وأيد هذا العمل من قبل جامعة مجلس شيكاغو للمرأة، وصندوق ويندي الحالة سوف، وجامعة شيكاغو الشامل للسرطان مركز دعم جرانت (P30 CA014599). ونود أن نشكر التدفق الخلوي الأساسية في جامعة شيكاغو لمساعدتهم في تأسيس هذه التجربة، وكذلك الأعضاء الآخرين في مختبر دي يونج، ولا سيما ليزلي بيدرازا وسين مكونل.

وقد تمت الموافقة على جميع الإجراءات مع الزرد من قبل اللجنة المؤسسية رعاية الحيوان واستخدام (إاكوك) في جامعة شيكاغو. وقد تم اعتماد جامعة شيكاغو من قبل جمعية لتقييم واعتماد رعاية الحيوان المختبرية (آلاك). 1. توليد وعزل فلورزنتلي المسمى T- جميع الخلايا في الزرد <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حقن ميكروينجكتيون في الأجنة الزرد متجانسة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام مجموعات المتاحة تجاريا، عزل Rag2 دائري: ج- ميك و rag2 : البروتين الفلوري الأخضر ( rag2 : غفب) الحمض النووي البلازميد التي تحتوي على تكرار محطة مقلوب يعترف بها tol2 ترانسبوساز (انظر جدول المواد لمصدر الحمض النووي البلازميد) 12 وأزل الحمض النووي في الماء المعقم. ملاحظة: يستخدم غفب في هذه الدراسة، ولكن أي بروتين الفلورسنت العمل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد pcs2-ترانزبوسيس (tol2) الحمض النووي الريبي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عزل الحمض النووي البلازميد tol2 باستخدام مجموعات متوفرة تجاريا (انظر رانه جدول المواد للمصدر DNA البلازميد) 12 وأزل الحمض النووي في الماء المعقم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان 1 ميكروغرام من الحمض النووي tol2 عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة مع 5 وحدات من انزيم التقييد نوتي في المنطقة العازلة المناسبة لخطي البلازميد. للحرارة إبطال نشاط نوتي عند 65 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نسخ الحمض النووي الريبي tol2 مع البلمرة SP6 RNA من DNA خطي باستخدام المتاحة تجاريا عدة RNA النسخ 13. تخزين الحمض النووي الريبي في أجزاء مأخوذة تستخدم مرة واحدة في -80 ° C. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحضير مزيج الحقن على الجليد بإضافة 250 نانوغرام من rag2: ج myc DNA البلازميد، 250 نانوغرام من rag2: GFP DNA البلازميد، 150 نانوغرام من الحمض النووي الريبي tol2، و 0.5 ميكرولتر من الفينول الأحمر. ضبط مستوى الصوت إلى 10 ميكرولتر مع nuclease خالية من المياه. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حقن ~ 1 NL من مزيج الحقن في الخلية من مرحلة واحدة الخلية الجنين الزرد مسانج باستخدام microinjector وإبرة سحبها من أنبوب زجاجي الشعرية، في أعقاب سابقا إنشطرق الأساليب 8 ، 14 . ملاحظة: يتم استخدام الزرد سينجينيك التي تنتجها التوالد 15 هنا للقضاء على التغايرية الوراثية ورفض المناعة بعد زرع. ومع ذلك، يمكن استخدام الزرد ويلديب أو أي سلالة المطلوب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الأجنة ميتة، متخلفة، أو مشوه في 24 ساعة و 48 ساعة بعد الحقن 16 . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع الأسماك حقن على نظام الأسماك في 6 أيام بعد الحقن ورفعها وفقا لبروتوكول قياسي 6 . </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فحص حقن الزرد ورصد نمو الورم <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في 21 يوما بعد الحقن، ووضع يرقات حقن واحد في قطيرة من الجنين المتوسطة على طبق بتري وشاشة لمضان غفب باستخدام المجهر إبيفلورزنت (ممر الإثارة: 470/40، ممر الموجة الانبعاث: 525/50) 8 . ملاحظة: اليرقات الزرد أن hأفي متكاملة على حد سواء rag2 : ج- ميك و rag2 : سوف غفب لديها الغدة الصعترية الفلورسنت الأخضر (الأسماك الإيجابية) وربما تعرض بالفعل توسع الخلايا الفلورية الخضراء الخبيثة وراء الغدة الصعترية. جميع الأسماك مع غفب + الغدة الصعترية سوف تستمر في تطوير غفب + T-آل. اليرقات التي لا تظهر تكامل البلازميدات لن يكون أي الخلايا الفلورية الخضراء (الأسماك السلبية). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فصل الأسماك السلبية (على أساس عدم وجود مضان) في خزان مختلفة ومراقبة الأسماك مرة أخرى في 28 و 35 يوما بعد الحقن. في 28 و 35 يوما بعد الحقن، تخدير الأسماك مع 0.02٪ تريكين مخزنة (مس-222) في المياه نظام السمك قبل الفحص. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع كل يرقات الزرد التي هي إيجابية لفلورسنتلي المسمى الغدة الصعترية أو ورم فلورزنتلي المسمى في خزان الفردية لرصد نمو الورم ثلاث مرات في الأسبوع. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مجموعة من الخلايا تي-آل فلورزنتلي المسمى من الأسماك الورم الأولية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد ما لا يقل عن 20 مل من 10٪ المصل الحرارة المعطل الجنين البقري في 0.9x الفوسفات مخزنة المالحة (فبس / بس). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 1 مل من فبس / بس إلى قارورة واحدة من الملح الهيبارين الصوديوم (300 وحدة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حدد الأسماك التي تحمل الأورام في أكثر من 50٪ من الجسم، أو تلك الأسماك التي تواجه صعوبة في تناول الطعام أو السباحة. التضحية الأسماك عن طريق جرعة زائدة مع تريكين أو عن طريق الغمر بالماء الجليد. تأكيد الموت من خلال عدم وجود حركة الخيشوم ونبض القلب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدم شفرة حلاقة لإزالة رأس السمك. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل تجويف الأسماك مع الحل الهيبارين لإزالة خلايا الدم الحمراء الزائدة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام ماصة، وحقن 100 ميكرولتر من محلول الهيبارين (أعدت في الخطوة 1.3.2) في تجويف الجسم من الأسماك. إزالة كل السائل الذي يتسرب (وسوف تحتوي على خلايا الدم) وماصة في أنبوب ميكروسنتريفوج 1.5 مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام طرف ماصة جديدة لغسل الجسم مرة أخرى. أداء ما لا يقل عن ثلاثة يغسل، أو حتى السائل الذي يتسرب خارج يبدو خالية من بلالعود. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجاهل كل السائل من يغسل في الخطوات 1.3.5.1 و 1.3.5.2، كما أنها لن تستخدم في مزيد من التحليلات. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع خلايا سرطان الدم. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حقن 100 ميكرولتر من فبس / بس في تجويف الجسم من الأسماك. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطبيق ضغط لطيف على الجزء الخارجي من الجسم من الأسماك مع طرف ماصة للضغط / دفع خارج الخلايا السرطانية. ملاحظة: إذا تم تنفيذ هذه الخطوة باستخدام المجهر تشريح، فإن الخلايا السرطانية يتسرب من تجويف الجسم يكون واضحا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع السائل والخلايا من كل غسل في أنبوب ميكروسنتريفوج 1.5 مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر الخطوات 1.3.6.1-1.3.6.3 حتى يتم جمع معظم الخلايا السرطانية (عادة 5-10 مرات). جمع كل الخلايا السرطانية في نفس أنبوب ميكروسنتريفوج 1.5 مل. الحفاظ على الخلايا في درجة حرارة الغرفة. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مزيج الخلايا السرطانية التي تم جمعها من الخطوة 1.3.6 من قبل بيبتينغ بلطف لهم لفصل كتل من الخلايا. تصفية تعليق الخلية من خلال 40 ميكرون فلتر شبكة. غسل فلتر 1-2 مرات مع 100 ميكرولتر من فبس / بس. الحفاظ على الخلايا في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مزيج 2 ميكرولتر من تعليق الخلية مع 18 ميكرولتر من تريبان الأزرق (0.4٪، المخفف 01:10 وتصفيتها) في أنبوب جديد. تحميل 10 ميكرولتر على عدادة الكريات وعدد عدد الحية (غير الزرقاء) خلايا الفلورسنت لحساب عدد الخلايا السرطانية المعزولة. ملاحظة: غير الزرقاء الخلايا السلبية غفب من المرجح الطبيعي، والخلايا T غير الخبيثة ويجب ألا تحسب. مطلوب على الأقل 2 × 10 6 خلايا لصمة عار الخلايا مع هويشت 33342. </li></ol></li></ol> 2. تلطيخ فلوريسنتلي المسمى T- جميع الخلايا مع هويشت 33342 لتحديد الجانب السكان <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمييع هوشست 33342 1:10 مع نوكليس خالية H 2 O لجعل تركيز العمل 1 ملغ / مل. تخزين الصبغة في 4 درجات مئوية وفي الظلام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد حل 100 ملم من فيراباميل عن طريق إذابة 49.1 ملغ في 1 مل من سلفوكسيد ثنائي ميثيل (دمسو). ملاحظة: فيراباميل هو المانع من النقل ABC وهو عنصر تحكم الهامة للتجارب السكان الجانب. مضيفا فيراباميل لعينات تحول دون قدرة النقل ABC إلى هروب رأس المال الصبغة هويشت 33342. لذلك، سوف تختفي يبلغ عدد سكانها الجانب الصحيح عند إضافة فيراباميل للعينة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعيين حمام مائي إلى 28 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد العينات والتحكم في الظلام بإضافة الخلايا وحلول لمضان تنشيط خلية فارز (FACS) الأنابيب. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد العينات من خلال إضافة 10 6 خلايا، و 15 ميكرولتر من 1 ملغ / مل هويشت 33342، و 2.5 ميكرولتر من DMSO لأنبوب FACS. ضبط مستوى الصوت إلى 1 مل مع FBS / PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد الضوابط وذلك بإضافة 10 6 خلايا، و 15 ميكرولتر من 1 ملغ / مل هويشت 33342، و 2.5 ميكرولتر من 100 ملي فيراباميل لأنبوب FACS. ضبط مستوى الصوت إلى 1 مل مع FBS / PBS. ملاحظة: ما لا يقل عن 10 6 خلايا / يوصى عينة، ولكن تلطيخ المزيد من الخلايا وفضل، وخاصة إذا كان الجانب populatسيتم فرز الخلايا الأيونية لمزيد من التحليل. لا تتجاوز 10 6 خلايا / مل، والحفاظ على تركيز هويشت 33342 في 15 ميكروغرام / مل. إذا كانت ملطخة 10 × 10 6 خلايا، وحجم التفاعل الكلي هو 10 مل. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان في حمام مائي 28 درجة مئوية في الظلام لمدة 120 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد الحضانة، ووضع الخلايا على الفور على الجليد والاحتفاظ بها في الظلام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بيليه الخلايا في 4 درجات مئوية لمدة 6 دقائق في 300 × ز. إزالة طاف. يغسل مع 1 مل من فبس / بس. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بيليه الخلايا في 4 درجات مئوية لمدة 6 دقائق في 300 × ز. إزالة طاف. ريسوسبيند الخلايا في 1 مل من فبس / بس. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إبقاء في 4 درجات مئوية حتى الفرز الخلية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 15 دقيقة قبل الفرز الخلية، إضافة 2 ميكرولتر من يوديد بروبيديوم (بي) الأسهم (1 ملغ / مل) إلى كل 1 مل من فبس / بس (تركيز النهائي: 2 ميكروغرام / مل). اخلط جيدا. </li></ol> 3. استخدام فاكس لإيجاد السكان الجانب داخل فلوريسنتلي المسمى T-آل السكان الخلية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li&gt; تحليل الزرد الملون T-آل تعليق الخلية على فارز الخلية مجهزة ليزر الأشعة فوق البنفسجية ل هويشت 33342 الإثارة صبغ و 488 نانومتر ليزر ل بي الإثارة والكشف عن الخلايا غفب + T- آل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد بوابة للعيش، غفب + T-آل الخلايا. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام مبعثر إلى الأمام (فسك) ومنطقة الجانب مبعثر (سك) لخروج الحطام. ملاحظة: يستخدم فسك للتمييز بين حجم الخلية ويستخدم سك للتمييز بين تحبب الخلية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام فسك وعرض سك لتمييز دوبلتس. ملاحظة: هناك ثلاثة مكونات التي حددتها أجهزة الكشف عن التدفق الخلوي: المنطقة، الطول، والعرض. منطقة عادة ما تستخدم لقياس مضان الخلية. ويقيس العرض زمن الرحلة، ويضاعف عرضه مرتين إذا تم تجميع خليتين معا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> للخلايا السرطانية الحية، رسم بوابة حول الخلايا إيجابية ل غفب والسلبية ل بي باستخدام كاشفات مناسبة (على سبيل المثال ، فيتس ل غفب و بيركب Cy5-5 ل بي). </li></ol></li><li&gt; في باب الخلية الحية، وقياس هويشت 33342 مضان من خلال هويشت الأزرق والأحمر هويشت مرشحات ممر الموجة (450/50 و 670/30، على التوالي). ملاحظة: سكان الجانب، إذا كان موجودا، سوف يكون واضحا بعد تعيين هذا الأمر. الأهم من ذلك، يجب على السكان الجانب تختفي في السيطرة فيراباميل من أجل أن يعتبر السكان الجانب الصحيح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا فرز الخلايا السكان الجانب لمزيد من التجارب، استخدم طرف فوهة كبيرة (100 ميكرون)، وجمع الخلايا في أنبوب FACS تحتوي على 3 مل من 100٪ FBS. استخدام تلميح أكبر فوهة (100 ميكرون) بدلا من غيض أصغر (70 ميكرون) لتحسين بقاء الخلية بعد الفرز. </li></ol>

<ol>
	<li>Goodell, M., Brose, K., Paradis, G., Conner, A., Mulligan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+functional+properties+of+murine+hematopoietic+stem+cells+that+are+replicating+in+vivo.">Isolation and functional properties of murine hematopoietic stem cells that are replicating in vivo.</a> J. Exp. Med. 183, 1797-1806 (1996).</li><li>Golebiewska, A., Brons, N. H. C., Bjerkvig, R., Niclou, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+appraisal+of+the+side+population+assay+in+stem+cell+and+cancer+stem+cell+research.">Critical appraisal of the side population assay in stem cell and cancer stem cell research.</a> Cell Stem Cell. 8, 136-147 (2011).</li><li>Dooley, K., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish:+a+model+system+for+the+study+of+human+disease.">Zebrafish: a model system for the study of human disease.</a> Curr Opin Genet Dev. 10 (3), 252-256 (2000).</li><li>White, R., Rose, K., Zon, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+cancer:+the+state+of+the+art+and+the+path+forward.">Zebrafish cancer: the state of the art and the path forward.</a> Nat Rev Cancer. 13 (9), 624-636 (2013).</li><li>Kobayashi, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+and+localization+of+side+population+(SP)+cells+in+zebrafish+kidney+hematopoietic+tissue.">Characterization and localization of side population (SP) cells in zebrafish kidney hematopoietic tissue.</a> Blood. 111 (3), 1131-1137 (2008).</li><li>Tsinkalovsky, O., Vik-Mo, A. O., Ferreira, S., Laerum, O. D., Fjose, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+kidney+marrow+contains+ABCG2-dependent+side+population+cells+exhibiting+hematopoietic+stem+cell+properties.">Zebrafish kidney marrow contains ABCG2-dependent side population cells exhibiting hematopoietic stem cell properties.</a> Differentiation. 75 (3), 175-183 (2007).</li><li>Langenau, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myc-induced+T+cell+leukemia+in+transgenic+zebrafish.">Myc-induced T cell leukemia in transgenic zebrafish.</a> Science. 299, 887-890 (2003).</li><li>Blackburn, J. S., Liu, S., Langenau, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+the+frequency+of+tumor-propagating+cells+using+limiting+dilution+cell+transplantation+in+syngeneic+zebrafish.">Quantifying the frequency of tumor-propagating cells using limiting dilution cell transplantation in syngeneic zebrafish.</a> J Vis Exp. , e2790 (2011).</li><li>Martelli, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+signaling+pathways+in+T-cell+acute+lymphoblastic+leukemia+initiating+cells.">Targeting signaling pathways in T-cell acute lymphoblastic leukemia initiating cells.</a> Adv Biol Regul. 56, 6-21 (2014).</li><li>Smith, A. C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+cell+transplantation+establishes+that+tumor-initiating+cells+are+abundant+in+zebrafish+T-cell+acute+lymphoblastic+leukemia.">High-throughput cell transplantation establishes that tumor-initiating cells are abundant in zebrafish T-cell acute lymphoblastic leukemia.</a> Blood. 115 (16), 3296-3303 (2010).</li><li>Blackburn, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+evolution+enhances+leukemia-propagating+cell+frequency+in+T+cell+acute+lymphoblastic+leukemia+through+Akt/mTORC1+pathway+activation.">Clonal evolution enhances leukemia-propagating cell frequency in T cell acute lymphoblastic leukemia through Akt/mTORC1 pathway activation.</a> Cancer Cell. 25, 366-378 (2014).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+Methods+in+Cellular+and+Molecular+Biology.+Plasmid+Purification.">Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Plasmid Purification.</a> JoVE Science Education Database. , (2016).</li><li>Kawakami, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tol2:+a+versatile+gene+transfer+vector+in+vertebrates.">Tol2: a versatile gene transfer vector in vertebrates.</a> Genome Biol. 8, (2007).</li><li>Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microinjection+of+zebrafish+embryos+to+analyze+gene+function.">Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function.</a> J Vis Exp. (25), (2009).</li><li>Mizgireuv, I. V., Revskoy, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantable+tumor+lines+generated+in+clonal+zebrafish.">Transplantable tumor lines generated in clonal zebrafish.</a> Cancer Research. 66 (6), 3120-3125 (2006).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Zebrafish Book: A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish. , (1993).</li><li>Hirschmann-Jax, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+distinct+"side+population"+of+cells+with+high+drug+efflux+capacity+in+human+tumor+cells.">A distinct "side population" of cells with high drug efflux capacity in human tumor cells.</a> Proc Natl Acad Sci. USA. 101 (39), 14228-14233 (2004).</li><li>Komuro, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+side+population+cells+(stem-like+cell+population)+in+pediatric+solid+tumor+cell+lines.">Identification of side population cells (stem-like cell population) in pediatric solid tumor cell lines.</a> J Pediatr Surg. 42 (12), 2040-2045 (2007).</li><li>Moshaver, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+small+subpopulation+of+candidate+leukemia-initiating+cells+in+the+side+population+of+patients+with+acute+myeloid+leukemia.">Identification of a small subpopulation of candidate leukemia-initiating cells in the side population of patients with acute myeloid leukemia.</a> Stem Cells. 26 (12), 3059-3067 (2008).</li></ol>

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

فحص السكان الجانب حساس للغاية. وبالتالي، يمكن التغييرات الطفيفة على البروتوكول يؤدي إلى صعوبة في الكشف عن خلايا سكان الجانب. أولا، ودرجة الحرارة خلال تلطيخ خطوة هي خاصة بكل نظام الحيوانية / الخلية. لأنظمة الثدييات، يتم إجراء فحص سكان الجانب عادة عند 37 درجة مئوية 2. عندما حضنت الزرد T-ALL الخلايا عند 37 درجة مئوية، وكثير من الخلايا مات، مما يجعل درجة الحرارة هذه الحضانة غير مقبولة (لا تظهر البيانات). عندما تشريح كوباياشي وزملاؤه (2008) نخاع الكلى الزرد لفحص السكان الجانب، نفذت حضانات بها في 25 ° C 5. كانت درجة الحرارة هذه الحضانة ليست كافية لالزرد T-ALL الخلايا، كما أنه أدى إلى ضعف هويشت 33342 الملف (لا تظهر البيانات). في بروتوكول الموصوفة هنا، كانت درجة حرارة الحضانة من 28 ° C المثلى للحفاظ على بقاء الخلية وتحقيق قوي هويشت 33342 الشخصي. الشرط الثاني للمقايسة السكان الجانب الذي يتطلب دراسة واختبار مسبق لتركيز هويشت 33342. إذا كان تركيز هويشت 33342 منخفض جدا، فإن عدد سكان الجانب قد لا تكون مرئية، أو النمط الظاهري السكان الجانب (صبغ القدرة هروب رأس المال) قد يمكن زيادة زورا، وتحديد الخلايا السكان أكثر جانبية من هي في الواقع الحاضر 2. من ناحية أخرى، مرتفعة جدا من تركيز هويشت 33342 يمكن أن تكون سامة للخلايا. لT-ALL الزرد الخلايا، 15 ميكروغرام / مل هويشت 33342 المحتضنة لمدة 120 دقيقة هو مزيج الأمثل. وحوكم تركيزات أقل من هويشت 33342 لT-ALL الزرد الخلايا، ولكن كان عدد السكان الجانب ليس دائما واضحا (لا تظهر البيانات). وكان من فترة حضانة الكلي لل90 دقيقة كافية للكشف عن سكان الجانب، ولكن كان ينظر إلى العدد الأقصى من الخلايا السكان الجانبية بعد 120 دقيقة من الوقت الحضانة. كما ذكرت سابقا عن الصورة الثدييات<html> يستيمز، وليس كل الورم سيكون لها سكان الجانب كشفها 17 ، 18 ، 19 . باستخدام هذه الطريقة، لاحظنا سكان الجانب في 14 من 17 T-ألز اختبار (لا تظهر البيانات). بعد عزل الخلايا السكانية الجانبية من T-ألز، ومن المتوقع أن تكون قابلة للتطبيق على نماذج الورم الزرد الأخرى هذه الطريقة. داخل الزرد غير متجانسة T-آل الورم، وخلايا سرطان الدم بدء الخلايا (ليس) قادرة على إعادة نمو الورم، وعلى هذا النحو يعتقد أنها مسؤولة عن تكرار السرطان والانبثاث. حاليا، لا توجد طريقة في الزرد الذي يسمح لعزل المحتملين من الكائنات الحية المحورة في الجسم الحي . حساب تردد ليك يتطلب زرع الخلايا السرطانية في التخفيف الحد 8 ، 10 . وقد نشرت الدراسات التي نشرت سابقا مع الزرد نسيلي أن الليكوس تشكل 0.1-1.4٪ من الخلايا الأولية T-آل&quot;كريف&quot;&gt; 10. هنا، يتم الإبلاغ عن التباين مماثل في وتيرة الخلايا السكانية الجانبية (0.2-1.0٪) من الزرد نسلي T-ألز ( الشكل 2 ). وهناك حاجة إلى مزيد من التجارب لتحديد ما إذا كان السكان الجانبيون يثريون في البلدان المنخفضة الدخل؛ ومع ذلك، فإن التشابه بين نطاقات تردد ليك ونسبة الخلايا السكانية الجانبية في هذه T-ألز تدعم هذه الفرضية. في حين أن فحص السكان الجانب حساس وليس من السهل دائما لأداء، وفحص يسمح للباحثين، لأول مرة، لعزل السكان النادرين من الخلايا في الزرد T-آل التي قد يكون لها خصائص الخلايا الجذعية أو السلف. لا توجد حاليا علامات سطح الخلية المتاحة في الزرد لتحديد الخلايا الجذعية أو السلف مثل؛ وبالتالي، فإن القدرة على عزل السكان الجانب واعدة جدا. التطبيقات المستقبلية لهذه الطريقة تشمل الحد من التجارب زرع التخفيف من فرزها الجانب السكان T-آل الخلايا لتقييم إثراء Lالمرحلية. وبالإضافة إلى ذلك، فإن هذه الطريقة تسمح الخصائص التي تحدد البلدان المنخفضة الدخل ليتم توضيحها، بما في ذلك الآليات الجزيئية التي تحكم البلدان المنخفضة الدخل في الزرد T-آل. هذه التجارب يمكن أن توفر نقطة انطلاق لاكتشاف أهداف علاجية جديدة ل T-آل.

المقياس السكاني الجانب يستفيد من تعزيز قدرة خلايا معينة داخل الأنسجة ل إفلوكس الحمض النووي ملزمة صبغ هويشت 33342 بسبب مستويات عالية من البروتين أتب ملزمة (أبك) البروتينات الناقل على غشاء الخلية. الخلايا التي تفرغ صبغ هويشت 33342 يمكن تحديدها باستخدام تحليل الطول الموجي المزدوج تحليل سايتوميتريك بعد صبغ متحمس بواسطة ليزر الأشعة فوق البنفسجية. وقد استخدم هذا الفحص لأول مرة لتحديد الخلايا الجذعية المكونة للدم الفئران (هسس) 1 ، ولكنها استخدمت منذ ذلك الحين لتحديد السكان الخلايا الجذعية / السلف في العديد من الأنسجة والسرطانات (استعرض في المرجع 2). ومع ذلك، ليس كل السكان من الخلايا لديها سكان الجانب، وليس إثراء جميع السكان الجانب للخلايا الجذعية / السلف. الزرد هو نظام نموذج وراثي الفقاريات قوية لدراسة السرطان البشري 3 ، 4 ، مع عدد من المزايا على مو التقليدية الفئرانديلس، بسبب، برج السرطان. وتخصيب الأجنة الزرد خارجيا وهي واضحة بصريا، وتسهيل ترانزجينيسيس والمراقبة في الجسم الحي من العمليات المرضية، بما في ذلك بدء السرطان والتقدم. وحتى الآن، وقد تم تطبيق فحص السكان الجانب للكشف عن الجذعية المحتملة أو الخلايا السلف فقط إلى نخاع الكلى في الزرد لتحديد هسس، وليس إلى أي نماذج السرطان الزرد 5 ، 6 . نموذج الزرد من الخلايا التائية سرطان الدم الليمفاوي الحاد (T-آل) هو شكليا وراثيا مماثلة للإنسان T-آل 7 ، 8 ، 11 . T-آل هو خبيثة عدوانية التي، في البشر، تمثل 10-15٪ من الأطفال و 25٪ من البالغين جميع الحالات 9 . في حين أن علاج T-آل قد تحسنت، والانتكاس لا يزال شائعا ويرتبط مع سوء التشخيص. الأورام T-آل هي غير متجانسةأوس وتحتوي على العديد من المجموعات السكانية الفرعية للورم مختلفة، بما في ذلك خلايا بدء سرطان الدم (ليس). وتعرف المركبات الليفية الليفية عن طريق قدرتها على إعادة نمو الورم بأكمله من خلية واحدة، ويمكن حساب تواتر الخلايا الليفية داخل خلايا الخلايا السرطانية عن طريق زرع جرعات خلايا متفاوتة إلى مستلمين عن طريق مقايسة زرع التخفيف المحدود (لدا). في حين أجريت تجارب لدا في الزرد لحساب وتيرة الليكود 8 ، 10 ، 11 ، ويتم هذا التحديد في وقت متأخر ولا يسمح لعزلة المحتملين من البلدان المنخفضة الدخل. لذلك، هناك طريقة لعزل مستقبلي للسكان المخصب لنشاط الخلايا الجذعية السرطانية غير موجودة. تحديد وعزل الخلايا السكانية الجانبية من الزرد T-ألز هو الخطوة الأولى نحو معالجة هذا النقص. بروتوكول المعروضة هنا يصف كيفية توليد بكفاءة T- آل أورام في زبرأفيش باستخدام ترانسجينيسيس tol2 بوساطة، وحصاد خلايا الأورام T-آل، وصمة عار لهم مع هويشت 33342 لتحديد الجانب السكان من الخلايا. المستقبل في التجارب المجراة مع الزرد T-آل يمكن أن تشمل ما إذا كان يتم إثراء الخلايا السكانية الجانبية لل ليكس أو يكون لها خصائص أخرى الجذعية أو السلف.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="859">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:245px;">Syngeneic zebrafish (CG2)</td>
			<td style="width:199px;"></td>
			<td style="width:208px;"></td>
			<td style="width:208px;">See Mizgireuv et al., 2006</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:245px;">rag2:c-myc plasmid</td>
			<td style="width:199px;"></td>
			<td style="width:208px;"></td>
			<td>Langenau Laboratory</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:245px;">rag2:GFP plasmid constructed in de Jong Lab</td>
			<td style="width:199px;"></td>
			<td style="width:208px;"></td>
			<td style="width:208px;">rag2 promoter from Langenau Laboratory</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:245px;">pCS2-transposase plasmid</td>
			<td style="width:199px;"></td>
			<td style="width:208px;"></td>
			<td>Chien Laboratory</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:245px;">NotI -HF restriction enzyme</td>
			<td style="width:199px;">New England Bio-Labs Inc.</td>
			<td>R3189S</td>
			<td>500 units in 25 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:245px;">mMessage Machine SP6 Transcription Kit</td>
			<td style="width:199px;">Ambion</td>
			<td style="width:208px;">Thermo Fisher Scientific - AM1340</td>
			<td>25 reactions</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:245px;">QIAGEN Plasmid Midi Kit</td>
			<td style="width:199px;">Qiagen, Inc.</td>
			<td style="width:208px;">12643</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:245px;">SteREO Discovery V8 Microscope</td>
			<td style="width:199px;">Carl Zeiss Microscopy</td>
			<td>495015-0008-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:245px;">Digital microinjector</td>
			<td style="width:199px;">Tritech Research</td>
			<td>MINJ-D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:245px;">Brass straight-arm needle holder</td>
			<td style="width:199px;">Tritech Research</td>
			<td>MINJ-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:245px;">Magnetic base and stand</td>
			<td style="width:199px;">Tritech Research</td>
			<td>MINJ-HBMB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:245px;">Micromanipulator</td>
			<td style="width:199px;">Narishige International</td>
			<td style="width:208px;">MN153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:245px;">Glass capillaries</td>
			<td style="width:199px;">Sutter Instrument Co.</td>
			<td style="width:208px;">B100-50-10</td>
			<td>10 cm without filament</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:245px;">Flaming/Brown micropipette puller</td>
			<td style="width:199px;">Sutter Instrument Co.</td>
			<td style="width:208px;">P-97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:245px;">Microloader pipette tips</td>
			<td style="width:199px;">Eppendorf North America Inc.</td>
			<td>930001007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:245px;">Phenol Red solution</td>
			<td style="width:199px;">Sigma Life Science</td>
			<td style="width:208px;">P0290</td>
			<td>0.5% concentration 100 mL</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:245px;">Plastic Transfer pipettes</td>
			<td style="width:199px;">Fisherbrand</td>
			<td>137119D</td>
			<td>graduated 7.5 mL bulb</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Tricaine methanesulfonate (MS-222)</td>
			<td style="width:199px;">Western Chemical, Inc.</td>
			<td style="width:208px;">Fisher Scientific - NC0342409</td>
			<td>100 g</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:245px;">Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td style="width:199px;">HyClone Laboratories, Inc.</td>
			<td style="width:208px;">Fisher Scientific - SH3007103</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:245px;">Phosphate-Buffered Saline (PBS)</td>
			<td style="width:199px;">Gibco by Life Technologies</td>
			<td style="width:208px;">1001-023</td>
			<td>pH 7.4 (1x) - 500 mL</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:245px;">Heparin sodium salt</td>
			<td style="width:199px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:208px;">2106</td>
			<td>15 - 300 unit vials</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:245px;">40 um mesh filter</td>
			<td style="width:199px;">Falcon Corning Brand</td>
			<td style="width:208px;">352340</td>
			<td>Case of 50</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:245px;">Trypan blue</td>
			<td style="width:199px;">Sigma Life Science</td>
			<td style="width:208px;">T8154</td>
			<td>20 mL - Solution (0.4%)</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:245px;">Hoechst 33342</td>
			<td style="width:199px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:208px;">H3570</td>
			<td>10 mL</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:245px;">Verapamil</td>
			<td style="width:199px;">Sigma Life Science</td>
			<td style="width:208px;">V4629</td>
			<td>1 g</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:245px;">Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td style="width:199px;">Sigma Life Science</td>
			<td style="width:208px;">D8418</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:245px;">Propidium Iodide</td>
			<td style="width:199px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:208px;">P3566</td>
			<td>10 mL</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">FACSAria Fusion cell sorter</td>
			<td style="width:199px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:208px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:245px;">BD FACSDiva 8.0.1</td>
			<td style="width:199px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:208px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:245px;">FlowJo v10.2</td>
			<td style="width:199px;">FlowJo, LLC</td>
			<td style="width:208px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of the side population in myc-induced t-cell acute lymphoblastic leukemia in zebrafish

قد تحتوي على السكان الخلايا غير المتجانسة، سواء من أنسجة صحية أو خبيثة، مجموعة من الخلايا التي تتميز القدرة التفاضلية ل إفلوكس الحمض النووي ملزم صبغ هويشت 33342. هذا &quot;الجانب السكان&quot; من الخلايا يمكن تحديدها باستخدام أساليب تدفق سايتوميتريك بعد هويشت 33342 صبغ هو متحمس بواسطة الأشعة فوق البنفسجية (أوف) الليزر. السكان الجانب من العديد من أنواع الخلايا يحتوي على الجذعية أو السلف مثل الخلايا. ومع ذلك، ليس كل أنواع الخلايا لديها عدد سكان يمكن التعرف عليها. دانيو ريريو ، الزرد، لديها قوية في نموذج الجسم الحي من الخلايا التائية سرطان الدم الليمفاوي الحاد (T-آل)، ولكن ما إذا كانت هذه الزرد T-ألز لديها سكان الجانب غير معروف. الطريقة الموصوفة هنا الخطوط العريضة لكيفية عزل الخلايا السكانية الجانبية في الزرد T-آل. للبدء، يتم إنشاء T-آل في الزرد عن طريق ميكروينجكتيون من البلازميدات tol2 في الأجنة مرحلة واحدة الخلية. مرة واحدة وقد نمت الأورام إلى مرحلة التي تتوسع في أكثر من نصف العانيجسم مال، يمكن حصاد الخلايا T-آل. ثم تلطخ الخلايا مع هويشت 33342 وفحصها عن طريق التدفق الخلوي للخلايا السكان الجانبية. هذه الطريقة لديها تطبيقات واسعة في الزرد T- جميع البحوث. في حين لا توجد علامات سطح الخلية المعروفة في الزرد التي تؤكد ما إذا كانت هذه الخلايا السكانية الجانبية هي سرطان الخلايا الجذعية مثل، في الجسم الحي فحوصات زرع وظيفية ممكنة. وعلاوة على ذلك، يمكن تطبيق ترانسكريبتوميكس خلية واحدة لتحديد السمات الوراثية لهذه الخلايا السكانية الجانبية.

لتوليد بكفاءة الفلورسنت الفطرية التي يسببها T- آل الأورام في الزرد، يبني دنا دائرية يحيط بها tol2 مواقع ترانسبوساز يمكن أن يكون شارك في حقن مع tol2 الحمض النووي الريبي. الدراسات السابقة من حقن الحمض النووي الخطي في الأجنة الزرد تقرير معدل ترانزجينيسيس 5٪ 8 . مع بروتوكول تعديلها لتشمل ترانسجينيسيس tol2 بوساطة، معدلات ترانزجينيسيس تتراوح بين 10-44٪ يمكن ملاحظتها ( الجدول 1 ). في المثال ممثل، وقد ملطخة سمكة مع غفب + T-آل مع هويشت 33342 لتحديد النسبة المئوية للخلايا في الجانب السكان. ويبين الشكل 1 مخطط التباعد المستخدمة لتحديد النسبة المئوية للخلايا السكانية الجانبية. أولا، وذلك باستخدام فسك و سك، يتم عزل الخلايا T-آل من خلال استبعاد الحطام ( الشكل 1A ) واختيار في وقت لاحق ضد دوبلتس ( الشكل 1B ). المقبل، يتم عزل جميع الخلايا الحية عن طريق الخلايا التي ينحدر منها غفب + والسلبية للميتة ميتة الخلية بي ( الشكل 1C ). مرة واحدة يتم اختيار واحدة، وتعيش خلايا T-آل، يمكن العثور على السكان الجانب في الملف الشخصي هويتش 33342. في الخلية الرئيسية السكان، هويشت 33342 لا يزال في الخلايا، وهذه الخلايا يمكن فصلها إلى مجموعات من محتوى الحمض النووي. ومع ذلك، فإن السكان الجانب من الخلايا يمكن تمييزها عن السكان الخلية الرئيسية، كما خلايا السكان الجانب يفرغ الصبغة بسبب ارتفاع أعداد الناقلين أبك على غشاء الخلية. لتصور السكان الجانب، ويستخدم الملف الشخصي هويشت لمقارنة قناتين، هويشت الأزرق وهويشت الأحمر. السكان الجانب هو ذيل خافت من الخلايا تمتد من الجانب الأيسر من السكان الخلية الرئيسية نحو المحور الأزرق هويشت ( الشكل 1D ). سيتم فقدان السكان الجانب الحقيقي عندما يتم التعامل مع الخلايا مع مثبط oو أبك الناقلين، مثل فيراباميل. ويبين الشكل 2 السكان الجانب في العديد من الأورام ممثل T-آل، وكذلك عندما يتم التعامل مع تلك الأورام مع فيراباميل خلال تلطيخ مع هويشت 33342. للتأكد من أن السكان وجدت في العينة هو السكان الجانب الحقيقي، يجب أن تختفي هذه الخلايا في وجود المانع، كما هو مبين في الشكل 2 . <table height="525" width="487" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> عدد الأسهم </td><td> عدد الأسماك مفروز </td><td> عدد إيجابي </td><td> معدل ترانزجينيسيس </td></tr><tr><td> 930 </td><td> 21 </td><td> 3 </td><td> 14.3٪ </td></tr><tr><td> 934 </td><td> 12 </td><td> 4 </td><td> 33.3٪ </td></tr><tr><td> 950 </td><td> 12 </td><td> 5 </td><td> 41.7٪ </td></tr><tr><td> 951 </td><td> 19 </td><td> 3 </td><td> 15.8٪ </td></tr><tr><td> 960 </td><td> 3 &lt;/ td&gt; <td> 1 </td><td> 33.3٪ </td></tr><tr><td> 983 </td><td> 9 </td><td> 4 </td><td> 44.4٪ </td></tr><tr><td> 1004 </td><td> 30 </td><td> 3 </td><td> 10.0٪ </td></tr><tr><td> 1013 </td><td> 4 </td><td> 1 </td><td> 25.0٪ </td></tr><tr><td> 1025 </td><td> 35 </td><td> 5 </td><td> 14.3٪ </td></tr><tr><td> 1029 </td><td> 10 </td><td> 2 </td><td> 20.0٪ </td></tr><tr><td> 1065 </td><td> 5 </td><td> 1 </td><td> 20.0٪ </td></tr><tr><td> 1070 </td><td> 6 </td><td> 1 </td><td> 16.7٪ </td></tr><tr><td> 1073 </td><td> 19 </td><td> 8 </td><td> 42.1٪ </td></tr><tr><td> 1079 </td><td> 8 </td><td> 1 </td><td> 12.5٪ </td></tr><tr><td> 1105 </td><td> 38 </td><td> 7 </td><td> 18.4٪ </td></tr><tr><td> 1193 </td><td> 30 </td><td> 8 </td><td> 26.7٪ </td></tr><tr><td> 1215 </td><td> 9 </td><td> 1 </td><td> 11.1٪ </td></tr><tr><td>1229 </td><td> 10 </td><td> 2 </td><td> 20.0٪ </td></tr><tr><td> 1314 </td><td> 6 </td><td> 1 </td><td> 16.7٪ </td></tr></tbody></table> الجدول 1: معدلات ترانزجينيسيس عند استخدام tol2 ترانسبوسيز ل ميكروينجكتيون البلازميد في الأجنة الزرد. وتظهر معدلات محسوبة ترانزجينيسيس لمدة تسعة عشر أيام حقن منفصلة. يمثل عدد الأسماك التي تم فرزها عدد الأسماك التي بقيت على قيد الحياة بعد 21 يوما من الحقن، وعدد إيجابي يمثل عدد الأسماك التي كانت إيجابية لأورام الفلورسنت. <img alt="شكل 1" src="/files/ftp_upload/55711/55711fig1.jpg" /> الشكل 1: مخطط ترحيل السكان الجانبي. مثال على مخطط المباعدة المستخدمة لتحديد السكان الجانب في غفب + T-آل في الزرد. ( A ) أولا، يستبعد الحطام باستعمال الانتثار الأمامي (فسك) والجانب مبعثر (SSC) المنطقة. (B) المقبل، يتم عزل الخلايا واحد من خلال التمييز ضد الحلل باستخدام FSC والمعلمات عرض المؤسسة. (C) ولما كان هذا المثال الورم GFP +، يجب أن تكون جميع الخلايا الحية GFP + والسلبية للخلية علامة الميتة التأيد Propidium. (D) عدد السكان الجانب ويمكن رؤية مع هويشت الأحمر مقابل الشخصي هويشت الأزرق. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55711/55711fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الشكل 2" src="/files/ftp_upload/55711/55711fig2.jpg" /> الشكل 2: يختفي جانب السكان عندما تعامل مع ABC الناقل المانع، فيراباميل. وترد بوابات للسكان الجانب. وتظهر لوحات أعلى أربع عينات الأورام المختلفة. ومن المهم أن نلاحظ أنه ليست كل الأورام لديهم نفس نسبة السكان الجانب، وكاليفورنيا سكان الجانبن تبدو مختلفة لكل ورم اختبار. وتظهر لوحات أسفل عينات الأورام التي كانت تعامل مع فيراباميل خلال تلطيخ مع هويشت 33342 لمنع صبغ هروب رأس المال. في حين أن السكان الجانب قد تبدو مختلفة لكل الورم، وتأثير فيراباميل هو نفسه: يختفي السكان الجانب. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55711/55711fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of the Side Population in Myc-induced T-cell Acute Lymphoblastic Leukemia in Zebrafish at JoVE.com

Isolation of the Side Population in Myc-induced T-cell Acute Lymphoblastic Leukemia in Zebrafish

هنا، نحن تصف تقنية لعزل الخلايا السكان الجانب من نموذج الزرد من التي يسببها MYC T خلايا سرطان الدم الليمفاوي الحاد (T-ALL). هذا الاختبار السكان الجانب حساس للغاية، ويوصف لالزرد T-ALL، لكنها قد تكون قابلة للتطبيق لأنواع الخلايا الزرد الخبيثة وغير الخبيثة الأخرى.

عزل السكان الجانب في الخلايا التائية التي يسببها ميك الخلايا اللمفاوية الحادة اللمفاوية في الزرد

Heterogeneous cell populations, from either healthy or malignant tissues, may contain a population of cells characterized by a differential ability to ...

isolation-side-population-myc-induced-t-cell-acute-lymphoblastic

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

6.5K Views.  The University of Chicago.  هنا، نحن تصف تقنية لعزل الخلايا السكان الجانب من نموذج الزرد من التي يسببها MYC T خلايا سرطان الدم الليمفاوي الحاد (T-ALL). هذا الاختبار السكان الجانب حساس للغاية، ويوصف لالزرد T-ALL، لكنها قد تكون قابلة للتطبيق لأنواع الخلايا الزرد الخبيثة وغير ?...

Video: Isolation of the Side Population in Myc-induced T-cell Acute Lymphoblastic Leukemia in Zebrafish

Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen presenting cells (APCs)1. This recognition leads to the activation of T-cells and a series of functional outcomes (e.g. cytokine production, killing of the target cells). Understanding the functional role of TCRs is critical to harness the power of the immune system to treat a variety of immunology related diseases (e.g. cancer or autoimmunity).
It is convenient to study TCRs in mouse models, which can be accomplished in several ways. Making TCR transgenic mouse models is costly and time-consuming and currently there are only a limited number of them available2-4. Alternatively, mice with antigen-specific T-cells can be generated by bone marrow chimera. This method also takes several weeks and requires expertise5. Retroviral transduction of TCRs into in vitro activated mouse T-cells is a quick and relatively easy method to obtain T-cells of desired peptide-MHC specificity. Antigen-specific T-cells can be generated in one week and used in any downstream applications. Studying transduced T-cells also has direct application to human immunotherapy, as adoptive transfer of human T-cells transduced with antigen-specific TCRs is an emerging strategy for cancer treatment6.
Here we present a protocol to retrovirally transduce TCRs into in vitro activated mouse T-cells. Both human and mouse TCR genes can be used. Retroviruses carrying specific TCR genes are generated and used to infect mouse T-cells activated with anti-CD3 and anti-CD28 antibodies. After in vitro expansion, transduced T-cells are analyzed by flow cytometry.

We present a protocol to produce antigen-specific mouse T-cells using retroviral transduction

تنبيغ من فيروسات تي خلية المستقبلات في الخلايا التائية ماوس

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

Genotypic Inference of HIV-1 Tropism Using Population-based Sequencing of V3

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her viral population uses the CCR5 coreceptor for cellular entry, and not an alternative coreceptor. One approach to tropism testing is to examine the sequence of the V3 region of the HIV envelope, which interacts with the coreceptor.
Methods: Viral RNA is extracted from blood plasma. The V3 region is amplified in triplicate with nested reverse transcriptase-PCR. The amplifications are then sequenced and analyzed using the software, RE_Call. Sequences are then submitted to a bioinformatic algorithm such as geno2pheno to infer viral tropism from the V3 region. Sequences are inferred to be non-R5 if their geno2pheno false positive rate falls below 5.75%. If any one of the three sequences from a sample is inferred to be non-R5, the patient is unlikely to respond to a CCR5-antagonist.

HIV tropism can be inferred from the V3 region of the viral envelope. V3 is PCR amplified in triplicate using nested RT-PCR, sequenced, and interpreted using bioinformatic software. Samples with with 1 or more sequence(s) with low g2P scores are classified as non-R5 virus.

الاستدلال الوراثي من HIV - 1 Tropism باستخدام السكان على أساس تسلسل V3

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her ...

Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

Graft-versus-host disease (GVHD) is the limiting barrier to the broad use of bone marrow transplant as a curative therapy for a variety of hematological deficiencies. GVHD is caused by mature alloreactive T cells present in the bone marrow graft that are infused into the recipient and cause damage to host organs. However, in mice, T cells must be added to the bone marrow inoculum to cause GVHD. Although extensive work has been done to characterize T cell responses post transplant, bioluminescent imaging technology is a non-invasive method to monitor T cell trafficking patterns in vivo. 
Following lethal irradiation, recipient mice are transplanted with bone marrow cells and splenocytes from donor mice. T cell subsets from L2G85.B6 (transgenic mice that constitutively express luciferase) are included in the transplant. By only transplanting certain T cell subsets, one is able to track specific T cell subsets in vivo, and based on their location, develop hypotheses regarding the role of specific T cell subsets in promoting GVHD at various time points. At predetermined intervals post transplant, recipient mice are imaged using a Xenogen IVIS CCD camera. Light intensity can be quantified using Living Image software to generate a pseudo-color image based on photon intensity (red = high intensity, violet = low intensity). 
Between 4-7 days post transplant, recipient mice begin to show clinical signs of GVHD. Cooke et al.1 developed a scoring system to quantitate disease progression based on the recipient mice fur texture, skin integrity, activity, weight loss, and posture. Mice are scored daily, and euthanized when they become moribund. Recipient mice generally become moribund 20-30 days post transplant. 
Murine models are valuable tools for studying the immunology of GVHD. Selectively transplanting particular T cell subsets allows for careful identification of the roles each subset plays. Non-invasively tracking T cell responses in vivo adds another layer of value to murine GVHD models.

Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

Murine bone marrow transplantation is a widely used technique to study immunological mechanisms governing graft-versus-host disease in humans. The ability to monitor T cell trafficking patterns in vivo allows for detailed analysis of the development and perpetuation of T cell responses during graft-versus-host disease.

تحريض الطعم ضد المضيف المرض و<em&gt; في الجسم الحي</em&gt; مراقبة الخلايا T باستخدام نموذج MHC المطابقة الفئران

Graft-versus-host disease (GVHD) is the limiting barrier to the broad use of bone marrow transplant as a curative therapy for a variety of hematological ...

Real-time Live Imaging of T-cell Signaling Complex Formation

Protection against infectious diseases is mediated by the immune system 1,2. T lymphocytes are the master coordinators of the immune system, regulating the activation and responses of multiple immune cells 3,4. T-cell activation is dependent on the recognition of specific antigens displayed by antigen presenting cells (APCs). The T-cell antigen receptor (TCR) is specific to each T-cell clone and determines antigen specificity 5. The binding of the TCR to the antigen induces the phosphorylation of components of the TCR complex. In order to promote T-cell activation, this signal must be transduced from the membrane to the cytoplasm and the nucleus, initiating various crucial responses such as recruitment of signaling proteins to the TCR;APC site (the immune synapse), their molecular activation, cytoskeletal rearrangement, elevation of intracellular calcium concentration, and changes in gene expression 6,7. The correct initiation and termination of activating signals is crucial for appropriate T-cell responses. The activity of signaling proteins is dependent on the formation and termination of protein-protein interactions, post translational modifications such as protein phosphorylation, formation of protein complexes, protein ubiquitylation and the recruitment of proteins to various cellular sites 8. Understanding the inner workings of the T-cell activation process is crucial for both immunological research and clinical applications.
Various assays have been developed in order to investigate protein-protein interactions; however, biochemical assays, such as the widely used co-immunoprecipitation method, do not allow protein location to be discerned, thus precluding the observation of valuable insights into the dynamics of cellular mechanisms. Additionally, these bulk assays usually combine proteins from many different cells that might be at different stages of the investigated cellular process. This can have a detrimental effect on temporal resolution. The use of real-time imaging of live cells allows both the spatial tracking of proteins and the ability to temporally distinguish between signaling events, thus shedding light on the dynamics of the process 9,10. We present a method of real-time imaging of signaling-complex formation during T-cell activation. Primary T-cells or T-cell lines, such as Jurkat, are transfected with plasmids encoding for proteins of interest fused to monomeric fluorescent proteins, preventing non-physiological oligomerization 11. Live T cells are dropped over a coverslip pre-coated with T-cell activating antibody 8,9, which binds to the CD3/TCR complex, inducing T-cell activation while overcoming the need for specific activating antigens. Activated cells are constantly imaged with the use of confocal microscopy. Imaging data are analyzed to yield quantitative results, such as the colocalization coefficient of the signaling proteins.

We describe a live-cell imaging method that provides insight into protein dynamics during the T-cell activation process. We demonstrate the combined usage of the T-cell spreading assay, confocal microscopy and imaging analysis to yield quantitative results to follow signaling complex formation throughout T-cell activation.

في الوقت الحقيقي تصوير لايف تي خلية اشارة تشكيل مجمع

Protection against infectious diseases is mediated by the immune system 1,2. T lymphocytes are the master coordinators of the immune system, regulating ...

Culturing Microglia from the Neonatal and Adult Central Nervous System

Microglia are the resident macrophage-like cells of the central nervous system (CNS) and, as such, have critically important roles in physiological and pathological processes such as CNS maturation in development, multiple sclerosis, and spinal cord injury. Microglia can be activated and recruited to action by neuronal injury or stimulation, such as axonal damage seen in MS or ischemic brain trauma resulting from stroke. These immunocompetent members of the CNS are also thought to have roles in synaptic plasticity under non-pathological conditions. We employ protocols for culturing microglia from the neonatal and adult tissues that are aimed to maximize the viable cell numbers while minimizing confounding variables, such as the presence of other CNS cell types and cell culture debris. We utilize large and easily discernable CNS components (e.g. cortex, spinal cord segments), which makes the entire process feasible and reproducible. The use of adult cells is a suitable alternative to the use of neonatal brain microglia, as many pathologies studied mainly affect the postnatal spinal cord. These culture systems are also useful for directly testing the effect of compounds that may either inhibit or promote microglial activation. Since microglial activation can shape the outcomes of disease in the adult CNS, there is a need for in vitro systems in which neonatal and adult microglia can be cultured and studied.

We outline methods for the efficient and quick isolation/culture of viable microglia from the neonatal cerebral cortex and adult spinal cord. The dissection and plating of cortical microglia can be accomplished within 90 minutes, with the subsequent microglial harvest taking place ~ 10 days following the initial dissection.

الخلايا الدبقية الصغيرة زراعة من الجهاز العصبي المركزي حديثي الولادة والكبار

Microglia are the resident macrophage-like cells of the central nervous system (CNS) and, as such, have critically important roles in physiological and ...

The Use of Fluorescent Target Arrays for Assessment of T Cell Responses In vivo

The ability to monitor T cell responses in vivo is important for the development of our understanding of the immune response and the design of immunotherapies. Here we describe the use of fluorescent target array (FTA) technology, which utilizes vital dyes such as carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE), violet laser excitable dyes (CellTrace Violet: CTV) and red laser excitable dyes (Cell Proliferation Dye eFluor 670: CPD) to combinatorially label mouse lymphocytes into &#62;250 discernable fluorescent cell clusters. Cell clusters within these FTAs can be pulsed with major histocompatibility (MHC) class-I and MHC class-II binding peptides and thereby act as target cells for CD8+ and CD4+ T cells, respectively. These FTA cells remain viable and fully functional, and can therefore be administered into mice to allow assessment of CD8+ T cell-mediated killing of FTA target cells and CD4+ T cell-meditated help of FTA B cell target cells in real time in vivo by flow cytometry. Since &#62;250 target cells can be assessed at once, the technique allows the monitoring of T cell responses against several antigen epitopes at several concentrations and in multiple replicates. As such, the technique can measure T cell responses at both a quantitative (e.g.&#160;the cumulative magnitude of the response) and a qualitative (e.g.&#160;functional avidity and epitope-cross reactivity of the response) level. Herein, we describe how these FTAs are constructed and give an example of how they can be applied to assess T cell responses induced by a recombinant pox virus vaccine.

The Use of Fluorescent Target Arrays for Assessment of T Cell Responses In vivo

The ability to monitor T cell responses in detail in vivo is important for the development of our understanding of the immune response. Here we describe the use of fluorescent target arrays (FTAs) in an in vivo T cell assay that assesses &#62;250 parameters simultaneously by flow cytometry.

استخدام المصابيح الفلورية الهدف صالحة لتقييم T الردود الخليوي<em&gt; في الجسم الحي</em

The ability to monitor T cell responses in vivo is important for the development of our understanding of the immune response and the design of ...

An Ex vivo Model of an Oligodendrocyte-directed T-Cell Attack in Acute Brain Slices

Death of oligodendrocytes accompanied by destruction of neurons and axons are typical histopathological findings in cortical and subcortical grey matter lesions in inflammatory demyelinating disorders like multiple sclerosis (MS). In these disorders, mainly CD8+ T-cells of putative specificity for myelin- and oligodendrocyte-related antigens are found, so that neuronal apoptosis in grey matter lesions may be a collateral effect of these cells. Different types of animal models are established to study the underlying mechanisms of the mentioned pathophysiological processes. However, although they mimic some aspects of MS, it is impossible to dissect the exact mechanism and time course of &#8216;&#8216;collateral&#8217;&#8217; neuronal cell death. To address this course, here we show a protocol to study the mechanisms and time response of neuronal damage following an oligodendrocyte-directed CD8+ T cell attack. To target only the myelin sheath and the oligodendrocytes, in vitro activated oligodendrocyte-specific CD8+ T-cells are transferred into acutely isolated brain slices. After a defined incubation period, myelin and neuronal damage can be analysed in different regions of interest. Potential applications and limitations of this model will be discussed.

An Ex vivo Model of an Oligodendrocyte-directed T-Cell Attack in Acute Brain Slices

To address mechanisms of demyelination and neuronal apoptosis in cortical lesions of inflammatory demyelinating disorders, different animal models are used. We here describe an ex vivo approach by using oligodendrocyte-specific CD8+ T-cells on brain slices, resulting in oligodendroglial and neuronal death. Potential applications and limitations of the model are discussed.

ل<em&gt; السابقين فيفو</em&gt; نموذج لهجوم T-خلية الموجه دبقية قليلة التغصن في الدماغ الحادة شرائح

Death of oligodendrocytes accompanied by destruction of neurons and axons are typical histopathological findings in cortical and subcortical grey matter ...

Mouse Na&#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Antigen inexperienced (na&#239;ve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition of cognate antigen presented on MHC class II. The cytokine signals present in the environment at the time of TCR activation are a major factor in determining the effector fate of a na&#239;ve CD4+ T cell. Although the cytokine environment during na&#239;ve T cell activation may be complex and involve both redundant and opposing signals in vivo, the addition of various cytokine combinations during naive CD4+ T cell activation in vitro can readily promote the establishment of effector T helper lineages with hallmark cytokine and transcription factor expression. Such differentiation experiments are commonly used as a first step for the evaluation of targets believed to promote or inhibit the development of certain CD4+ T helper subsets. The addition of mediators, such as signaling agonists, antagonists, or other cytokines, during the differentiation process can also be used to study the influence of a particular target on T cell differentiation. Here, we describe a basic protocol for the isolation of na&#239;ve T cells from mouse and the subsequent steps necessary for polarizing na&#239;ve cells to various T helper effector lineages in vitro.

Mouse Na&#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Na&#239;ve CD4+ T cells polarize to various subsets depending on the environment at the time of activation. The differentiation of na&#239;ve CD4+ T cells to various effector subsets can be achieved in vitro through the addition of T cell receptor stimuli and specific cytokine signals.

الماوس السذاجة CD4<sup&gt; +</sup&gt; عزل T خلية و<em&gt; في المختبر</em&gt; التمايز إلى T مجموعات فرعية خلية

Antigen inexperienced (na&#239;ve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition ...

Imaging CD4 T Cell Interstitial Migration in the Inflamed Dermis

The ability of CD4 T cells to carry out effector functions is dependent upon the rapid and efficient migration of these cells in inflamed peripheral tissues through an as-yet undefined mechanism. The application of multiphoton microscopy to the study of the immune system provides a tool to measure the dynamics of immune responses within intact tissues. Here we present a protocol for non-invasive intravital multiphoton imaging of CD4 T cells in the inflamed mouse ear dermis. Use of a custom imaging platform and a venous catheter allows for the visualization of CD4 T cell dynamics in the dermal interstitium, with the ability to interrogate these cells in real-time via the addition of blocking antibodies to key molecular components involved in motility. This system provides advantages over both in vitro models and surgically invasive imaging procedures. Understanding the pathways used by CD4 T cells for motility may ultimately provide insight into the basic function of CD4 T cells as well as the pathogenesis of both autoimmune diseases and pathology from chronic infections.

The mechanisms that govern the interstitial motility of CD4 effector T cells at sites of inflammation are relatively unknown. We present a non-invasive approach to visualize and manipulate in vitro-primed CD4 T cells in the inflamed ear dermis, allowing for study of the dynamic behavior of these cells in situ.

التصوير CD4 T خلية الخلالية الهجرة في الأدمة الملتهبة

The ability of CD4 T cells to carry out effector functions is dependent upon the rapid and efficient migration of these cells in inflamed peripheral ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of inflammation. They are key players in the innate immune system and play major roles in cancer biology. Neutrophils have been proposed as key mediators of malignant transformation, tumor progression, angiogenesis and in the modulation of the antitumor immunity; through their release of soluble factors or their interaction with tumor cells. To characterize the specific functions of neutrophils, a fast and reliable method is coveted for in vitro isolation of neutrophils from human blood. Here, a density gradient separation method is demonstrated to isolate neutrophils as well as mononuclear cells from the blood. The procedure consists of layering the density gradient solution such as Ficoll carefully above the diluted blood obtained from patients diagnosed with chronic lymphocytic leukemia (CLL), followed by centrifugation, isolation of mononuclear layer, separation of neutrophils from RBCsby dextran then lysis of residual erythrocytes. This method has been shown to isolate neutrophils &#8805; 90 % pure. To mimic the tumor microenvironment, 3-dimensional (3D) experiments were performed using basement membrane matrix such as Matrigel. Given the short half-life of neutrophils in vitro, 3D experiments with fresh human neutrophils cannot be performed. For this reason promyelocytic HL60 cells are differentiated along the granulocytic pathway using the differentiation inducers dimethyl sulfoxide (DMSO) and retinoic acid (RA). The aim of our experiments is to study the role of neutrophils on the sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents. However these methods can be generalized to study the interactions of neutrophils or neutrophil-like cells with a large range of cell types in different situations.

Neutrophils are the most abundant type of white blood cells. The isolation of neutrophils from human blood by density gradient separation method and the differentiation of human promyelocytic (HL60) cells along the granulocytic pathway are described here; to test their role on sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents.