens em relação mo murino tradicionaldels de cancro. Embriões de peixe-zebra são externamente fertilizado e são opticamente transparentes, facilitando transgénese e a observação in vivo de processos patológicos, incluindo a iniciação e progressão do cancro. Até à data, o ensaio população lado para detectar potenciais de células estaminais ou progenitoras só foi aplicada para a medula do rim em peixes-zebra para identificar HSCs, e não a quaisquer modelos de cancro de peixe-zebra 5, 6. O modelo de peixe-zebra de células T de leucemia linfoblástica aguda (LLA-T) é morfologicamente e geneticamente semelhante ao humano T-ALL 7, 8, 11. T-ALL é uma neoplasia agressiva que, em humanos, é responsável por 10-15% dos pediátrica e 25% dos adultos TODOS os casos 9. Embora o tratamento de LLA-T tem melhorado, recaída ainda é comum e está associado a um prognóstico pobre. T-ALL tumores são hétérogèneous e conter muitas subpopulações de células de tumor diferentes, incluindo leucemia iniciar células (PBR). PBR são definidas pela sua capacidade de voltar a crescer todo o tumor a partir de uma única célula, e a frequência de PBR dentro de uma população de células de tumor pode ser calculado através do transplante de células doses variadas para receptores por meio de um ensaio de transplante de diluição limitante (LDA). Embora as experiências foram efectuadas de LDA em peixes-zebra para calcular a frequência de PBR 8, 10, 11, esta determinação é feita em retrospectiva e não permite o isolamento potencial do PBR. Por conseguinte, um método para isolar prospectivamente uma população enriquecida em actividade de células estaminais do cancro é inexistente. A identificação e isolamento de células da população lado de peixe-zebra t-alls é o primeiro passo no sentido de resolver esta deficiência. O protocolo aqui apresentado descreve como gerar de forma eficiente T-ALL tumores em ZEBRafish utilizando transgénese mediada por tol2, a colheita das células T-ALL tumores, e mancham-los com Hoechst 33342 para identificar a população de células lado. Futuro em experiências in vivo com peixe-zebra LLA-T poderia incluir se as células da população lateral são enriquecidos para os PBR ou têm outras propriedades de haste ou progenitoras semelhantes.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="859">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:245px;">Syngeneic zebrafish (CG2)</td>
			<td style="width:199px;"></td>
			<td style="width:208px;"></td>
			<td style="width:208px;">See Mizgireuv et al., 2006</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:245px;">rag2:c-myc plasmid</td>
			<td style="width:199px;"></td>
			<td style="width:208px;"></td>
			<td>Langenau Laboratory</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:245px;">rag2:GFP plasmid constructed in de Jong Lab</td>
			<td style="width:199px;"></td>
			<td style="width:208px;"></td>
			<td style="width:208px;">rag2 promoter from Langenau Laboratory</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:245px;">pCS2-transposase plasmid</td>
			<td style="width:199px;"></td>
			<td style="width:208px;"></td>
			<td>Chien Laboratory</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:245px;">NotI -HF restriction enzyme</td>
			<td style="width:199px;">New England Bio-Labs Inc.</td>
			<td>R3189S</td>
			<td>500 units in 25 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:245px;">mMessage Machine SP6 Transcription Kit</td>
			<td style="width:199px;">Ambion</td>
			<td style="width:208px;">Thermo Fisher Scientific - AM1340</td>
			<td>25 reactions</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:245px;">QIAGEN Plasmid Midi Kit</td>
			<td style="width:199px;">Qiagen, Inc.</td>
			<td style="width:208px;">12643</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:245px;">SteREO Discovery V8 Microscope</td>
			<td style="width:199px;">Carl Zeiss Microscopy</td>
			<td>495015-0008-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:245px;">Digital microinjector</td>
			<td style="width:199px;">Tritech Research</td>
			<td>MINJ-D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:245px;">Brass straight-arm needle holder</td>
			<td style="width:199px;">Tritech Research</td>
			<td>MINJ-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:245px;">Magnetic base and stand</td>
			<td style="width:199px;">Tritech Research</td>
			<td>MINJ-HBMB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:245px;">Micromanipulator</td>
			<td style="width:199px;">Narishige International</td>
			<td style="width:208px;">MN153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:245px;">Glass capillaries</td>
			<td style="width:199px;">Sutter Instrument Co.</td>
			<td style="width:208px;">B100-50-10</td>
			<td>10 cm without filament</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:245px;">Flaming/Brown micropipette puller</td>
			<td style="width:199px;">Sutter Instrument Co.</td>
			<td style="width:208px;">P-97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:245px;">Microloader pipette tips</td>
			<td style="width:199px;">Eppendorf North America Inc.</td>
			<td>930001007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:245px;">Phenol Red solution</td>
			<td style="width:199px;">Sigma Life Science</td>
			<td style="width:208px;">P0290</td>
			<td>0.5% concentration 100 mL</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:245px;">Plastic Transfer pipettes</td>
			<td style="width:199px;">Fisherbrand</td>
			<td>137119D</td>
			<td>graduated 7.5 mL bulb</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Tricaine methanesulfonate (MS-222)</td>
			<td style="width:199px;">Western Chemical, Inc.</td>
			<td style="width:208px;">Fisher Scientific - NC0342409</td>
			<td>100 g</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:245px;">Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td style="width:199px;">HyClone Laboratories, Inc.</td>
			<td style="width:208px;">Fisher Scientific - SH3007103</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:245px;">Phosphate-Buffered Saline (PBS)</td>
			<td style="width:199px;">Gibco by Life Technologies</td>
			<td style="width:208px;">1001-023</td>
			<td>pH 7.4 (1x) - 500 mL</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:245px;">Heparin sodium salt</td>
			<td style="width:199px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:208px;">2106</td>
			<td>15 - 300 unit vials</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:245px;">40 um mesh filter</td>
			<td style="width:199px;">Falcon Corning Brand</td>
			<td style="width:208px;">352340</td>
			<td>Case of 50</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:245px;">Trypan blue</td>
			<td style="width:199px;">Sigma Life Science</td>
			<td style="width:208px;">T8154</td>
			<td>20 mL - Solution (0.4%)</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:245px;">Hoechst 33342</td>
			<td style="width:199px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:208px;">H3570</td>
			<td>10 mL</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:245px;">Verapamil</td>
			<td style="width:199px;">Sigma Life Science</td>
			<td style="width:208px;">V4629</td>
			<td>1 g</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:245px;">Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td style="width:199px;">Sigma Life Science</td>
			<td style="width:208px;">D8418</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:245px;">Propidium Iodide</td>
			<td style="width:199px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:208px;">P3566</td>
			<td>10 mL</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">FACSAria Fusion cell sorter</td>
			<td style="width:199px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:208px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:245px;">BD FACSDiva 8.0.1</td>
			<td style="width:199px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:208px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:245px;">FlowJo v10.2</td>
			<td style="width:199px;">FlowJo, LLC</td>
			<td style="width:208px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of the side population in myc-induced t-cell acute lymphoblastic leukemia in zebrafish

populações celulares heterogéneas, a partir de qualquer dos tecidos saudáveis ​​ou malignas, podem conter uma população de células caracterizadas por uma capacidade diferencial para efluxo do corante de ligao a ADN Hoechst 33342. Este &quot;população lado&quot; de células podem ser identificados utilizando métodos de citometria de fluxo após a Hoechst 33342 corante é excitado por um (UV) do laser ultravioleta. A população lado de muitos tipos de células contem células progenitoras de haste ou semelhante. No entanto, nem todos os tipos de células têm uma população lado identificável. Danio rerio, peixe-zebra, tem um robusto em modelo vivo de células T leucemia linfoblástica aguda (LLA-T), mas se estes T-alls peixe-zebra tem uma população lado é desconhecida. O método descrito aqui descreve como para isolar as células da população lado em peixes-zebra T-ALL. Para começar, a T-ALL no peixe-zebra é gerado através da microinjeção de plasmídeos tol2 em embriões em estágio de uma célula. Uma vez que os tumores cresceram a uma fase em que eles se expandir para mais de metade do aniO corpo de mal, as células T-ALL podem ser colhidas. As células são depois coradas com Hoechst 33342 e examinadas por citometria de fluxo para as células da população lado. Este método tem amplas aplicações em peixe-zebra T-ALL pesquisa. Embora não existam marcadores de superfície celular conhecidos no peixe-zebra que confirmam se estas células da população lado são células-tronco como cancro, in vivo, ensaios de transplante funcionais são possíveis. Além disso, transcriptómica de célula única poderiam ser aplicados para identificar as características genéticas destas células população lado.

Para gerar eficientemente tumores T-ALL induzidos por myc induzidos por fluorescência em peixe-zebra, as construções de ADN circulares flanqueadas por locais de transposase tol2 podem ser co-injectadas com ARN tol2. Estudos prévios da injeção de DNA linearizado em embriões de peixe-zebra relatam uma taxa de transgênese de 5% 8 . Com o protocolo ajustado para incluir a transgénese mediada por tol2, podem ser observadas taxas de transgénese que variam de 10-44% ( Tabela 1 ). No exemplo representativo, um peixe com uma T-ALL GFP + foi corado com Hoechst 33342 para determinar a percentagem de células na população lateral. A Figura 1 mostra o esquema de bloqueio utilizado para determinar a percentagem de células de população lateral. Em primeiro lugar, utilizando FSC e SSC, as células T-ALL são isoladas excluindo detritos ( Figura 1A ) e subsequentemente seleccionando contra dupletos ( Figura 1B ). Em seguida, todas as cï¿½ulas vivas sï¿½ isoladas atravï¿½ de cï¿½ulas que sï¿½ GFP + e negativas para o discriminador de cï¿½ulas mortas PI ( Figura 1C ). Uma vez seleccionadas as células T-ALL vivas, a população lateral pode ser encontrada no perfil Hoechst 33342. Na populaï¿½o celular principal, Hoechst 33342 permanece nas cï¿½ulas, e estas cï¿½ulas podem ser separadas em grupos por conteï¿½o de ADN. No entanto, a populaï¿½o lateral de cï¿½ulas ï¿½distinguï¿½el da populaï¿½o de cï¿½ulas principais, uma vez que as cï¿½ulas de populaï¿½o lateral efluxam o corante devido a um maior nï¿½ero de transportadores ABC na membrana celular. Para visualizar a população lateral, o perfil de Hoechst é usado para comparar dois canais, Hoechst Blue e Hoechst Red. A populaï¿½o lateral ï¿½a cauda escura de cï¿½ulas que se estendem a partir do lado esquerdo da populaï¿½o de cï¿½ulas principais para o eixo azul de Hoechst ( Figura 1D ). Uma verdadeira população lateral será perdida quando as células são tratadas com um inibidorF transportadores ABC, como verapamil. A Figura 2 mostra as populações laterais em vários tumores T-ALL representativos, bem como quando esses tumores são tratados com verapamil durante a coloração com Hoechst 33342. Para assegurar que a população encontrada na amostra seja uma verdadeira população lateral, essas células devem desaparecer Na presença do inibidor, como se mostra na Figura 2 . <table height="525" width="487"><tbody><tr><td> Número de estoque </td><td> Número de peixes examinados </td><td> Número positivo </td><td> Taxa de transgênese </td></tr><tr><td> 930 </td><td> 21 </td><td> 3 </td><td> 14,3% </td></tr><tr><td> 934 </td><td> 12 </td><td> 4 </td><td> 33,3% </td></tr><tr><td> 950 </td><td> 12 </td><td> 5 </td><td> 41,7% </td></tr><tr><td> 951 </td><td> 19 </td><td> 3 </td><td> 15,8% </td></tr><tr><td> 960 </td><td> 3 &lt;/ Td&gt; <td> 1 </td><td> 33,3% </td></tr><tr><td> 983 </td><td> 9 </td><td> 4 </td><td> 44,4% </td></tr><tr><td> 1004 </td><td> 30 </td><td> 3 </td><td> 10,0% </td></tr><tr><td> 1013 </td><td> 4 </td><td> 1 </td><td> 25,0% </td></tr><tr><td> 1025 </td><td> 35 </td><td> 5 </td><td> 14,3% </td></tr><tr><td> 1029 </td><td> 10 </td><td> 2 </td><td> 20,0% </td></tr><tr><td> 1065 </td><td> 5 </td><td> 1 </td><td> 20,0% </td></tr><tr><td> 1070 </td><td> 6 </td><td> 1 </td><td> 16,7% </td></tr><tr><td> 1073 </td><td> 19 </td><td> 8 </td><td> 42,1% </td></tr><tr><td> 1079 </td><td> 8 </td><td> 1 </td><td> 12,5% </td></tr><tr><td> 1105 </td><td> 38 </td><td> 7 </td><td> 18,4% </td></tr><tr><td> 1193 </td><td> 30 </td><td> 8 </td><td> 26,7% </td></tr><tr><td> 1215 </td><td> 9 </td><td> 1 </td><td> 11,1% </td></tr><tr><td>1229 </td><td> 10 </td><td> 2 </td><td> 20,0% </td></tr><tr><td> 1314 </td><td> 6 </td><td> 1 </td><td> 16,7% </td></tr></tbody></table> Tabela 1: Taxas Transgénese Quando Usando tol2 transposase para plasmídeo microinjeco em embriões de peixe-zebra. As taxas calculadas de transgénese são mostrados para dezanove dias de injecção separados. O número de peixes filtradas representa o número de peixes que permaneceram vivos 21 dias após a injecção, e o número positivo representa o número de peixes que foram positivos para tumores fluorescentes. <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/55711/55711fig1.jpg" /> Figura 1: Esquema Lado gating População. Um exemplo do esquema de intermitcia usado para identificar a população lado em um GFP + T-ALL no peixe-zebra. (A) Em primeiro lugar, os detritos são excluídos usando a frente de dispersão (FSC) edispersão lateral (SSC) área. (B) Em seguida, as células individuais são isolados por discriminar dupletos usando FSC e SSC parâmetros de largura. (C) Uma vez que neste exemplo de tumor foi GFP +, todas as células vivas deve ser GFP + e negativa para o marcador de células mortas iodeto de propídio. (D) A população lado pode ser visto com o Vermelho Hoechst versus o perfil de Hoechst azul. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55711/55711fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/55711/55711fig2.jpg" /> A figura 2: Side População desaparece quando tratados com o ABC Transporter Inhibitor, Verapamil. Portões para a população lateral são mostrados. Os painéis superiores mostram quatro amostras de tumor diferentes. É importante notar que nem todos os tumores têm a mesma percentagem da população lado, eo ca população ladoN aparecem diferentes para cada tumor testado. Os painéis inferiores mostram amostras tumorais que foram tratadas com verapamil durante a coloração com Hoechst 33342 para bloquear o efluxo do corante. Enquanto as populações laterais podem parecer diferentes para cada tumor, o efeito do verapamil é o mesmo: a população lateral desaparece. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55711/55711fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Isolation of the Side Population in Myc-induced T-cell Acute Lymphoblastic Leukemia in Zebrafish

Aqui, descrevemos uma técnica para isolar as células de população lateral de um modelo zebrafish de leucemia linfoblástica aguda induzida por myc-T (T-ALL). Este ensaio de população lateral é altamente sensível e é descrito para T-ALL de peixe-zebra, mas pode ser aplicável a outros tipos de células zebrafish malignas e não malignas.

De células T isolamento da população Side em Myc induzida por leucemia linfoblástica aguda no peixe-zebra

Heterogeneous cell populations, from either healthy or malignant tissues, may contain a population of cells characterized by a differential ability to ...

isolation-side-population-myc-induced-t-cell-acute-lymphoblastic

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

6.5K visualizações.  The University of Chicago.  Aqui, descrevemos uma técnica para isolar as células de população lateral de um modelo zebrafish de leucemia linfoblástica aguda induzida por myc-T (T-ALL). Este ensaio de população lateral é altamente sensível e é descrito para T-ALL de peixe-zebra, mas pode ser aplicável a outros tipos de células zebrafish malignas e não malignas. 

Vídeo: Isolation of the Side Population in Myc-induced T-cell Acute Lymphoblastic Leukemia in Zebrafish

Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen presenting cells (APCs)1. This recognition leads to the activation of T-cells and a series of functional outcomes (e.g. cytokine production, killing of the target cells). Understanding the functional role of TCRs is critical to harness the power of the immune system to treat a variety of immunology related diseases (e.g. cancer or autoimmunity).
It is convenient to study TCRs in mouse models, which can be accomplished in several ways. Making TCR transgenic mouse models is costly and time-consuming and currently there are only a limited number of them available2-4. Alternatively, mice with antigen-specific T-cells can be generated by bone marrow chimera. This method also takes several weeks and requires expertise5. Retroviral transduction of TCRs into in vitro activated mouse T-cells is a quick and relatively easy method to obtain T-cells of desired peptide-MHC specificity. Antigen-specific T-cells can be generated in one week and used in any downstream applications. Studying transduced T-cells also has direct application to human immunotherapy, as adoptive transfer of human T-cells transduced with antigen-specific TCRs is an emerging strategy for cancer treatment6.
Here we present a protocol to retrovirally transduce TCRs into in vitro activated mouse T-cells. Both human and mouse TCR genes can be used. Retroviruses carrying specific TCR genes are generated and used to infect mouse T-cells activated with anti-CD3 and anti-CD28 antibodies. After in vitro expansion, transduced T-cells are analyzed by flow cytometry.

We present a protocol to produce antigen-specific mouse T-cells using retroviral transduction

Transdução retroviral de receptor de células T no rato células T

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

Imunologia e Infecção

Genotypic Inference of HIV-1 Tropism Using Population-based Sequencing of V3

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her viral population uses the CCR5 coreceptor for cellular entry, and not an alternative coreceptor. One approach to tropism testing is to examine the sequence of the V3 region of the HIV envelope, which interacts with the coreceptor.
Methods: Viral RNA is extracted from blood plasma. The V3 region is amplified in triplicate with nested reverse transcriptase-PCR. The amplifications are then sequenced and analyzed using the software, RE_Call. Sequences are then submitted to a bioinformatic algorithm such as geno2pheno to infer viral tropism from the V3 region. Sequences are inferred to be non-R5 if their geno2pheno false positive rate falls below 5.75%. If any one of the three sequences from a sample is inferred to be non-R5, the patient is unlikely to respond to a CCR5-antagonist.

HIV tropism can be inferred from the V3 region of the viral envelope. V3 is PCR amplified in triplicate using nested RT-PCR, sequenced, and interpreted using bioinformatic software. Samples with with 1 or more sequence(s) with low g2P scores are classified as non-R5 virus.

Inferência genotípica do HIV-1 Tropismo Usando de base populacional de Seqüenciamento V3

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her ...

Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

Graft-versus-host disease (GVHD) is the limiting barrier to the broad use of bone marrow transplant as a curative therapy for a variety of hematological deficiencies. GVHD is caused by mature alloreactive T cells present in the bone marrow graft that are infused into the recipient and cause damage to host organs. However, in mice, T cells must be added to the bone marrow inoculum to cause GVHD. Although extensive work has been done to characterize T cell responses post transplant, bioluminescent imaging technology is a non-invasive method to monitor T cell trafficking patterns in vivo. 
Following lethal irradiation, recipient mice are transplanted with bone marrow cells and splenocytes from donor mice. T cell subsets from L2G85.B6 (transgenic mice that constitutively express luciferase) are included in the transplant. By only transplanting certain T cell subsets, one is able to track specific T cell subsets in vivo, and based on their location, develop hypotheses regarding the role of specific T cell subsets in promoting GVHD at various time points. At predetermined intervals post transplant, recipient mice are imaged using a Xenogen IVIS CCD camera. Light intensity can be quantified using Living Image software to generate a pseudo-color image based on photon intensity (red = high intensity, violet = low intensity). 
Between 4-7 days post transplant, recipient mice begin to show clinical signs of GVHD. Cooke et al.1 developed a scoring system to quantitate disease progression based on the recipient mice fur texture, skin integrity, activity, weight loss, and posture. Mice are scored daily, and euthanized when they become moribund. Recipient mice generally become moribund 20-30 days post transplant. 
Murine models are valuable tools for studying the immunology of GVHD. Selectively transplanting particular T cell subsets allows for careful identification of the roles each subset plays. Non-invasively tracking T cell responses in vivo adds another layer of value to murine GVHD models.

Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

Murine bone marrow transplantation is a widely used technique to study immunological mechanisms governing graft-versus-host disease in humans. The ability to monitor T cell trafficking patterns in vivo allows for detailed analysis of the development and perpetuation of T cell responses during graft-versus-host disease.

Indução de enxerto-versus-hospedeiro de Doenças e<em&gt; Em Vivo</em&gt; Monitoramento celular T Usando um modelo murino de MHC de correspondência

Graft-versus-host disease (GVHD) is the limiting barrier to the broad use of bone marrow transplant as a curative therapy for a variety of hematological ...

Real-time Live Imaging of T-cell Signaling Complex Formation

Protection against infectious diseases is mediated by the immune system 1,2. T lymphocytes are the master coordinators of the immune system, regulating the activation and responses of multiple immune cells 3,4. T-cell activation is dependent on the recognition of specific antigens displayed by antigen presenting cells (APCs). The T-cell antigen receptor (TCR) is specific to each T-cell clone and determines antigen specificity 5. The binding of the TCR to the antigen induces the phosphorylation of components of the TCR complex. In order to promote T-cell activation, this signal must be transduced from the membrane to the cytoplasm and the nucleus, initiating various crucial responses such as recruitment of signaling proteins to the TCR;APC site (the immune synapse), their molecular activation, cytoskeletal rearrangement, elevation of intracellular calcium concentration, and changes in gene expression 6,7. The correct initiation and termination of activating signals is crucial for appropriate T-cell responses. The activity of signaling proteins is dependent on the formation and termination of protein-protein interactions, post translational modifications such as protein phosphorylation, formation of protein complexes, protein ubiquitylation and the recruitment of proteins to various cellular sites 8. Understanding the inner workings of the T-cell activation process is crucial for both immunological research and clinical applications.
Various assays have been developed in order to investigate protein-protein interactions; however, biochemical assays, such as the widely used co-immunoprecipitation method, do not allow protein location to be discerned, thus precluding the observation of valuable insights into the dynamics of cellular mechanisms. Additionally, these bulk assays usually combine proteins from many different cells that might be at different stages of the investigated cellular process. This can have a detrimental effect on temporal resolution. The use of real-time imaging of live cells allows both the spatial tracking of proteins and the ability to temporally distinguish between signaling events, thus shedding light on the dynamics of the process 9,10. We present a method of real-time imaging of signaling-complex formation during T-cell activation. Primary T-cells or T-cell lines, such as Jurkat, are transfected with plasmids encoding for proteins of interest fused to monomeric fluorescent proteins, preventing non-physiological oligomerization 11. Live T cells are dropped over a coverslip pre-coated with T-cell activating antibody 8,9, which binds to the CD3/TCR complex, inducing T-cell activation while overcoming the need for specific activating antigens. Activated cells are constantly imaged with the use of confocal microscopy. Imaging data are analyzed to yield quantitative results, such as the colocalization coefficient of the signaling proteins.

We describe a live-cell imaging method that provides insight into protein dynamics during the T-cell activation process. We demonstrate the combined usage of the T-cell spreading assay, confocal microscopy and imaging analysis to yield quantitative results to follow signaling complex formation throughout T-cell activation.

Em tempo real de imagens ao vivo de células T Sinalização de Formação de Complexos

Protection against infectious diseases is mediated by the immune system 1,2. T lymphocytes are the master coordinators of the immune system, regulating ...

Culturing Microglia from the Neonatal and Adult Central Nervous System

Microglia are the resident macrophage-like cells of the central nervous system (CNS) and, as such, have critically important roles in physiological and pathological processes such as CNS maturation in development, multiple sclerosis, and spinal cord injury. Microglia can be activated and recruited to action by neuronal injury or stimulation, such as axonal damage seen in MS or ischemic brain trauma resulting from stroke. These immunocompetent members of the CNS are also thought to have roles in synaptic plasticity under non-pathological conditions. We employ protocols for culturing microglia from the neonatal and adult tissues that are aimed to maximize the viable cell numbers while minimizing confounding variables, such as the presence of other CNS cell types and cell culture debris. We utilize large and easily discernable CNS components (e.g. cortex, spinal cord segments), which makes the entire process feasible and reproducible. The use of adult cells is a suitable alternative to the use of neonatal brain microglia, as many pathologies studied mainly affect the postnatal spinal cord. These culture systems are also useful for directly testing the effect of compounds that may either inhibit or promote microglial activation. Since microglial activation can shape the outcomes of disease in the adult CNS, there is a need for in vitro systems in which neonatal and adult microglia can be cultured and studied.

We outline methods for the efficient and quick isolation/culture of viable microglia from the neonatal cerebral cortex and adult spinal cord. The dissection and plating of cortical microglia can be accomplished within 90 minutes, with the subsequent microglial harvest taking place ~ 10 days following the initial dissection.

Microglia cultura do Sistema Nervoso Central Neonatal e Adulto

Microglia are the resident macrophage-like cells of the central nervous system (CNS) and, as such, have critically important roles in physiological and ...

The Use of Fluorescent Target Arrays for Assessment of T Cell Responses In vivo

The ability to monitor T cell responses in vivo is important for the development of our understanding of the immune response and the design of immunotherapies. Here we describe the use of fluorescent target array (FTA) technology, which utilizes vital dyes such as carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE), violet laser excitable dyes (CellTrace Violet: CTV) and red laser excitable dyes (Cell Proliferation Dye eFluor 670: CPD) to combinatorially label mouse lymphocytes into &#62;250 discernable fluorescent cell clusters. Cell clusters within these FTAs can be pulsed with major histocompatibility (MHC) class-I and MHC class-II binding peptides and thereby act as target cells for CD8+ and CD4+ T cells, respectively. These FTA cells remain viable and fully functional, and can therefore be administered into mice to allow assessment of CD8+ T cell-mediated killing of FTA target cells and CD4+ T cell-meditated help of FTA B cell target cells in real time in vivo by flow cytometry. Since &#62;250 target cells can be assessed at once, the technique allows the monitoring of T cell responses against several antigen epitopes at several concentrations and in multiple replicates. As such, the technique can measure T cell responses at both a quantitative (e.g.&#160;the cumulative magnitude of the response) and a qualitative (e.g.&#160;functional avidity and epitope-cross reactivity of the response) level. Herein, we describe how these FTAs are constructed and give an example of how they can be applied to assess T cell responses induced by a recombinant pox virus vaccine.

The Use of Fluorescent Target Arrays for Assessment of T Cell Responses In vivo

The ability to monitor T cell responses in detail in vivo is important for the development of our understanding of the immune response. Here we describe the use of fluorescent target arrays (FTAs) in an in vivo T cell assay that assesses &#62;250 parameters simultaneously by flow cytometry.

O Uso de fluorescentes alvo Matrizes para a Avaliação de respostas de células T<em&gt; In vivo</em

The ability to monitor T cell responses in vivo is important for the development of our understanding of the immune response and the design of ...

An Ex vivo Model of an Oligodendrocyte-directed T-Cell Attack in Acute Brain Slices

Death of oligodendrocytes accompanied by destruction of neurons and axons are typical histopathological findings in cortical and subcortical grey matter lesions in inflammatory demyelinating disorders like multiple sclerosis (MS). In these disorders, mainly CD8+ T-cells of putative specificity for myelin- and oligodendrocyte-related antigens are found, so that neuronal apoptosis in grey matter lesions may be a collateral effect of these cells. Different types of animal models are established to study the underlying mechanisms of the mentioned pathophysiological processes. However, although they mimic some aspects of MS, it is impossible to dissect the exact mechanism and time course of &#8216;&#8216;collateral&#8217;&#8217; neuronal cell death. To address this course, here we show a protocol to study the mechanisms and time response of neuronal damage following an oligodendrocyte-directed CD8+ T cell attack. To target only the myelin sheath and the oligodendrocytes, in vitro activated oligodendrocyte-specific CD8+ T-cells are transferred into acutely isolated brain slices. After a defined incubation period, myelin and neuronal damage can be analysed in different regions of interest. Potential applications and limitations of this model will be discussed.

An Ex vivo Model of an Oligodendrocyte-directed T-Cell Attack in Acute Brain Slices

To address mechanisms of demyelination and neuronal apoptosis in cortical lesions of inflammatory demyelinating disorders, different animal models are used. We here describe an ex vivo approach by using oligodendrocyte-specific CD8+ T-cells on brain slices, resulting in oligodendroglial and neuronal death. Potential applications and limitations of the model are discussed.

Um<em&gt; Ex vivo</em&gt; Modelo de um Ataque de T-Cell dirigiu-Oligodendrocyte em Agudos fatias de cérebro

Death of oligodendrocytes accompanied by destruction of neurons and axons are typical histopathological findings in cortical and subcortical grey matter ...

Mouse Na&#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Antigen inexperienced (na&#239;ve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition of cognate antigen presented on MHC class II. The cytokine signals present in the environment at the time of TCR activation are a major factor in determining the effector fate of a na&#239;ve CD4+ T cell. Although the cytokine environment during na&#239;ve T cell activation may be complex and involve both redundant and opposing signals in vivo, the addition of various cytokine combinations during naive CD4+ T cell activation in vitro can readily promote the establishment of effector T helper lineages with hallmark cytokine and transcription factor expression. Such differentiation experiments are commonly used as a first step for the evaluation of targets believed to promote or inhibit the development of certain CD4+ T helper subsets. The addition of mediators, such as signaling agonists, antagonists, or other cytokines, during the differentiation process can also be used to study the influence of a particular target on T cell differentiation. Here, we describe a basic protocol for the isolation of na&#239;ve T cells from mouse and the subsequent steps necessary for polarizing na&#239;ve cells to various T helper effector lineages in vitro.

Mouse Na&#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Na&#239;ve CD4+ T cells polarize to various subsets depending on the environment at the time of activation. The differentiation of na&#239;ve CD4+ T cells to various effector subsets can be achieved in vitro through the addition of T cell receptor stimuli and specific cytokine signals.

Rato Naïve CD4<sup&gt; +</sup&gt; Isolamento de células T e<em&gt; In vitro</em&gt; Diferenciação em subpopulações de células T

Antigen inexperienced (na&#239;ve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition ...

Imaging CD4 T Cell Interstitial Migration in the Inflamed Dermis

The ability of CD4 T cells to carry out effector functions is dependent upon the rapid and efficient migration of these cells in inflamed peripheral tissues through an as-yet undefined mechanism. The application of multiphoton microscopy to the study of the immune system provides a tool to measure the dynamics of immune responses within intact tissues. Here we present a protocol for non-invasive intravital multiphoton imaging of CD4 T cells in the inflamed mouse ear dermis. Use of a custom imaging platform and a venous catheter allows for the visualization of CD4 T cell dynamics in the dermal interstitium, with the ability to interrogate these cells in real-time via the addition of blocking antibodies to key molecular components involved in motility. This system provides advantages over both in vitro models and surgically invasive imaging procedures. Understanding the pathways used by CD4 T cells for motility may ultimately provide insight into the basic function of CD4 T cells as well as the pathogenesis of both autoimmune diseases and pathology from chronic infections.

The mechanisms that govern the interstitial motility of CD4 effector T cells at sites of inflammation are relatively unknown. We present a non-invasive approach to visualize and manipulate in vitro-primed CD4 T cells in the inflamed ear dermis, allowing for study of the dynamic behavior of these cells in situ.

Migração intersticial imagens de células CD4 T na derme inflamadas

The ability of CD4 T cells to carry out effector functions is dependent upon the rapid and efficient migration of these cells in inflamed peripheral ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of inflammation. They are key players in the innate immune system and play major roles in cancer biology. Neutrophils have been proposed as key mediators of malignant transformation, tumor progression, angiogenesis and in the modulation of the antitumor immunity; through their release of soluble factors or their interaction with tumor cells. To characterize the specific functions of neutrophils, a fast and reliable method is coveted for in vitro isolation of neutrophils from human blood. Here, a density gradient separation method is demonstrated to isolate neutrophils as well as mononuclear cells from the blood. The procedure consists of layering the density gradient solution such as Ficoll carefully above the diluted blood obtained from patients diagnosed with chronic lymphocytic leukemia (CLL), followed by centrifugation, isolation of mononuclear layer, separation of neutrophils from RBCsby dextran then lysis of residual erythrocytes. This method has been shown to isolate neutrophils &#8805; 90 % pure. To mimic the tumor microenvironment, 3-dimensional (3D) experiments were performed using basement membrane matrix such as Matrigel. Given the short half-life of neutrophils in vitro, 3D experiments with fresh human neutrophils cannot be performed. For this reason promyelocytic HL60 cells are differentiated along the granulocytic pathway using the differentiation inducers dimethyl sulfoxide (DMSO) and retinoic acid (RA). The aim of our experiments is to study the role of neutrophils on the sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents. However these methods can be generalized to study the interactions of neutrophils or neutrophil-like cells with a large range of cell types in different situations.

Neutrophils are the most abundant type of white blood cells. The isolation of neutrophils from human blood by density gradient separation method and the differentiation of human promyelocytic (HL60) cells along the granulocytic pathway are described here; to test their role on sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents.