Este trabajo fue apoyado por la Universidad de Chicago Consejo de la Mujer, el Fondo caso será Wendy, y la Universidad de Chicago Comprehensive Cancer Center Proyectos financiados (P30 CA014599). Nos gustaría dar las gracias a la Citometría de Flujo Core de la Universidad de Chicago, por su ayuda en la creación de este experimento, y así como otros miembros del laboratorio de Jong, en especial Leslie Pedraza y Sean McConnell.

Todos los procedimientos con el pez cebra han sido aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad de Chicago. La Universidad de Chicago está acreditada por la Asociación para la Evaluación y Acreditación de Cuidado de Animales de Laboratorio (AAALAC). 1. Generación y aislamiento de la etiqueta fluorescente T-todas las células en el pez cebra <ol><li> Microinyección en embriones de pez cebra singénicos <ol><li> El uso de kits disponibles en el mercado, aislar rag2 circular: c-myc y rag2: proteína verde fluorescente (rag2: GFP) de ADN plásmido que contiene repeticiones terminales invertidas reconocido por transposasa Tol2 (véase la Tabla de Materiales para la fuente de ADN de plásmido) 12 y eluir el ADN en agua estéril. NOTA: GFP se utiliza en este estudio, pero cualquier proteína fluorescente va a funcionar. </li><li> Preparar pCS2-transposasa (Tol2) RNA <ol><li> Aislar el plásmido de ADN Tol2 usando kits disponibles comercialmente (ver tél Tabla de Materiales para la fuente de ADN plásmido) 12 y se eluye el ADN en agua estéril. </li><li> Incubar 1 g de ADN Tol2 a 37 ° C durante 1 h con 5 unidades de la enzima de restricción NotI en el tampón apropiado para linealizar el plásmido. Heat-inactivar la NotI a 65 ° C durante 20 min. </li><li> Transcribir el RNA Tol2 con ARN polimerasa SP6 a partir del ADN linealizado utilizando un kit de transcripción de ARN disponible comercialmente 13. Almacenar el ARN en alícuotas de un solo uso a -80 ° C. </li></ol></li><li> Preparar la mezcla de inyección en hielo mediante la adición de 250 ng de rag2: c-myc ADN plásmido, 250 ng de rag2: ADN del plásmido GFP, 150 ng de RNA Tol2, y 0,5 l de rojo de fenol. Ajustar el volumen a 10 l con agua libre de nucleasa. </li><li> Inyectar ~ 1 nL de la mezcla de la inyección en la célula de una fase de una célula embrión de pez cebra singénico usando un microinyector y la aguja tirado de un tubo capilar de vidrio, siguiendo previamente estab8 , 14 . NOTA: El pez cebra singénico generado por partenogénesis 15 se utiliza aquí para eliminar la heterogeneidad genética y el rechazo inmune después del trasplante. Sin embargo, también se puede usar el pez cebra de tipo salvaje o cualquier cepa deseada. </li><li> Elimine los embriones muertos, subdesarrollados o malformados a las 24 h y 48 h después de la inyección 16 . </li><li> Colocar los peces inyectados en el sistema de pescado a los 6 días después de la inyección y elevarlos de acuerdo con el protocolo estándar 6 . </li></ol></li><li> Cribado de pez cebra inyectado y monitoreo del crecimiento tumoral <ol><li> A los 21 días después de la inyección, colocar una sola larva inyectada en una gota de medio embrionario en una placa de Petri y cribar la fluorescencia GFP usando un microscopio epifluorescente (banda de excitación: 470/40, banda de paso de la emisión: 525/50) 8 . NOTA: Las larvas de pez cebra que have integrado tanto rag2: c-myc y rag2: GFP tendrá un timo verde fluorescente (pescado positivo) y ya puede exhibir la expansión de células fluorescentes verdes malignas más allá del timo. Todos los peces con un GFP + timo se van a desarrollar una GFP + T-ALL. Las larvas que no demuestran la integración de los plásmidos no tendrá ningún células fluorescentes verdes (peces negativo). </li><li> Separar el pescado negativo (basado en una falta de fluorescencia) en un tanque diferente y supervisar los peces de nuevo a los 28 y 35 días después de la inyección. A los 28 y 35 días después de la inyección, anestesiar el pescado con 0,02% tricaína tamponada (MS-222) en agua sistema de pescado antes de la selección. </li><li> Colocar cada larva de pez cebra que es positivo para un timo marcado fluorescentemente o un tumor marcado con fluorescencia en un tanque individual para supervisar el crecimiento del tumor tres veces a la semana. </li></ol></li><li> Colección de marcado fluorescentemente T-ALL células de los peces tumor primario <ol><li> Preparar al menos 20 ml de suero bovino fetal inactivado por calor al 10% en solución salina tamponada con fosfato 0,9 veces (FBS / PBS). </li><li> Añadir 1 ml de FBS / PBS a un vial de sal de sodio de heparina (300 unidades). </li><li> Seleccione los tumores que llevan peces en más del 50% del cuerpo, o aquellos peces que tienen dificultad para comer o nadar. Sacrificar el pescado sobredosándolos con tricaína o por inmersión en agua helada. Confirme la muerte por falta de movimiento de las branquias y los latidos del corazón. </li><li> Use una cuchilla de afeitar para quitar la cabeza del pez. </li><li> Lave la cavidad del pez con la solución de heparina para eliminar el exceso de glóbulos rojos. <ol><li> Usando una pipeta, inyecte 100 μL de solución de heparina (preparada en el paso 1.3.2) en la cavidad corporal del pez. Retire todo el líquido que se derrame (contendrá células sanguíneas) y pipetee en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. </li><li> Use una punta de pipeta fresca para lavar el cuerpo nuevamente. Realizar al menos tres lavados, o hasta que el líquido que se derrame aparezca libre de blOod </li><li> Deseche todo el líquido de los lavados en los pasos 1.3.5.1 y 1.3.5.2, ya que no se utilizará en análisis adicionales. </li></ol></li><li> Recoger las células de leucemia. <ol><li> Inyectar 100 μl de FBS / PBS en la cavidad corporal del pez. </li><li> Aplique presión suave al exterior del cuerpo del pez con la punta de la pipeta para exprimir / empujar hacia fuera las células tumorales. NOTA: Si este paso se realiza usando un microscopio de disección, las células tumorales que salen de la cavidad corporal serán evidentes. </li><li> Recoja el líquido y las células de cada lavado en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. </li><li> Repita los pasos 1.3.6.1-1.3.6.3 hasta que la mayoría de las células tumorales se recogen (normalmente 5-10 veces). Recoger todas las células tumorales en el mismo tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Mantenga las células a temperatura ambiente. </li></ol></li><li> Mezclar las células tumorales recogidas de la etapa 1.3.6 pipeteándolas suavemente para disociar los grupos de células. Filtrar la suspensión celular a través de un 4Filtro de malla de 0 μm. Lavar el filtro 1-2 veces con 100 μl de FBS / PBS. Mantenga las células a temperatura ambiente. </li><li> Mezclar 2 μl de suspensión celular con 18 μl de azul de tripano (0,4%, diluido 1:10 y filtrado) en un tubo nuevo. Cargar 10 μL en un hemocitómetro y contar el número de células fluorescentes vivas (no azules) para calcular el número de células tumorales aisladas. NOTA: Las células GFP-negativas no azules son probablemente células T normales, no malignas y no deben contarse. Se requieren al menos 2 x 106 células para teñir las células con Hoechst 33342. </li></ol></li></ol> 2. Tinción de las células T-ALL marcadas fluorescentemente con Hoechst 33342 para identificar la población lateral <ol><li> Diluir Hoechst 33342 1:10 con H 2 O libre de nucleasa para obtener la concentración de trabajo de 1 mg / ml. Almacenar el colorante a 4 ° C y en la oscuridad. </li><li> Preparar una solución 100 mM de verapamilo disolviendo 49,1 mg en 1 mL de dimetilsulfóxido (DMSO). NOTA: El verapamilo es un inhibidor de los transportadores ABC y es un control importante para los experimentos de población lado. Adición de verapamil a muestras inhibirá la capacidad de los transportadores ABC de flujo de salida el colorante Hoechst 33342. Por lo tanto, un verdadero población lado desaparecerá cuando se añade verapamil a la muestra. </li><li> Establecer un baño de agua a 28 ° C. </li><li> Preparar muestras y los controles en la oscuridad mediante la adición de las células y las soluciones a tubos de clasificador de células activadas por fluorescencia (FACS). <ol><li> Preparar las muestras por adición de 10 6 células, 15 l de 1 mg / mL Hoechst 33342, y 2,5 l de DMSO a un tubo de FACS. Ajustar el volumen a 1 ml con FBS / PBS. </li><li> Preparar los controles mediante la adición de 10 6 células, 15 l de 1 mg / mL Hoechst 33342, y 2,5 l de 100 mM verapamil a un tubo de FACS. Ajustar el volumen a 1 ml con FBS / PBS. NOTA: Un mínimo de 10 6 células / se recomienda la muestra, pero la tinción más células se prefiere, especialmente si el lado populatLas células de ion se clasificarán para su posterior análisis. No exceda de 10 6 células / mL, y mantenga la concentración de Hoechst 33342 a 15 μg / mL. Si se tiñen 10 x 106 células, el volumen de reacción total es de 10 ml. </li></ol></li><li> Incubar en un baño de agua a 28 ° C en la oscuridad durante 120 min. </li><li> Después de la incubación, coloque las células inmediatamente sobre hielo y manténgalas en la oscuridad. </li><li> Pellet las células a 4 ° C durante 6 min a 300 x g. Retirar el sobrenadante. Lavar con 1 ml de FBS / PBS. </li><li> Pellet las células a 4 ° C durante 6 min a 300 x g. Retirar el sobrenadante. Resuspender las células en 1 ml de FBS / PBS. </li><li> Mantener a 4 ° C hasta la clasificación celular. </li><li> 15 min antes de la clasificación celular, añadir 2 μl de stock de yoduro de propidio (1 mg / ml) a cada 1 mL de FBS / PBS (concentración final: 2 μg / mL). Mezclar bien. </li></ol> 3. Utilice FACS para encontrar la población lateral dentro de la población de células T-ALL con marcadores fluorescentes <ol><li&gt; Analizar las suspensiones de células T-ALL de pez cebra teñidas en un clasificador de células equipado con un láser UV para la excitación de colorante Hoechst 33342 y un láser de 488 nm para la excitación PI y para la detección de las células GFP + T-ALL. </li><li> Determinar una puerta para las células vivas, GFP + T-ALL. <ol><li> Utilice el área de dispersión hacia adelante (FSC) y el área de dispersión lateral (SSC) para eliminar los desechos. NOTA: El FSC se utiliza para distinguir el tamaño de la celda y SSC se utiliza para distinguir la granularidad de la celda. </li><li> Utilice el ancho FSC y SSC para discriminar los dobletes. NOTA: Hay tres componentes identificados por los detectores de citómetro de flujo: área, altura y ancho. El área se usa típicamente para medir la fluorescencia de la célula. Ancho mide el tiempo de vuelo y es dos veces más ancho si dos células se agrupan juntas. </li><li> Para las células tumorales vivas, dibuje una puerta alrededor de las células positivas para GFP y negativas para PI usando los detectores apropiados ( por ejemplo , FITC para GFP y PerCP Cy5-5 para PI). </li></ol></li><li&gt; En la puerta de células vivas, medir la fluorescencia de Hoechst 33342 a través de los filtros de paso de banda Hoechst azules y rojas Hoechst (450/50 y 670/30, respectivamente). NOTA: La población lado, si está presente, será evidente después de esto está configurado. Es importante destacar que la población lado debe desaparecer en el control de verapamilo con el fin de que sea considerada una verdadera parte de población. </li><li> Si la clasificación de las células de población lateral para experimentos adicionales, utilice la punta de la boquilla grande (100 m) y recoger las células en un tubo de FACS que contiene 3 ml de 100% de FBS. Utilice una punta de boquilla más grande (100 m) en lugar de la punta más pequeño (70 m) para mejorar la viabilidad celular después de la clasificación. </li></ol>

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Los autores no tienen nada que revelar.

El ensayo de población lateral es altamente sensible; Por lo tanto, pequeños cambios en el protocolo pueden resultar en una dificultad en la detección de células de población lateral. En primer lugar, la temperatura durante la etapa de tinción es específica para cada sistema de animal / célula. Para sistemas de mamíferos, el ensayo de población lateral se realiza típicamente a 37ºC. Cuando las células T-ALL de pez cebra se incubaron a 37ºC, muchas de las células murieron, lo que hizo que esta temperatura de incubación fuera inaceptable (datos no mostrados). Cuando Kobayashi y sus colegas (2008) diseccionaron la médula renal de pez cebra para el ensayo de población lateral, las incubaciones se llevaron a cabo a 25 ° C 5 . Esta temperatura de incubación no era suficiente para las células T-ALL de pez cebra, ya que dio como resultado un perfil de Hoechst 33342 débil (datos no mostrados). En el protocolo descrito aquı, una temperatura de incubación de 28 ◦ C era óptima para mantener la viabilidad celular y para conseguir un fuerte perfil Hoechst 33342. Una segunda condición para el ensayo de población lateral que requiere la consideración y pruebas antes es la concentración de Hoechst 33342. Si la concentración de Hoechst 33342 es demasiado bajo, la población lado puede no ser visible, o el fenotipo población lado (colorante capacidad de flujo de salida) puede aumentar falsamente, la identificación de células de población más secundarios que son realmente presentes 2. Por otro lado, demasiado alto de una concentración de Hoechst 33342 puede ser tóxico para las células. Para pez cebra T-todas las células, 15 g / mL Hoechst 33342 se incubaron durante 120 min es la combinación óptima. Concentraciones más bajas de Hoechst 33342 fueron juzgados por pez cebra T-todas las células, pero la población lado no siempre fue evidente (datos no mostrados). Un tiempo de incubación total de 90 min fue suficiente para detectar una población lado, pero se observó el número máximo de células de población secundarios después de 120 min de tiempo de incubación. Como se informó anteriormente para s mamíferos<html> ISTEMAS, no cada tumor tendrá una población detectable lado 17, 18, 19. Usando este método, se observó una población lado en 14 de 17 prueba T-alls (datos no mostrados). Tener aislaron células de población lateral de T-alls, se espera que este método es aplicable a otros modelos de tumores de pez cebra. Dentro del pez cebra heterogénea T-ALL tumor, células de leucemia iniciar (PRB) son capaces de reiniciar el crecimiento del tumor y como tal se cree responsable de la recurrencia del cáncer y la metástasis. Actualmente, no existe un método en el pez cebra que permite el aislamiento prospectivo de los PRB in vivo. Cálculo de la frecuencia LIC requiere un trasplante de células del tumor a una dilución limitante 8, 10. estudios publicados anteriormente con el pez cebra clonal han identificado que los PBI conforman 0,1-1,4% de las células T-ALL primarias&quot;xref&quot;&gt; 10. Aquí, la variabilidad similar en la frecuencia de células de población laterales (0,2-1,0%) a partir de pez cebra clonal T-alls se informa (Figura 2). Se necesitan más experimentos para determinar si la población lado se enriquece en países de bajos ingresos; sin embargo, la similitud entre los rangos de frecuencia LIC y el porcentaje de células de población lateral en estos T-alls apoya esta hipótesis. Mientras que el ensayo de la población lado es sensible y no siempre fácil de realizar, el ensayo permite a los investigadores, por primera vez, para aislar una población rara de células en el pez cebra T-ALL que puede tener propiedades madre o células progenitoras. Actualmente no hay marcadores de superficie celular disponibles en el pez cebra para identificar células stem- o progenitoras-similares; Por lo tanto, la capacidad de aislar la población lado es muy prometedor. Las futuras aplicaciones de este método incluyen límite experimentos de trasplante de dilución de la población lado Ordenada T-ALL células para evaluar el enriquecimiento de LICS. Además, este método permitirá que las características que definen los PRB no se ha dilucidado, incluyendo los mecanismos moleculares que gobiernan los PRB en el pez cebra T-ALL. Estos experimentos podrían proporcionar puntos de partida para el descubrimiento de nuevas dianas terapéuticas para T-ALL.

El ensayo población lado capitaliza en la capacidad mejorada de ciertas células dentro de un tejido a flujo de salida el colorante de unión a ADN Hoechst 33342 debido a los altos niveles de la casete de unión a ATP (ABC) transportador de proteínas en la membrana celular. Las células que eflujo el colorante Hoechst 33342 se pueden identificar utilizando análisis de citometría de flujo dual de longitud de onda después de que el colorante es excitado por un láser UV. Este ensayo se utilizó primero para identificar células murinas madre hematopoyéticas (HSCs) 1, pero desde entonces se ha usado para identificar poblaciones de células madre / progenitoras en muchos tejidos y tipos de cáncer (revisado en la referencia 2). Sin embargo, no todas las poblaciones de células tienen una población lado, y no todas las poblaciones laterales están enriquecidas en células madre / progenitoras. El pez cebra es un poderoso sistema modelo para el estudio genético de los vertebrados cáncer humano 3, 4, con una serie de ventajas sobre mo tradicional murinadels de cáncer. Embriones de pez cebra son fertilizados externamente y son ópticamente transparentes, lo que facilita la transgénesis y la observación in vivo de procesos patológicos, incluyendo la iniciación y progresión del cáncer. Hasta la fecha, el ensayo población lado para detectar potenciales células madre o progenitoras sólo se ha aplicado a la médula renal en el pez cebra para identificar HSCs, y no a cualquier modelos de cáncer de pez cebra 5, 6. El modelo de pez cebra de las células T de la leucemia linfoblástica aguda (LLA-T) es morfológica y genéticamente similares a humano T-ALL 7, 8, 11. T-ALL es una neoplasia agresiva que, en los seres humanos, representa el 10-15% de los pediátricos y el 25% de los casos de LLA de adultos 9. Mientras que el tratamiento de la LLA-T ha mejorado, la recaída es todavía común y se asocia con un mal pronóstico. T-ALL tumores son hétérogèneY contienen muchas subpoblaciones de células tumorales diferentes, incluyendo células iniciadoras de leucemia (LICs). Los LIC se definen por su capacidad para regenerar el tumor entero a partir de una sola célula y la frecuencia de LIC dentro de una población de células tumorales se puede calcular trasplantando dosis de células variables en receptores a través de un ensayo de trasplante de dilución limitante (LDA). Mientras que los experimentos de LDA se han realizado en el pez cebra para calcular la frecuencia de los LIC 8 , 10 , 11 , esta determinación se hace en retrospectiva y no permite el aislamiento prospectivo de LICs. Por lo tanto, falta un método para aislar prospectivamente una población enriquecida para la actividad de células madre de cáncer. Identificar y aislar las células de la población lateral de pez cebra T-ALLs es el primer paso para abordar esta deficiencia. El protocolo presentado aquí describe cómo generar eficientemente tumores T-ALL en zebrafish la utilización de transgénesis Tol2 mediada, cosechar las Todas Las células tumorales, y manchar con Hoechst 33342 para identificar la población lado de las células. Future en experimentos in vivo con el pez cebra T-ALL podría incluir si las células de población lateral están enriquecidos para los PRB o tienen otras propiedades stem- o progenitoras-similares.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="859">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:245px;">Syngeneic zebrafish (CG2)</td>
			<td style="width:199px;"></td>
			<td style="width:208px;"></td>
			<td style="width:208px;">See Mizgireuv et al., 2006</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:245px;">rag2:c-myc plasmid</td>
			<td style="width:199px;"></td>
			<td style="width:208px;"></td>
			<td>Langenau Laboratory</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:245px;">rag2:GFP plasmid constructed in de Jong Lab</td>
			<td style="width:199px;"></td>
			<td style="width:208px;"></td>
			<td style="width:208px;">rag2 promoter from Langenau Laboratory</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:245px;">pCS2-transposase plasmid</td>
			<td style="width:199px;"></td>
			<td style="width:208px;"></td>
			<td>Chien Laboratory</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:245px;">NotI -HF restriction enzyme</td>
			<td style="width:199px;">New England Bio-Labs Inc.</td>
			<td>R3189S</td>
			<td>500 units in 25 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:245px;">mMessage Machine SP6 Transcription Kit</td>
			<td style="width:199px;">Ambion</td>
			<td style="width:208px;">Thermo Fisher Scientific - AM1340</td>
			<td>25 reactions</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:245px;">QIAGEN Plasmid Midi Kit</td>
			<td style="width:199px;">Qiagen, Inc.</td>
			<td style="width:208px;">12643</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:245px;">SteREO Discovery V8 Microscope</td>
			<td style="width:199px;">Carl Zeiss Microscopy</td>
			<td>495015-0008-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:245px;">Digital microinjector</td>
			<td style="width:199px;">Tritech Research</td>
			<td>MINJ-D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:245px;">Brass straight-arm needle holder</td>
			<td style="width:199px;">Tritech Research</td>
			<td>MINJ-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:245px;">Magnetic base and stand</td>
			<td style="width:199px;">Tritech Research</td>
			<td>MINJ-HBMB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:245px;">Micromanipulator</td>
			<td style="width:199px;">Narishige International</td>
			<td style="width:208px;">MN153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:245px;">Glass capillaries</td>
			<td style="width:199px;">Sutter Instrument Co.</td>
			<td style="width:208px;">B100-50-10</td>
			<td>10 cm without filament</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:245px;">Flaming/Brown micropipette puller</td>
			<td style="width:199px;">Sutter Instrument Co.</td>
			<td style="width:208px;">P-97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:245px;">Microloader pipette tips</td>
			<td style="width:199px;">Eppendorf North America Inc.</td>
			<td>930001007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:245px;">Phenol Red solution</td>
			<td style="width:199px;">Sigma Life Science</td>
			<td style="width:208px;">P0290</td>
			<td>0.5% concentration 100 mL</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:245px;">Plastic Transfer pipettes</td>
			<td style="width:199px;">Fisherbrand</td>
			<td>137119D</td>
			<td>graduated 7.5 mL bulb</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Tricaine methanesulfonate (MS-222)</td>
			<td style="width:199px;">Western Chemical, Inc.</td>
			<td style="width:208px;">Fisher Scientific - NC0342409</td>
			<td>100 g</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:245px;">Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td style="width:199px;">HyClone Laboratories, Inc.</td>
			<td style="width:208px;">Fisher Scientific - SH3007103</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:245px;">Phosphate-Buffered Saline (PBS)</td>
			<td style="width:199px;">Gibco by Life Technologies</td>
			<td style="width:208px;">1001-023</td>
			<td>pH 7.4 (1x) - 500 mL</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:245px;">Heparin sodium salt</td>
			<td style="width:199px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:208px;">2106</td>
			<td>15 - 300 unit vials</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:245px;">40 um mesh filter</td>
			<td style="width:199px;">Falcon Corning Brand</td>
			<td style="width:208px;">352340</td>
			<td>Case of 50</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:245px;">Trypan blue</td>
			<td style="width:199px;">Sigma Life Science</td>
			<td style="width:208px;">T8154</td>
			<td>20 mL - Solution (0.4%)</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:245px;">Hoechst 33342</td>
			<td style="width:199px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:208px;">H3570</td>
			<td>10 mL</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:245px;">Verapamil</td>
			<td style="width:199px;">Sigma Life Science</td>
			<td style="width:208px;">V4629</td>
			<td>1 g</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:245px;">Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td style="width:199px;">Sigma Life Science</td>
			<td style="width:208px;">D8418</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:245px;">Propidium Iodide</td>
			<td style="width:199px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:208px;">P3566</td>
			<td>10 mL</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">FACSAria Fusion cell sorter</td>
			<td style="width:199px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:208px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:245px;">BD FACSDiva 8.0.1</td>
			<td style="width:199px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:208px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:245px;">FlowJo v10.2</td>
			<td style="width:199px;">FlowJo, LLC</td>
			<td style="width:208px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of the side population in myc-induced t-cell acute lymphoblastic leukemia in zebrafish

Las poblaciones de células heterogéneas, ya sea de tejidos sanos o malignos, pueden contener una población de células caracterizada por una capacidad diferencial para expulsar el colorante de enlace de ADN Hoechst 33342. Esta &quot;población lateral&quot; de células puede identificarse usando métodos de citometría de flujo después de Hoechst 33342 El colorante es excitado por un láser ultravioleta (UV). La población lateral de muchos tipos de células contiene células progenitoras o similares. Sin embargo, no todos los tipos de células tienen una población lateral identificable. Danio rerio , pez cebra, tienen un robusto modelo in vivo de células T de leucemia linfoblástica aguda (T-ALL), pero si estas T-ALL de pez cebra tienen una población lateral es desconocida. El método descrito aquí describe cómo aislar las células de la población lateral en el pez cebra T-ALL. Para empezar, el T-ALL en el pez cebra se genera a través de la microinyección de los plásmidos tol2 en embriones de una sola fase celular. Una vez que los tumores han crecido a una etapa en la que se expanden en más de la mitad de los aniEl cuerpo de mal, las células T-ALL se puede cosechar. Las células se tiñeron con Hoechst 33342 y se examinaron por citometría de flujo para células de población lateral. Este método tiene amplias aplicaciones en el pez cebra T-ALL investigación. Si bien no se conocen marcadores de superficie celular en el pez cebra que confirman si estas células de población lateral son células madre de cáncer como, ensayos in vivo de trasplante funcionales son posibles. Además, transcriptómica sola célula podrían aplicarse para identificar las características genéticas de estas células de población lateral.

Para generar eficientemente fluorescentes myc inducida por T-todos los tumores en el pez cebra, los constructos de ADN circular flanqueadas por sitios transposasa Tol2 pueden co-inyectados con ARN Tol2. Estudios anteriores de la inyección de ADN linealizado en embriones de pez cebra reportan una tasa de transgénesis 5% 8. Con el protocolo ajustarse para incluir transgénesis Tol2 mediada, las tasas de transgénesis que van desde 10-44% pueden observarse (Tabla 1). En el ejemplo representativo, un pez con una GFP + T-ALL se tiñó con Hoechst 33342 para determinar el porcentaje de células en la población lado. La Figura 1 muestra el esquema de gating utilizado para determinar el porcentaje de células de población lateral. En primer lugar, el uso de FSC y SSC, los-ALL T células se aíslan mediante la exclusión de los desechos (Figura 1A) y, posteriormente, seleccionando contra dobletes (Figura 1B). A continuación, todas las células vivas son aisladas por gating células que son GFP + y negativas para el discriminador de células muertas PI ( Figura 1C ]. Una vez que se seleccionan las células T-ALL individuales vivas, la población lateral se puede encontrar en el perfil Hoechst 33342. En la población celular principal, Hoechst 33342 permanece en las células, y estas células se pueden separar en grupos por el contenido de ADN. Sin embargo, la población lateral de células se distingue de la población celular principal, ya que las células de población lateral efluyen el colorante debido a un mayor número de transportadores ABC en la membrana celular. Para visualizar la población lateral, el perfil de Hoechst se utiliza para comparar dos canales, Hoechst Blue y Hoechst Red. La población lateral es la cola débil de las células que se extienden desde el lado izquierdo de la población de células principales hacia el eje de Hoechst Blue ( Figura 1D ). Una verdadera población lateral se perderá cuando las células se traten con un inhibidor oF Transportadores ABC, como verapamil. La Figura 2 muestra las poblaciones laterales en varios tumores T-ALL representativos, así como cuando esos tumores se tratan con verapamilo durante la tinción con Hoechst 33342. Para asegurar que la población encontrada en la muestra es una verdadera población lateral, esas células deben desaparecer En presencia del inhibidor, como se muestra en la Figura 2 . <table height="525" width="487"><tbody><tr><td> Número de inventario </td><td> Cantidad de peces examinados </td><td> Número positivo </td><td> Tasa de transgénesis </td></tr><tr><td> 930 </td><td> 21 </td><td> 3 </td><td> 14,3% </td></tr><tr><td> 934 </td><td> 12 </td><td> 4 </td><td> 33,3% </td></tr><tr><td> 950 </td><td> 12 </td><td> 5 </td><td> 41,7% </td></tr><tr><td> 951 </td><td> 19 </td><td> 3 </td><td> 15,8% </td></tr><tr><td> 960 </td><td> 3 &lt;/ Td&gt; <td> 1 </td><td> 33,3% </td></tr><tr><td> 983 </td><td> 9 </td><td> 4 </td><td> 44,4% </td></tr><tr><td> 1004 </td><td> 30 </td><td> 3 </td><td> 10,0% </td></tr><tr><td> 1013 </td><td> 4 </td><td> 1 </td><td> 25,0% </td></tr><tr><td> 1025 </td><td> 35 </td><td> 5 </td><td> 14,3% </td></tr><tr><td> 1029 </td><td> 10 </td><td> 2 </td><td> 20,0% </td></tr><tr><td> 1065 </td><td> 5 </td><td> 1 </td><td> 20,0% </td></tr><tr><td> 1070 </td><td> 6 </td><td> 1 </td><td> 16,7% </td></tr><tr><td> 1073 </td><td> 19 </td><td> 8 </td><td> 42,1% </td></tr><tr><td> 1079 </td><td> 8 </td><td> 1 </td><td> 12,5% </td></tr><tr><td> 1105 </td><td> 38 </td><td> 7 </td><td> 18,4% </td></tr><tr><td> 1193 </td><td> 30 </td><td> 8 </td><td> 26,7% </td></tr><tr><td> 1215 </td><td> 9 </td><td> 1 </td><td> 11,1% </td></tr><tr><td>1229 </td><td> 10 </td><td> 2 </td><td> 20,0% </td></tr><tr><td> 1314 </td><td> 6 </td><td> 1 </td><td> 16,7% </td></tr></tbody></table> Tabla 1: Tasa de transgénesis al usar tol2 transposasa para microinyección de plásmidos en embriones de pez cebra. Las tasas calculadas de transgénesis se muestran para diecinueve días de inyección separados. El número de peces cribados representa el número de peces que permanecieron vivos 21 días después de la inyección, y el Número Positivo representa el número de peces que fueron positivos para los tumores fluorescentes. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/55711/55711fig1.jpg" /> Figura 1: Esquema de desplazamiento de población lateral. Un ejemplo del esquema de gating utilizado para identificar la población lateral en una GFP + T-ALL en pez cebra. ( A ) En primer lugar, se excluyen los desechos utilizando dispersión hacia adelante (FSC) ydispersión lateral (SSC) zona. (B) A continuación, las células individuales están aislados al discriminar dobletes utilizando FSC y parámetros de anchura SSC. (C) Desde este ejemplo tumor era GFP +, todas las células vivas deben estar GFP + y negativas para el marcador de células muerto yoduro de propidio. (D) La población lado se puede ver con la Red Hoechst frente al perfil de Hoechst azul. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55711/55711fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/55711/55711fig2.jpg" /> Figura 2: Lado Población desaparece cuando son tratados con el inhibidor Transportador ABC, verapamilo. se muestran puertas para la población lado. Los paneles superiores muestran cuatro muestras de tumor diferentes. Es importante tener en cuenta que no todos los tumores tienen el mismo porcentaje de población lado, y la ca parte de poblaciónn un aspecto diferente para cada tumor probado. Los paneles inferiores muestran muestras de tumor que fueron tratados con verapamil durante la tinción con Hoechst 33342 para bloquear flujo de salida de colorante. Mientras que las poblaciones secundarios pueden parecer diferentes para cada tumor, el efecto de la verapamil es el mismo: la población lado desaparece. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55711/55711fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

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Isolation of the Side Population in Myc-induced T-cell Acute Lymphoblastic Leukemia in Zebrafish

A continuación, describimos una técnica para aislar las células de población lateral de un modelo de pez cebra de células T myc inducida por la leucemia linfoblástica aguda (LLA-T). Este ensayo población lado es muy sensible y se describe, por pez cebra T-ALL, pero puede ser aplicable a otros tipos de células de pez cebra malignas y no malignas.

Aislamiento de la población lateral en la leucemia linfoblástica aguda inducida por linfocitos T de Myc en peces cebra

Heterogeneous cell populations, from either healthy or malignant tissues, may contain a population of cells characterized by a differential ability to ...

isolation-side-population-myc-induced-t-cell-acute-lymphoblastic

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

6.5K vistas.  The University of Chicago.  A continuación, describimos una técnica para aislar las células de población lateral de un modelo de pez cebra de células T myc inducida por la leucemia linfoblástica aguda (LLA-T). Este ensayo población lado es muy sensible y se describe, por pez cebra T-ALL, pero puede ser aplicable a otros tipos de células de pez cebra malignas y no malignas. 

Video: Isolation of the Side Population in Myc-induced T-cell Acute Lymphoblastic Leukemia in Zebrafish

Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen presenting cells (APCs)1. This recognition leads to the activation of T-cells and a series of functional outcomes (e.g. cytokine production, killing of the target cells). Understanding the functional role of TCRs is critical to harness the power of the immune system to treat a variety of immunology related diseases (e.g. cancer or autoimmunity).
It is convenient to study TCRs in mouse models, which can be accomplished in several ways. Making TCR transgenic mouse models is costly and time-consuming and currently there are only a limited number of them available2-4. Alternatively, mice with antigen-specific T-cells can be generated by bone marrow chimera. This method also takes several weeks and requires expertise5. Retroviral transduction of TCRs into in vitro activated mouse T-cells is a quick and relatively easy method to obtain T-cells of desired peptide-MHC specificity. Antigen-specific T-cells can be generated in one week and used in any downstream applications. Studying transduced T-cells also has direct application to human immunotherapy, as adoptive transfer of human T-cells transduced with antigen-specific TCRs is an emerging strategy for cancer treatment6.
Here we present a protocol to retrovirally transduce TCRs into in vitro activated mouse T-cells. Both human and mouse TCR genes can be used. Retroviruses carrying specific TCR genes are generated and used to infect mouse T-cells activated with anti-CD3 and anti-CD28 antibodies. After in vitro expansion, transduced T-cells are analyzed by flow cytometry.

We present a protocol to produce antigen-specific mouse T-cells using retroviral transduction

Transducción retroviral de receptores de células T en ratones las células T

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

Investigación

Inmunología e Infección

Genotypic Inference of HIV-1 Tropism Using Population-based Sequencing of V3

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her viral population uses the CCR5 coreceptor for cellular entry, and not an alternative coreceptor. One approach to tropism testing is to examine the sequence of the V3 region of the HIV envelope, which interacts with the coreceptor.
Methods: Viral RNA is extracted from blood plasma. The V3 region is amplified in triplicate with nested reverse transcriptase-PCR. The amplifications are then sequenced and analyzed using the software, RE_Call. Sequences are then submitted to a bioinformatic algorithm such as geno2pheno to infer viral tropism from the V3 region. Sequences are inferred to be non-R5 if their geno2pheno false positive rate falls below 5.75%. If any one of the three sequences from a sample is inferred to be non-R5, the patient is unlikely to respond to a CCR5-antagonist.

HIV tropism can be inferred from the V3 region of the viral envelope. V3 is PCR amplified in triplicate using nested RT-PCR, sequenced, and interpreted using bioinformatic software. Samples with with 1 or more sequence(s) with low g2P scores are classified as non-R5 virus.

Inferencia genotípica del VIH-1 tropismo utilizando la población basada en la secuencia de V3

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her ...

Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

Graft-versus-host disease (GVHD) is the limiting barrier to the broad use of bone marrow transplant as a curative therapy for a variety of hematological deficiencies. GVHD is caused by mature alloreactive T cells present in the bone marrow graft that are infused into the recipient and cause damage to host organs. However, in mice, T cells must be added to the bone marrow inoculum to cause GVHD. Although extensive work has been done to characterize T cell responses post transplant, bioluminescent imaging technology is a non-invasive method to monitor T cell trafficking patterns in vivo. 
Following lethal irradiation, recipient mice are transplanted with bone marrow cells and splenocytes from donor mice. T cell subsets from L2G85.B6 (transgenic mice that constitutively express luciferase) are included in the transplant. By only transplanting certain T cell subsets, one is able to track specific T cell subsets in vivo, and based on their location, develop hypotheses regarding the role of specific T cell subsets in promoting GVHD at various time points. At predetermined intervals post transplant, recipient mice are imaged using a Xenogen IVIS CCD camera. Light intensity can be quantified using Living Image software to generate a pseudo-color image based on photon intensity (red = high intensity, violet = low intensity). 
Between 4-7 days post transplant, recipient mice begin to show clinical signs of GVHD. Cooke et al.1 developed a scoring system to quantitate disease progression based on the recipient mice fur texture, skin integrity, activity, weight loss, and posture. Mice are scored daily, and euthanized when they become moribund. Recipient mice generally become moribund 20-30 days post transplant. 
Murine models are valuable tools for studying the immunology of GVHD. Selectively transplanting particular T cell subsets allows for careful identification of the roles each subset plays. Non-invasively tracking T cell responses in vivo adds another layer of value to murine GVHD models.

Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

Murine bone marrow transplantation is a widely used technique to study immunological mechanisms governing graft-versus-host disease in humans. The ability to monitor T cell trafficking patterns in vivo allows for detailed analysis of the development and perpetuation of T cell responses during graft-versus-host disease.

La inducción de la enfermedad de injerto contra huésped y<em&gt; En Vivo</em&gt; T Monitoreo Celular Utilizando un modelo murino MHC de concordancia

Graft-versus-host disease (GVHD) is the limiting barrier to the broad use of bone marrow transplant as a curative therapy for a variety of hematological ...

Real-time Live Imaging of T-cell Signaling Complex Formation

Protection against infectious diseases is mediated by the immune system 1,2. T lymphocytes are the master coordinators of the immune system, regulating the activation and responses of multiple immune cells 3,4. T-cell activation is dependent on the recognition of specific antigens displayed by antigen presenting cells (APCs). The T-cell antigen receptor (TCR) is specific to each T-cell clone and determines antigen specificity 5. The binding of the TCR to the antigen induces the phosphorylation of components of the TCR complex. In order to promote T-cell activation, this signal must be transduced from the membrane to the cytoplasm and the nucleus, initiating various crucial responses such as recruitment of signaling proteins to the TCR;APC site (the immune synapse), their molecular activation, cytoskeletal rearrangement, elevation of intracellular calcium concentration, and changes in gene expression 6,7. The correct initiation and termination of activating signals is crucial for appropriate T-cell responses. The activity of signaling proteins is dependent on the formation and termination of protein-protein interactions, post translational modifications such as protein phosphorylation, formation of protein complexes, protein ubiquitylation and the recruitment of proteins to various cellular sites 8. Understanding the inner workings of the T-cell activation process is crucial for both immunological research and clinical applications.
Various assays have been developed in order to investigate protein-protein interactions; however, biochemical assays, such as the widely used co-immunoprecipitation method, do not allow protein location to be discerned, thus precluding the observation of valuable insights into the dynamics of cellular mechanisms. Additionally, these bulk assays usually combine proteins from many different cells that might be at different stages of the investigated cellular process. This can have a detrimental effect on temporal resolution. The use of real-time imaging of live cells allows both the spatial tracking of proteins and the ability to temporally distinguish between signaling events, thus shedding light on the dynamics of the process 9,10. We present a method of real-time imaging of signaling-complex formation during T-cell activation. Primary T-cells or T-cell lines, such as Jurkat, are transfected with plasmids encoding for proteins of interest fused to monomeric fluorescent proteins, preventing non-physiological oligomerization 11. Live T cells are dropped over a coverslip pre-coated with T-cell activating antibody 8,9, which binds to the CD3/TCR complex, inducing T-cell activation while overcoming the need for specific activating antigens. Activated cells are constantly imaged with the use of confocal microscopy. Imaging data are analyzed to yield quantitative results, such as the colocalization coefficient of the signaling proteins.

We describe a live-cell imaging method that provides insight into protein dynamics during the T-cell activation process. We demonstrate the combined usage of the T-cell spreading assay, confocal microscopy and imaging analysis to yield quantitative results to follow signaling complex formation throughout T-cell activation.

En tiempo real de imágenes en vivo de las células T de señalización Formación de complejos

Protection against infectious diseases is mediated by the immune system 1,2. T lymphocytes are the master coordinators of the immune system, regulating ...

Culturing Microglia from the Neonatal and Adult Central Nervous System

Microglia are the resident macrophage-like cells of the central nervous system (CNS) and, as such, have critically important roles in physiological and pathological processes such as CNS maturation in development, multiple sclerosis, and spinal cord injury. Microglia can be activated and recruited to action by neuronal injury or stimulation, such as axonal damage seen in MS or ischemic brain trauma resulting from stroke. These immunocompetent members of the CNS are also thought to have roles in synaptic plasticity under non-pathological conditions. We employ protocols for culturing microglia from the neonatal and adult tissues that are aimed to maximize the viable cell numbers while minimizing confounding variables, such as the presence of other CNS cell types and cell culture debris. We utilize large and easily discernable CNS components (e.g. cortex, spinal cord segments), which makes the entire process feasible and reproducible. The use of adult cells is a suitable alternative to the use of neonatal brain microglia, as many pathologies studied mainly affect the postnatal spinal cord. These culture systems are also useful for directly testing the effect of compounds that may either inhibit or promote microglial activation. Since microglial activation can shape the outcomes of disease in the adult CNS, there is a need for in vitro systems in which neonatal and adult microglia can be cultured and studied.

We outline methods for the efficient and quick isolation/culture of viable microglia from the neonatal cerebral cortex and adult spinal cord. The dissection and plating of cortical microglia can be accomplished within 90 minutes, with the subsequent microglial harvest taking place ~ 10 days following the initial dissection.

Microglia cultivo del Sistema Nervioso Central Neonatal y Adultos

Microglia are the resident macrophage-like cells of the central nervous system (CNS) and, as such, have critically important roles in physiological and ...

The Use of Fluorescent Target Arrays for Assessment of T Cell Responses In vivo

The ability to monitor T cell responses in vivo is important for the development of our understanding of the immune response and the design of immunotherapies. Here we describe the use of fluorescent target array (FTA) technology, which utilizes vital dyes such as carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE), violet laser excitable dyes (CellTrace Violet: CTV) and red laser excitable dyes (Cell Proliferation Dye eFluor 670: CPD) to combinatorially label mouse lymphocytes into &#62;250 discernable fluorescent cell clusters. Cell clusters within these FTAs can be pulsed with major histocompatibility (MHC) class-I and MHC class-II binding peptides and thereby act as target cells for CD8+ and CD4+ T cells, respectively. These FTA cells remain viable and fully functional, and can therefore be administered into mice to allow assessment of CD8+ T cell-mediated killing of FTA target cells and CD4+ T cell-meditated help of FTA B cell target cells in real time in vivo by flow cytometry. Since &#62;250 target cells can be assessed at once, the technique allows the monitoring of T cell responses against several antigen epitopes at several concentrations and in multiple replicates. As such, the technique can measure T cell responses at both a quantitative (e.g.&#160;the cumulative magnitude of the response) and a qualitative (e.g.&#160;functional avidity and epitope-cross reactivity of the response) level. Herein, we describe how these FTAs are constructed and give an example of how they can be applied to assess T cell responses induced by a recombinant pox virus vaccine.

The Use of Fluorescent Target Arrays for Assessment of T Cell Responses In vivo

The ability to monitor T cell responses in detail in vivo is important for the development of our understanding of the immune response. Here we describe the use of fluorescent target arrays (FTAs) in an in vivo T cell assay that assesses &#62;250 parameters simultaneously by flow cytometry.

El uso de fluorescentes Arrays objetivo para la evaluación de las respuestas de células T<em&gt; En vivo</em

The ability to monitor T cell responses in vivo is important for the development of our understanding of the immune response and the design of ...

An Ex vivo Model of an Oligodendrocyte-directed T-Cell Attack in Acute Brain Slices

Death of oligodendrocytes accompanied by destruction of neurons and axons are typical histopathological findings in cortical and subcortical grey matter lesions in inflammatory demyelinating disorders like multiple sclerosis (MS). In these disorders, mainly CD8+ T-cells of putative specificity for myelin- and oligodendrocyte-related antigens are found, so that neuronal apoptosis in grey matter lesions may be a collateral effect of these cells. Different types of animal models are established to study the underlying mechanisms of the mentioned pathophysiological processes. However, although they mimic some aspects of MS, it is impossible to dissect the exact mechanism and time course of &#8216;&#8216;collateral&#8217;&#8217; neuronal cell death. To address this course, here we show a protocol to study the mechanisms and time response of neuronal damage following an oligodendrocyte-directed CD8+ T cell attack. To target only the myelin sheath and the oligodendrocytes, in vitro activated oligodendrocyte-specific CD8+ T-cells are transferred into acutely isolated brain slices. After a defined incubation period, myelin and neuronal damage can be analysed in different regions of interest. Potential applications and limitations of this model will be discussed.

An Ex vivo Model of an Oligodendrocyte-directed T-Cell Attack in Acute Brain Slices

To address mechanisms of demyelination and neuronal apoptosis in cortical lesions of inflammatory demyelinating disorders, different animal models are used. We here describe an ex vivo approach by using oligodendrocyte-specific CD8+ T-cells on brain slices, resulting in oligodendroglial and neuronal death. Potential applications and limitations of the model are discussed.

Una<em&gt; Ex vivo</em&gt; Modelo de un ataque de células T Oligodendrocyte dirigida en Rebanadas cerebral agudo

Death of oligodendrocytes accompanied by destruction of neurons and axons are typical histopathological findings in cortical and subcortical grey matter ...

Mouse Na&#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Antigen inexperienced (na&#239;ve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition of cognate antigen presented on MHC class II. The cytokine signals present in the environment at the time of TCR activation are a major factor in determining the effector fate of a na&#239;ve CD4+ T cell. Although the cytokine environment during na&#239;ve T cell activation may be complex and involve both redundant and opposing signals in vivo, the addition of various cytokine combinations during naive CD4+ T cell activation in vitro can readily promote the establishment of effector T helper lineages with hallmark cytokine and transcription factor expression. Such differentiation experiments are commonly used as a first step for the evaluation of targets believed to promote or inhibit the development of certain CD4+ T helper subsets. The addition of mediators, such as signaling agonists, antagonists, or other cytokines, during the differentiation process can also be used to study the influence of a particular target on T cell differentiation. Here, we describe a basic protocol for the isolation of na&#239;ve T cells from mouse and the subsequent steps necessary for polarizing na&#239;ve cells to various T helper effector lineages in vitro.

Mouse Na&#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Na&#239;ve CD4+ T cells polarize to various subsets depending on the environment at the time of activation. The differentiation of na&#239;ve CD4+ T cells to various effector subsets can be achieved in vitro through the addition of T cell receptor stimuli and specific cytokine signals.

Ratón Naïve CD4<sup&gt; +</sup&gt; Aislamiento de células T y<em&gt; In vitro</em&gt; Diferenciación en subconjuntos de células T

Antigen inexperienced (na&#239;ve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition ...

Imaging CD4 T Cell Interstitial Migration in the Inflamed Dermis

The ability of CD4 T cells to carry out effector functions is dependent upon the rapid and efficient migration of these cells in inflamed peripheral tissues through an as-yet undefined mechanism. The application of multiphoton microscopy to the study of the immune system provides a tool to measure the dynamics of immune responses within intact tissues. Here we present a protocol for non-invasive intravital multiphoton imaging of CD4 T cells in the inflamed mouse ear dermis. Use of a custom imaging platform and a venous catheter allows for the visualization of CD4 T cell dynamics in the dermal interstitium, with the ability to interrogate these cells in real-time via the addition of blocking antibodies to key molecular components involved in motility. This system provides advantages over both in vitro models and surgically invasive imaging procedures. Understanding the pathways used by CD4 T cells for motility may ultimately provide insight into the basic function of CD4 T cells as well as the pathogenesis of both autoimmune diseases and pathology from chronic infections.

The mechanisms that govern the interstitial motility of CD4 effector T cells at sites of inflammation are relatively unknown. We present a non-invasive approach to visualize and manipulate in vitro-primed CD4 T cells in the inflamed ear dermis, allowing for study of the dynamic behavior of these cells in situ.

La migración de células T CD4 obtener imágenes intersticial en la dermis inflamadas

The ability of CD4 T cells to carry out effector functions is dependent upon the rapid and efficient migration of these cells in inflamed peripheral ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of inflammation. They are key players in the innate immune system and play major roles in cancer biology. Neutrophils have been proposed as key mediators of malignant transformation, tumor progression, angiogenesis and in the modulation of the antitumor immunity; through their release of soluble factors or their interaction with tumor cells. To characterize the specific functions of neutrophils, a fast and reliable method is coveted for in vitro isolation of neutrophils from human blood. Here, a density gradient separation method is demonstrated to isolate neutrophils as well as mononuclear cells from the blood. The procedure consists of layering the density gradient solution such as Ficoll carefully above the diluted blood obtained from patients diagnosed with chronic lymphocytic leukemia (CLL), followed by centrifugation, isolation of mononuclear layer, separation of neutrophils from RBCsby dextran then lysis of residual erythrocytes. This method has been shown to isolate neutrophils &#8805; 90 % pure. To mimic the tumor microenvironment, 3-dimensional (3D) experiments were performed using basement membrane matrix such as Matrigel. Given the short half-life of neutrophils in vitro, 3D experiments with fresh human neutrophils cannot be performed. For this reason promyelocytic HL60 cells are differentiated along the granulocytic pathway using the differentiation inducers dimethyl sulfoxide (DMSO) and retinoic acid (RA). The aim of our experiments is to study the role of neutrophils on the sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents. However these methods can be generalized to study the interactions of neutrophils or neutrophil-like cells with a large range of cell types in different situations.

Neutrophils are the most abundant type of white blood cells. The isolation of neutrophils from human blood by density gradient separation method and the differentiation of human promyelocytic (HL60) cells along the granulocytic pathway are described here; to test their role on sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents.