עבודה זו נתמכה על ידי אוניברסיטת דירקטוריון שיקגו נשים, קרן Case וונדי וויל, ואוניברסיטת גרנט מרכז התמיכה הסרטן שיקגו מקיף (CA014599 P30). ברצוננו להודות Core cytometry זרימה באוניברסיטת שיקגו עזרתם בהקמת הניסוי הזה, גם שאר חברי המעבדה דה יונג, במיוחד לסלי Pedraza ושון מקונל.

כל הנהלים עם דג הזברה אושרו על ידי טיפול בבעלי חיים מוסדיים ועדת שימוש (IACUC) באוניברסיטת שיקגו. אוניברסיטת שיקגו הוא מוכר על ידי האגודה להערכת ההסמכה של מעבדה טיפול בבעלי חיים (AAALAC). 1. יצירת בידוד בידוד fluorescently T- כל תאים דג הזברה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Microinjection לתוך עוברי דג הזברה הסיניגנית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות ערכות זמין מסחרית, לבודד rag2 עגול: c-myc ו rag2 : חלבון פלואורסצנטי ירוק (Rg2: GFP) פלסמיד DNA המכיל חוזר מסוף הפוך המוכרת על ידי טרנספוזיס tol2 (ראה טבלה של חומרים עבור המקור של פלסמיד DNA) 12 ו elute DNA במים סטריליים. הערה: GFP משמש במחקר זה, אבל כל חלבון פלואורסצנטי יעבוד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן pCS2-transposase (tol2) RNA <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בידוד tol2 פלסמיד DNA באמצעות ערכות זמין מסחרית (ראה tטבלה של חומרים הוא עבור מקור פלסמיד דנ&quot;א) 12 ו elute DNA במים סטריליים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה 1 מיקרוגרם של ה- DNA tol2 ב 37 מעלות צלזיוס למשך 1 שעות עם 5 יחידות של אנזים הגבלה NotI במאגר המתאים ליניארי הפלסמיד. חום-להשבית NotI ב 65 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לתמלל את RNA tol2 עם RNA פולימראז SP6 מן ה- DNA לינארית באמצעות ערכת שעתוק RNA זמין מסחרית 13. חנות RNA ב aliquots לשימוש חד פעמי ב -80 ° C. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכינים את תערובת הזרקה על הקרח על ידי הוספת 250 ננוגרם של rag2: פלסמיד דנ&quot;א c-myc, 250 ננוגרם של rag2: DNA פלסמיד ה- GFP, 150 ננוגרם של רנ&quot;א tol2, ו 0.5 μL של פנול אדום. כוון את עוצמת הקול 10 μL עם מים nuclease חינם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להזריק ~ 1 NL של תמהיל הזרקה לתוך תא של העובר דג הזברה syngeneic בשלב אחד התא באמצעות microinjector ו מחט משך מן צינור נימי זכוכית, בעקבות בעבר estabשיטות lished 8, 14. הערה: דג הזברה syngeneic שנוצר בשכפול גנטי 15 משמשים כאן כדי לחסל הטרוגניות גנטית ודחייה החיסון לאחר השתלת. עם זאת, דג הזברה wildtype או כל זן הרצוי יכול לשמש גם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סור מת, לא מפותח, או עובר פגום ב 24 שעות ולאחר 48 שעות לאחר הזרקה 16. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הדג מוזרק על מערכת דגים 6 ימים לאחר ההזרקה ולהעלות אותם על פי פרוטוקול סטנדרטי 6. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הקרנת דג זברה מוזרקת וניטור צמיחת גידולים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשעת 21 ימים לאחר הזרקה, במקום זחל אחד מוזרק אגל של מדיום העובר על צלחת פטרי מסך עבור GFP קרינה באמצעות מיקרוסקופ epifluorescent (bandpass עירור: 470/40, bandpass פליטה: 525/50) 8. הערה: זחלי דג זברה כי hAve משולבת הן rag2 : c-myc ו rag2 : GFP יהיה תימוס ניאון ירוק (דגים חיוביים) ועשויים כבר להפגין את הרחבת תאים ממאירים ירוק ניאון מעבר התימוס. כל הדג עם התימוס GFP + ימשיך לפתח GFP + T-ALL. הזחלים שאינם מראים שילוב של פלסמידים לא יהיה כל תאים פלואורסצנטיים ירוקים (דגים שליליים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפריד את הדגים השליליים (על בסיס חוסר הקרינה) לתוך טנק אחר לפקח על הדג שוב ב 28 ו -35 ימים שלאחר ההזרקה. ב 28 ו -35 ימים לאחר ההזרקה, להרדים את הדג עם 0.02% שנאגרו tricaine (MS-222) במי המערכת של מערכת דגים לפני ההקרנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים כל זחל דג הזברה כי חיובי עבור תימוס שכותרתו fluorescently או גידול שכותרתו fluorescently בטנק בודד לניטור הגידול הגידול שלוש פעמים בשבוע. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אוסף של תאים שכותרתו fluorescently T-ALL מדג הגידול הראשוני <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן לפחות 20 מ&quot;ל של 10% חום- inactivated בסרום שור עוברית ב 0.9x פוספט שנאגרו מלוחים (FBS / PBS). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 מ&quot;ל של FBS / PBS לבקבוקון אחד של מלח נתרן הפרין (300 יחידות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר דגים הנושאים גידולים ביותר מ 50% של הגוף, או דגים אלה מתקשים לאכול או לשחות. להקריב את הדגים על ידי מינון יתר עם טריקין או על ידי טבילה במים הקרח. לאשר את המוות על ידי חוסר של זיל תנועה דופק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש סכין גילוח כדי להסיר את ראש הדג. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את חלל הדגים עם פתרון הפרין כדי להסיר עודף כדוריות דם אדומות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות פיפטה, להזריק 100 μL של פתרון הפרין (מוכן בשלב 1.3.2) לתוך חלל הגוף של הדג. הסר את כל הנוזל שנשפך החוצה (זה יכיל תאי דם) ופיפטה אותו לתוך צינור microcentrifuge 1.5 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש קצה פיפטה טרי לשטוף את הגוף שוב. בצעו לפחות שלושה שוטפים, או עד שהנוזלים שנשפכו מופיעים ללא צבעאוד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחק את כל הנוזל מן השטיפות ב 1.3.5.1 צעדי 1.3.5.2, כפי שהוא לא ישמש בניתוחים נוספים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אוספים את התאים לוקמיה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להזריק 100 μL של FBS / PBS לתוך חלל הגוף של הדג. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפעיל לחץ עדין החלק החיצוני של הגוף של הדג עם קצה פיפטה לסחוט / לדחוף את תאי הגידול. הערה: אם שלב זה מבוצע באמצעות מיקרוסקופ לנתח, תאי גידול השפיכה מתוך חלל הגוף יהיו ברורים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אסוף את הנוזל ותאי מכל לשטוף לתוך צינור 1.5 מ&quot;ל microcentrifuge. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזרו על שלבים 1.3.6.1-1.3.6.3 עד שרוב תאי הגידול נאספים (בדרך כלל 5-10 פעמים). לאסוף את כל התאים הסרטניים לתוך 1.5 מ&quot;ל microcentrifuge צינור זהה. שמור את התאים בטמפרטורת החדר. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים את התאים הסרטניים שנאספו צעד 1.3.6 ידי pipetting אותם בעדינות כדי לנתק את גושים של תאים. סנן את ההשעיה התא דרך 4מסנן רשת 0 מיקרומטר. שטפו את המסנן 1-2 פעמים עם 100 μL של FBS / PBS. שמור את התאים בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים 2 μL של ההשעיה תא עם 18 μL של trypan כחול (0.4%, בדילול 01:10 ומסוננים) בצינור חדש. טען 10 μL על hemocytometer ולספור את מספר חי (לא כחול) תאי ניאון כדי לחשב את מספר תאים סרטניים בודדים. הערה: Non-כחול תאי GFP-שלילי צפויים נורמלים, לא ממאיר T-תאים ולא צריך לספור. לפחות 2 x 10 6 תאים נדרשים להכתים את התאים עם Hoechst 33,342. </li></ol></li></ol> 2. מגירה על תאים-ALL T שכותרתו fluorescently עם Hoechst 33,342 כדי לזהות את האוכלוסייה Side <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל Hoechst 33,342 01:10 עם H nuclease- חופשית 2 O כדי להפוך את הריכוז בעבודה 1 מ&quot;ג / מ&quot;ל. אחסן את הצבע על 4 מעלות צלזיוס בחושך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון 100 מ&quot;מ של verapamil ידי המסת 49.1 מ&quot;ג ב 1 מ&quot;ל של sulfoxide דימתיל (DMSO). הערה: Verapamil הוא מעכב של מובילי ABC והוא פקד חשוב עבור ניסויי אוכלוסייה בצד. הוספת verapamil כדי דגימות תמנע את היכולת של מובילי ABC כדי בזרימת צבע Hoechst 33,342. לכן, אוכלוסיית צד אמיתית תיעלם כאשר verapamil מתווסף המדגם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר באמבט מים 28 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכינו דגימות ובקרות בחושך על ידי הוספת תאים ופתרונות צינורות סדרן התא המופעל פלואורסצנטי (FACS). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את הדגימות על ידי הוספת 10 6 תאים, 15 μL של 1 מ&quot;ג / מ&quot;ל Hoechst 33,342, ו 2.5 μL של DMSO לצינור FACS. כוון את עוצמת הקול 1 מ&quot;ל עם FBS / PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את הבקרות על ידי הוספת 10 6 תאים, 15 μL של 1 מ&quot;ג / מ&quot;ל Hoechst 33,342, ו 2.5 μL של 100 מ&quot;מ verapamil לצינור FACS. כוון את עוצמת הקול 1 מ&quot;ל עם FBS / PBS. הערה: מינימום של 10 6 תאים / מדגם מומלץ, אבל מכתים יותר בתאים עדיף, במיוחד אם הצד populatתאי יון ימוינו לניתוח נוסף. אין לעבור 10 6 תאים / מ&quot;ל, ולשמור על ריכוז Hoechst 33,342 ב 15 מיקרוגרם / מ&quot;ל. אם 10 x 10 6 תאים מגואלות, נפח התגובה הכולל הוא 10 מ&quot;ל. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה באמבט מים C 28 ° בחושך במשך 120 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הדגירה, למקם את התאים מיד על הקרח ולשמור אותם בחושך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גלולת התאים ב 4 מעלות צלזיוס למשך 6 דקות ב g 300 x. הסר את supernatant. לשטוף עם 1 מ&quot;ל של FBS / PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גלולת התאים ב 4 מעלות צלזיוס למשך 6 דקות ב g 300 x. הסר את supernatant. Resuspend התאים 1 מ&quot;ל של FBS / PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור על 4 מעלות צלזיוס עד מיון התא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 15 דק &#39;לפני מיון תאים, להוסיף 2 μL של יודיד propidium המניות (PI) (1 מ&quot;ג / מ&quot;ל) לכל 1 מ&quot;ל של FBS / PBS (ריכוז סופי: 2 מיקרוגרם / מ&quot;ל). לערבב היטב. </li></ol> 3. השתמשו FACS כדי למצוא את אוכלוסיית הסייד בתוך אוכלוסיית תאי T-ALL שכותרתו fluorescently <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li&gt; לנתח את דג הזברה מוכתמים T-ALL התא השעיות על סדרן התא מצויד לייזר UV עבור Hoechst 33342 עירור צבע ו לייזר 488 ננומטר עבור עירור PI ו לזיהוי של ה- GFP + T-ALL תאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קביעת שער לחיות, GFP + T-ALL תאים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש קדימה פיזור (FSC) ופיזור בצד (SSC) אזור לשפכים החוצה החוצה. הערה: FSC משמש כדי להבדיל בין גודל התא ו SSC משמש כדי להבדיל את הפירוט של התא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש FSC רוחב SSC כדי להפלות כפילויות. הערה: ישנם שלושה מרכיבים שזוהו על ידי גלאי cytometer זרימה: שטח, גובה ורוחב. שטח משמש בדרך כלל למדוד את הקרינה של התא. רוחב מודד את זמן הטיסה, והוא רחב פי שניים, אם שני תאים מחוברים זה לזה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור תאים סרטניים חיים, לצייר שער סביב התאים החיוביים עבור ה- GFP ושלילי עבור PI באמצעות גלאים המתאימים ( למשל , FITC עבור ה- GFP ו PerCP Cy5-5 עבור PI). </li></ol></li><li&gt; בשער תא חי, למדוד את Hoechst 33342 הקרינה דרך Hoechst כחול Hoechst האדום bandpass מסננים (450/50 ו 670/30, בהתאמה). הערה: אוכלוסיית הצד, אם קיימת, תוצג לאחר הקמתה. חשוב לציין, האוכלוסייה בצד חייב להיעלם שליטה verapamil על מנת שזה ייחשב אוכלוסייה בצד אמיתי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם מיון תאים האוכלוסייה בצד לניסויים נוספים, להשתמש קצה זרבובית גדולה (100 מיקרומטר) ולאסוף את התאים לתוך צינור FACS המכיל 3 מ&quot;ל של 100% FBS. השתמש קצה זרבובית גדולה יותר (100 מיקרומטר) במקום קצה קטן (70 מיקרומטר) כדי לשפר את הכדאיות התא לאחר מיון. </li></ol>

<ol>
	<li>Goodell, M., Brose, K., Paradis, G., Conner, A., Mulligan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+functional+properties+of+murine+hematopoietic+stem+cells+that+are+replicating+in+vivo.">Isolation and functional properties of murine hematopoietic stem cells that are replicating in vivo.</a> J. Exp. Med. 183, 1797-1806 (1996).</li><li>Golebiewska, A., Brons, N. H. C., Bjerkvig, R., Niclou, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+appraisal+of+the+side+population+assay+in+stem+cell+and+cancer+stem+cell+research.">Critical appraisal of the side population assay in stem cell and cancer stem cell research.</a> Cell Stem Cell. 8, 136-147 (2011).</li><li>Dooley, K., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish:+a+model+system+for+the+study+of+human+disease.">Zebrafish: a model system for the study of human disease.</a> Curr Opin Genet Dev. 10 (3), 252-256 (2000).</li><li>White, R., Rose, K., Zon, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+cancer:+the+state+of+the+art+and+the+path+forward.">Zebrafish cancer: the state of the art and the path forward.</a> Nat Rev Cancer. 13 (9), 624-636 (2013).</li><li>Kobayashi, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+and+localization+of+side+population+(SP)+cells+in+zebrafish+kidney+hematopoietic+tissue.">Characterization and localization of side population (SP) cells in zebrafish kidney hematopoietic tissue.</a> Blood. 111 (3), 1131-1137 (2008).</li><li>Tsinkalovsky, O., Vik-Mo, A. O., Ferreira, S., Laerum, O. D., Fjose, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+kidney+marrow+contains+ABCG2-dependent+side+population+cells+exhibiting+hematopoietic+stem+cell+properties.">Zebrafish kidney marrow contains ABCG2-dependent side population cells exhibiting hematopoietic stem cell properties.</a> Differentiation. 75 (3), 175-183 (2007).</li><li>Langenau, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myc-induced+T+cell+leukemia+in+transgenic+zebrafish.">Myc-induced T cell leukemia in transgenic zebrafish.</a> Science. 299, 887-890 (2003).</li><li>Blackburn, J. S., Liu, S., Langenau, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+the+frequency+of+tumor-propagating+cells+using+limiting+dilution+cell+transplantation+in+syngeneic+zebrafish.">Quantifying the frequency of tumor-propagating cells using limiting dilution cell transplantation in syngeneic zebrafish.</a> J Vis Exp. , e2790 (2011).</li><li>Martelli, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+signaling+pathways+in+T-cell+acute+lymphoblastic+leukemia+initiating+cells.">Targeting signaling pathways in T-cell acute lymphoblastic leukemia initiating cells.</a> Adv Biol Regul. 56, 6-21 (2014).</li><li>Smith, A. C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+cell+transplantation+establishes+that+tumor-initiating+cells+are+abundant+in+zebrafish+T-cell+acute+lymphoblastic+leukemia.">High-throughput cell transplantation establishes that tumor-initiating cells are abundant in zebrafish T-cell acute lymphoblastic leukemia.</a> Blood. 115 (16), 3296-3303 (2010).</li><li>Blackburn, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+evolution+enhances+leukemia-propagating+cell+frequency+in+T+cell+acute+lymphoblastic+leukemia+through+Akt/mTORC1+pathway+activation.">Clonal evolution enhances leukemia-propagating cell frequency in T cell acute lymphoblastic leukemia through Akt/mTORC1 pathway activation.</a> Cancer Cell. 25, 366-378 (2014).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+Methods+in+Cellular+and+Molecular+Biology.+Plasmid+Purification.">Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Plasmid Purification.</a> JoVE Science Education Database. , (2016).</li><li>Kawakami, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tol2:+a+versatile+gene+transfer+vector+in+vertebrates.">Tol2: a versatile gene transfer vector in vertebrates.</a> Genome Biol. 8, (2007).</li><li>Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microinjection+of+zebrafish+embryos+to+analyze+gene+function.">Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function.</a> J Vis Exp. (25), (2009).</li><li>Mizgireuv, I. V., Revskoy, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantable+tumor+lines+generated+in+clonal+zebrafish.">Transplantable tumor lines generated in clonal zebrafish.</a> Cancer Research. 66 (6), 3120-3125 (2006).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Zebrafish Book: A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish. , (1993).</li><li>Hirschmann-Jax, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+distinct+"side+population"+of+cells+with+high+drug+efflux+capacity+in+human+tumor+cells.">A distinct "side population" of cells with high drug efflux capacity in human tumor cells.</a> Proc Natl Acad Sci. USA. 101 (39), 14228-14233 (2004).</li><li>Komuro, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+side+population+cells+(stem-like+cell+population)+in+pediatric+solid+tumor+cell+lines.">Identification of side population cells (stem-like cell population) in pediatric solid tumor cell lines.</a> J Pediatr Surg. 42 (12), 2040-2045 (2007).</li><li>Moshaver, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+small+subpopulation+of+candidate+leukemia-initiating+cells+in+the+side+population+of+patients+with+acute+myeloid+leukemia.">Identification of a small subpopulation of candidate leukemia-initiating cells in the side population of patients with acute myeloid leukemia.</a> Stem Cells. 26 (12), 3059-3067 (2008).</li></ol>

למחברים אין מה לחשוף.

Assay האוכלוסייה בצד הוא רגיש מאוד; לכן, שינויים קטנים בפרוטוקול יכול לגרום לקושי באיתור תאים באוכלוסייה בצד. ראשית, הטמפרטורה במהלך שלב מכתים הוא ספציפי לכל חיה / מערכת התא. עבור מערכות יונקים, assay האוכלוסייה בצד מבוצע בדרך כלל על 37 מעלות צלזיוס. כאשר דג הזברה T-ALL תאים הודגרו על 37 מעלות צלזיוס, רבים של תאים מת, מה שגרם טמפרטורת הדגירה מקובל (הנתונים לא מוצג). כאשר Kobayashi ועמיתיו (2008) גזור דג הזברה מוח העצם עבור assay האוכלוסייה בצד, האינקובציות בוצעו ב 25 ° C 5 . הטמפרטורה הדגירה לא היה מספיק עבור דג הזברה תאים T-ALL, כפי שהוא הביא פרופיל חלש 33342 Hoechst (נתונים לא מוצג). בפרוטוקול המתואר כאן, הטמפרטורה דגירה של 28 מעלות צלזיוס היה אופטימלי כדי לשמור על הכדאיות התא כדי להשיג פרופיל Hoechst 33342 חזק. תנאים שניים עבור assay אוכלוסיית הצד הדורש התייחסות ובדיקה מוקדמת הוא הריכוז של Hoechst 33342. אם הריכוז של Hoechst 33,342 נמוך מדי, אוכלוסיית הצד לא יכולה להיות גלויה, או הפנוטיפ האוכלוסייה בצד (לצבוע יכולת בזרימה) רשאיים יוגדל באופן שקרי, זיהוי תאי אוכלוסייה צדים יותר הם בעצם הווה 2. מצד השני, גבוה מדי של ריכוז של Hoechst 33,342 יכול להיות רעיל לתאים. עבור תאים דג הזברה T-ALL, 15 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​Hoechst 33,342 וטופחו במשך 120 דק &#39;הוא השילוב האופטימלי. ריכוזים נמוכים של Hoechst 33,342 נשפטו עבור תאי דג זברת T-ALL, אבל אוכלוסיית הלוואי שלא תמיד הייתה ברורה (מידע לא מוצג). זמן דגירה כולל של 90 דקות היה מספיק כדי לזהות אוכלוסיית לוואי, אך המספר המרבי של תאי אוכלוסייה בצד נתפס לאחר 120 דקות של זמן דגירה. כפי שדווח בעבר עבור ים יונק<html> Ystems, לא כל גידול יהיה האוכלוסייה בצד לזיהוי 17 , 18 , 19 . באמצעות שיטה זו, ראינו אוכלוסיית צד ב 14 מתוך 17 T-ALLs נבדק (נתונים לא מוצג). לאחר בודדים בצד האוכלוסייה תאים מ T-ALLs, שיטה זו צפויה להיות ישימה מודלים דג הזברה אחרים. בתוך גידול דג הזברה הטרוגנית T-ALL, תאי לוקמיה ליוקמיה (lics) מסוגלים לצמיחה מחדש של הגידול, וככאלה הם האמינו באחריות לסרטן ולגרורות. נכון לעכשיו, אין שיטה דג הזברה המאפשר בידוד פוטנציאלי של LICs in vivo . חישוב תדר LIC דורש השתלת תאים סרטניים בדילול מגביל 8 , 10 . מחקרים שפורסמו בעבר עם דג הזברה משובטים זיהו כי LICs לפצות 0.1-1.4% של תאים ראשוניים T-ALL&quot;Xref&quot;&gt; 10. הנה, השתנות דומה לתדירות של תאים האוכלוסייה בצד (0.2-1.0%) מן משובט דג הזברה T יכלתי מדווח (איור 2). ניסויים נוספים נדרשים כדי לקבוע אם האוכלוסייה בצד מועשרת LICs; עם זאת, הדמיון בין הטווחים של תדר LIC ואחוז תאי האוכלוסייה בצד ב T-יכלתי אלה תומך בהשערה זו. בעוד assay האוכלוסייה בצד רגיש ולא תמיד קל לבצע, assay מאפשר לחוקרים, בפעם הראשונה, כדי לבודד אוכלוסיה נדירה של תאים דג הזברה T-ALL שעשויים להיות בעלי תכונות גזע או תאי אב. כרגע אין סמנים פני התא זמין דג הזברה לזהות תאים stem- או אב-כמו; ומכאן, היכולת לבודד את האוכלוסייה בצד מאוד מבטיחה. יישומים עתידיים של שיטה זו כוללים ניסויי השתלת דילול גבול של תאי T-ALL אוכלוסייה בצד ממוין להעריך את העשרת LICS. בנוסף, שיטה זו תאפשר מאפיינים שמגדירים LICs הובהרו, כולל המנגנונים המולקולריים השולטים LICs דג הזברה T-ALL. ניסויים אלו יכולים לספק נקודת המוצא שלפיה לגילוי מטרות טיפוליות חדשות T-ALL.

את assay האוכלוסייה בצד מנצל את היכולת המשופרת של תאים מסוימים בתוך רקמה כדי בזרימת צבע מחייב DNA Hoechst 33,342 בשל רמות גבוהות של קלטת מחייב ATP (ABC) חלבונים טרנספורטר על קרום התא. התאים בזרימת הצבע Hoechst 33,342 ניתן לזהות באמצעות ניתוח תזרים cytometric גל כפול אחרי צבען הוא נרגש על ידי לייזר UV. Assay זה שימש הראשון לזהות תאי גזע hematopoietic בעכברים (HSCs) 1, אבל זה ומאז משמש לזיהוי אוכלוסיות תאי גזע / ובתאים רבים רקמות סרטן (הנסקרת תוך התייחסות 2). עם זאת, לא כל האוכלוסיות של תאים יש אוכלוסייה בצד, ולא כל אוכלוסיות הצד מועשרות עבור תאי גזע / אב. דג הזברה היא מערכת מודל גנטי חוליות עצמה לחקר סרטן 3 אנושי, 4, עם מספר היתרונות על פני mo בעכברים המסורתיdels של סרטן. עוברי דג זברה הם מופרים חיצוניים, ברורים אופטיים, הקלת transgenesis ואת תצפית in vivo של תהליכים פתולוגיים, לרבות ייזום התקדמות סרטן. נכון להיום, assay האוכלוסייה בצד לזהות תאי גזע או ובתאים פוטנציאל יושם רק עד לשד הכליה דג הזברה לזהות HSCs, ולא לכל דגמי סרטן דג הזברה 5, 6. המודל דג הזברה של לוקמיה לימפובלסטית חריפה תאי T (T-ALL) היא מורפולוגית גנטית דומה האנושי T-ALL 7, 8, 11. T-ALL הוא ממאירות אגרסיבית כי, בבני אדם, מהווה 10-15% של ילדים ו 25% מכלל הבוגרים במקרים 9. בעוד הטיפול של T-ALL השתפר, הישנות עדיין נפוצה קשורה פרוגנוזה גרועה. T-ALL גידולים הם heterogeneיחידות ארגוניות ומכילות תת-אוכלוסיות תאים סרטניים רבות שונות, כוללים תאי ייזום לוקמיה (LICs). LICs מוגדר על ידי יכולתי להצמיח מחדש את הגידול כולו מתא בודד, ואת התדירות של LICs בתוך אוכלוסיית תאים סרטניים יכול להיות מחושב על ידי השתלת תאים במינונים משתנים לתוך נמענים באמצעות assay השתלת דילול מגביל (LDA). בעוד ניסויי LDA בוצעו דג זברה כדי לחשב את התדירות של 8 LICs, 10, 11, קביעה זו נעשית בדיעבד ואינה מאפשרת את הבידוד הפוטנציאלי של LICs. לכן, שיטה לבודדת פרוספקטיבית אוכלוסייה המועשרת עבור פעילות תאי גזע סרטני חסרה. זיהוי ובידוד תאי האוכלוסייה בצד מן דג הזברה טי יכלתי היא הצעד הראשון לקראת פונה חסר זה. הפרוטוקול המובא כאן מתאר כיצד ליצור ביעילות T-ALL גידולים zebrafish ניצול transgenesis בתיווך-tol2, לקצור את T-ALL תאים גידולים, ואת להכתים אותם עם Hoechst 33,342 כדי לזהות את האוכלוסייה בצד של תאים. עתיד בניסויי vivo עם דג הזברה T-ALL יכול לכלול בין תאי האוכלוסייה בצד מועשרים עבור LICs או בעלי תכונות stem- או ובתאים אחרות דמויים.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="859">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:245px;">Syngeneic zebrafish (CG2)</td>
			<td style="width:199px;"></td>
			<td style="width:208px;"></td>
			<td style="width:208px;">See Mizgireuv et al., 2006</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:245px;">rag2:c-myc plasmid</td>
			<td style="width:199px;"></td>
			<td style="width:208px;"></td>
			<td>Langenau Laboratory</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:245px;">rag2:GFP plasmid constructed in de Jong Lab</td>
			<td style="width:199px;"></td>
			<td style="width:208px;"></td>
			<td style="width:208px;">rag2 promoter from Langenau Laboratory</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:245px;">pCS2-transposase plasmid</td>
			<td style="width:199px;"></td>
			<td style="width:208px;"></td>
			<td>Chien Laboratory</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:245px;">NotI -HF restriction enzyme</td>
			<td style="width:199px;">New England Bio-Labs Inc.</td>
			<td>R3189S</td>
			<td>500 units in 25 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:245px;">mMessage Machine SP6 Transcription Kit</td>
			<td style="width:199px;">Ambion</td>
			<td style="width:208px;">Thermo Fisher Scientific - AM1340</td>
			<td>25 reactions</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:245px;">QIAGEN Plasmid Midi Kit</td>
			<td style="width:199px;">Qiagen, Inc.</td>
			<td style="width:208px;">12643</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:245px;">SteREO Discovery V8 Microscope</td>
			<td style="width:199px;">Carl Zeiss Microscopy</td>
			<td>495015-0008-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:245px;">Digital microinjector</td>
			<td style="width:199px;">Tritech Research</td>
			<td>MINJ-D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:245px;">Brass straight-arm needle holder</td>
			<td style="width:199px;">Tritech Research</td>
			<td>MINJ-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:245px;">Magnetic base and stand</td>
			<td style="width:199px;">Tritech Research</td>
			<td>MINJ-HBMB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:245px;">Micromanipulator</td>
			<td style="width:199px;">Narishige International</td>
			<td style="width:208px;">MN153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:245px;">Glass capillaries</td>
			<td style="width:199px;">Sutter Instrument Co.</td>
			<td style="width:208px;">B100-50-10</td>
			<td>10 cm without filament</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:245px;">Flaming/Brown micropipette puller</td>
			<td style="width:199px;">Sutter Instrument Co.</td>
			<td style="width:208px;">P-97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:245px;">Microloader pipette tips</td>
			<td style="width:199px;">Eppendorf North America Inc.</td>
			<td>930001007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:245px;">Phenol Red solution</td>
			<td style="width:199px;">Sigma Life Science</td>
			<td style="width:208px;">P0290</td>
			<td>0.5% concentration 100 mL</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:245px;">Plastic Transfer pipettes</td>
			<td style="width:199px;">Fisherbrand</td>
			<td>137119D</td>
			<td>graduated 7.5 mL bulb</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Tricaine methanesulfonate (MS-222)</td>
			<td style="width:199px;">Western Chemical, Inc.</td>
			<td style="width:208px;">Fisher Scientific - NC0342409</td>
			<td>100 g</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:245px;">Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td style="width:199px;">HyClone Laboratories, Inc.</td>
			<td style="width:208px;">Fisher Scientific - SH3007103</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:245px;">Phosphate-Buffered Saline (PBS)</td>
			<td style="width:199px;">Gibco by Life Technologies</td>
			<td style="width:208px;">1001-023</td>
			<td>pH 7.4 (1x) - 500 mL</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:245px;">Heparin sodium salt</td>
			<td style="width:199px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:208px;">2106</td>
			<td>15 - 300 unit vials</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:245px;">40 um mesh filter</td>
			<td style="width:199px;">Falcon Corning Brand</td>
			<td style="width:208px;">352340</td>
			<td>Case of 50</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:245px;">Trypan blue</td>
			<td style="width:199px;">Sigma Life Science</td>
			<td style="width:208px;">T8154</td>
			<td>20 mL - Solution (0.4%)</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:245px;">Hoechst 33342</td>
			<td style="width:199px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:208px;">H3570</td>
			<td>10 mL</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:245px;">Verapamil</td>
			<td style="width:199px;">Sigma Life Science</td>
			<td style="width:208px;">V4629</td>
			<td>1 g</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:245px;">Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td style="width:199px;">Sigma Life Science</td>
			<td style="width:208px;">D8418</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:245px;">Propidium Iodide</td>
			<td style="width:199px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:208px;">P3566</td>
			<td>10 mL</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">FACSAria Fusion cell sorter</td>
			<td style="width:199px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:208px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:245px;">BD FACSDiva 8.0.1</td>
			<td style="width:199px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:208px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:245px;">FlowJo v10.2</td>
			<td style="width:199px;">FlowJo, LLC</td>
			<td style="width:208px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of the side population in myc-induced t-cell acute lymphoblastic leukemia in zebrafish

אוכלוסיות תאים הטרוגניות, ברקמות בריאים או ממאירים, עשויות להכיל אוכלוסיה של תאים המאופיינים ביכולת דיפרנציאלית להפרדת צבע ה- DNA מחייב 33342. זה &quot;אוכלוסיית הצד&quot; של תאים ניתן לזהות באמצעות שיטות זרימה cytometric לאחר Hoechst 33342 צבע נרגש על ידי לייזר אולטרה סגול (UV). אוכלוסיית הצד של סוגי תאים רבים מכילה תאים דמויי גזע או אב. עם זאת, לא כל סוגי התאים יש אוכלוסייה בצד לזיהוי. Danio rerio , דג הזברה, יש חזקים במודל vivo של תא T-ALL לוקמיה חריפה (T-ALL), אבל אם אלה דג הזברה T-ALLs יש אוכלוסייה צד לא ידוע. השיטה המתוארת כאן מתאר כיצד לבודד את התאים האוכלוסייה בצד דג הזברה T-ALL. כדי להתחיל, T-ALL דג הזברה נוצרת באמצעות microinjection של פלסמידים tol2 לתוך עוברים שלב אחד תא. לאחר הגידול גדלו לשלב שבו הם מתפשטים לתוך יותר ממחצית האניהגוף של mal, תאי T-ALL ניתן לקצור. התאים אז מגואלות Hoechst 33,342 ובחנו ידי cytometry זרימה עבור תאי אוכלוסייה בצד. לשיטה זו יישומים רחב של דג הזברה T-ALL המחקר. אמנם אין סמנים פני תא ידוע של דג זברה כי לאשר תאי אוכלוסייה בצד אלה הם תאים דמויים גזע סרטני, in vivo מבחני השתלה פונקציונליים אפשריים. יתר על כן, transcriptomics מתא בודד יכול להיות מיושם כדי לזהות את המאפיינים הגנטיים של תאי האוכלוסייה בצד אלה.

כדי ליצור ניאון ביעילות המושרה myc T-ALL גידולים דג הזברה, בונה DNA מעגלי מוקף אתרים transposase tol2 יכול להיות שותף מוזרק עם RNA tol2. מחקרים קודמים מן ההזרקה של ה- DNA לינארית לתוך עוברי דג זברה לדווח על שיעור 5% transgenesis 8. עם הפרוטוקול מותאם כולל transgenesis בתיווך-tol2, שיעורי transgenesis החל 10-44% ניתן לראות (לוח 1). בדוגמא הנציג, דג עם GFP + T-ALL היה מוכתם Hoechst 33,342 כדי לקבוע את אחוז תאי האוכלוסייה בצד. איור 1 מציג את ערכת gating המשמשת לקביעת אחוזי תאי אוכלוסייה בצד. ראשית, באמצעות FSC ו SSC, תאי T-ALL מבודדים על ידי למעט פסולת (איור 1 א) ובהמשך הבחירה נגד כפילויות (איור 1B). בשלב בא, כל תאי החיים מבודדים על ידי gating תאים הנמצאים GFP + ושלילי עבור מאבחן PI תאים המת (האיור 1C). לאחר יחיד, לחיות תאי T-ALL נבחרים, האוכלוסייה בצד ניתן למצוא את פרופיל 33,342 Hoechst. בשנת אוכלוסיית התא הראשית, Hoechst 33,342 נשאר בתאים, ותאים אלה ניתן להפריד לקבוצות לפי תוכן DNA. עם זאת, אוכלוסיית התאים בצד להבדיל ביניהם לבין אוכלוסיית התא הראשית, כמו תאי אוכלוסייה בצד בזרימת הצבע בשל מספרים גבוהים של מובילי ABC על קרום התא. כדי להמחיש את האוכלוסייה בצד, פרופיל Hoechst משמש להשוות בין שני ערוצים, Hoechst כחול Hoechst אדום. אוכלוסיית הצד היא הזנב העמום של תאי הארכה מצד השמאל של אוכלוסיית התא הראשית לכיוון הציר הכחול Hoechst (איור 1D). אוכלוסיית צד אמיתית תיאבד כאשר תאי מטופלים עם o מעכבהובלות ABC, כגון verapamil. איור 2 מציג את אוכלוסיות הצד בכמה גידולי T-ALL מייצגים, כמו גם כאשר אותם גידולים מטופלים עם verapamil במהלך מכתים עם Hoechst 33342. כדי להבטיח כי האוכלוסייה נמצא המדגם הוא אוכלוסייה בצד נכון, תאים אלה חייבים להיעלם בנוכחות המעכב, כפי שמוצג באיור 2 . <table height="525" width="487" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> מספר מלאי </td><td> מספר דגים מוקרנים </td><td> מספר חיובי </td><td> שיעור טרנסגנסיס </td></tr><tr><td> 930 </td><td> 21 </td><td> 3 </td><td> 14.3% </td></tr><tr><td> 934 </td><td> 12 </td><td> 4 </td><td> 33.3% </td></tr><tr><td> 950 </td><td> 12 </td><td> 5 </td><td> 41.7% </td></tr><tr><td> 951 </td><td> 19 </td><td> 3 </td><td> 15.8% </td></tr><tr><td> 960 </td><td> 3 &lt;/ Td&gt; <td> 1 </td><td> 33.3% </td></tr><tr><td> 983 </td><td> 9 </td><td> 4 </td><td> 44.4% </td></tr><tr><td> 1004 </td><td> 30 </td><td> 3 </td><td> 10.0% </td></tr><tr><td> 1013 </td><td> 4 </td><td> 1 </td><td> 25.0% </td></tr><tr><td> 1025 </td><td> 35 </td><td> 5 </td><td> 14.3% </td></tr><tr><td> 1029 </td><td> 10 </td><td> 2 </td><td> 20.0% </td></tr><tr><td> 1065 </td><td> 5 </td><td> 1 </td><td> 20.0% </td></tr><tr><td> 1070 </td><td> 6 </td><td> 1 </td><td> 16.7% </td></tr><tr><td> 1073 </td><td> 19 </td><td> 8 </td><td> 42.1% </td></tr><tr><td> 1079 </td><td> 8 </td><td> 1 </td><td> 12.5% </td></tr><tr><td> 1105 </td><td> 38 </td><td> 7 </td><td> 18.4% </td></tr><tr><td> 1193 </td><td> 30 </td><td> 8 </td><td> 26.7% </td></tr><tr><td> 1215 </td><td> 9 </td><td> 1 </td><td> 11.1% </td></tr><tr><td>1229 </td><td> 10 </td><td> 2 </td><td> 20.0% </td></tr><tr><td> 1314 </td><td> 6 </td><td> 1 </td><td> 16.7% </td></tr></tbody></table> טבלה 1: שערי transgenesis בעת שימוש טרנספוזז Tol2 עבור Microinjection פלסמיד לתוך עוברי דג הזברה. שיעורי מחושב של transgenesis מוצגים עבור תשעה עשר ימי הזרקה נפרדים. מספר הדגים מוקרן מייצג את מספר הדגים שנותרו בחיים 21 ימים לאחר ההזרקה, ואת מספר חיובי מייצג את מספר הדגים שהיו חיוביים עבור גידולים ניאון. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/55711/55711fig1.jpg" /> איור 1: צדדי האוכלוסייה Gating Scheme. דוגמה של ערכת gating השתמשו כדי לזהות את האוכלוסייה בצד GFP + T-ALL דג הזברה. ( א ) ראשית, פסולת אינו נכלל באמצעות פיזור קדימה (FSC) ופיזור צד באזור (SSC). (ב) הבא, תאים בודדים מבודדים באמצעות קיפוחם כפילויות באמצעות FSC ופרמטרים רוחב SSC. (ג) מאז גידול בדוגמא זו היה GFP +, כל תאי החיים חייבים להיות GFP + ושלילי לסמן תאים המתים יודיד Propidium. (ד) האוכלוסייה בצד ניתן לראות את האדום Hoechst לעומת פרופיל כחול Hoechst. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55711/55711fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/55711/55711fig2.jpg" /> איור 2: צד אוכלוסין נעלמים כאשר שטופלו מונעי Transporter ABC, Verapamil. גייטס עבור האוכלוסייה בצד מוצג. הפנלים העליונים להראות ארבע דגימות גידולים שונות. חשוב לציין כי לא כל הגידולים באותו אחוז האוכלוסייה בצד, ואת ca האוכלוסייה בצדn הוא שונה עבור כל גידול הנבדק. הפנלים התחתונים להראות דגימות גידולים אשר טופלו verapamil במהלך המכתים עם Hoechst 33,342 לחסום בזרימת צבע. בעוד אוכלוסיות הצד עשויות להיראות שונות עבור כל גידול, את ההשפעה של verapamil זהה: אוכלוסיית הצד נעלמת. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55711/55711fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of the Side Population in Myc-induced T-cell Acute Lymphoblastic Leukemia in Zebrafish at JoVE.com

Isolation of the Side Population in Myc-induced T-cell Acute Lymphoblastic Leukemia in Zebrafish

כאן, אנו מתארים טכניקה לבודד את האוכלוסייה תאים בצד מ מודל דג הזברה של myc- המושרה T- תאי לוקמיה לימפובלסטית חריפה (T-ALL). זה assay האוכלוסייה בצד רגיש מאוד מתואר דג הזברה T-ALL, אבל זה עשוי להיות ישים סוגים אחרים של תאים ממאירים ולא ממאיר דג הזברה.

בידוד של האוכלוסייה בצד Myc- המושרה T- תאי לוקמיה לימפובלסטית חריפה דג הזברה

Heterogeneous cell populations, from either healthy or malignant tissues, may contain a population of cells characterized by a differential ability to ...

isolation-side-population-myc-induced-t-cell-acute-lymphoblastic

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

6.5K Views.  The University of Chicago.  כאן, אנו מתארים טכניקה לבודד את האוכלוסייה תאים בצד מ מודל דג הזברה של myc- המושרה T- תאי לוקמיה לימפובלסטית חריפה (T-ALL). זה assay האוכלוסייה בצד רגיש מאוד מתואר דג הזברה T-ALL, אבל זה עשוי להיות ישים סוגים אחרים של תאים ממאירים ולא ממאיר דג הזברה. 

Video: Isolation of the Side Population in Myc-induced T-cell Acute Lymphoblastic Leukemia in Zebrafish

Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen presenting cells (APCs)1. This recognition leads to the activation of T-cells and a series of functional outcomes (e.g. cytokine production, killing of the target cells). Understanding the functional role of TCRs is critical to harness the power of the immune system to treat a variety of immunology related diseases (e.g. cancer or autoimmunity).
It is convenient to study TCRs in mouse models, which can be accomplished in several ways. Making TCR transgenic mouse models is costly and time-consuming and currently there are only a limited number of them available2-4. Alternatively, mice with antigen-specific T-cells can be generated by bone marrow chimera. This method also takes several weeks and requires expertise5. Retroviral transduction of TCRs into in vitro activated mouse T-cells is a quick and relatively easy method to obtain T-cells of desired peptide-MHC specificity. Antigen-specific T-cells can be generated in one week and used in any downstream applications. Studying transduced T-cells also has direct application to human immunotherapy, as adoptive transfer of human T-cells transduced with antigen-specific TCRs is an emerging strategy for cancer treatment6.
Here we present a protocol to retrovirally transduce TCRs into in vitro activated mouse T-cells. Both human and mouse TCR genes can be used. Retroviruses carrying specific TCR genes are generated and used to infect mouse T-cells activated with anti-CD3 and anti-CD28 antibodies. After in vitro expansion, transduced T-cells are analyzed by flow cytometry.

We present a protocol to produce antigen-specific mouse T-cells using retroviral transduction

התמרה retroviral של T-cell קולטנים עכבר מתאי T

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

Genotypic Inference of HIV-1 Tropism Using Population-based Sequencing of V3

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her viral population uses the CCR5 coreceptor for cellular entry, and not an alternative coreceptor. One approach to tropism testing is to examine the sequence of the V3 region of the HIV envelope, which interacts with the coreceptor.
Methods: Viral RNA is extracted from blood plasma. The V3 region is amplified in triplicate with nested reverse transcriptase-PCR. The amplifications are then sequenced and analyzed using the software, RE_Call. Sequences are then submitted to a bioinformatic algorithm such as geno2pheno to infer viral tropism from the V3 region. Sequences are inferred to be non-R5 if their geno2pheno false positive rate falls below 5.75%. If any one of the three sequences from a sample is inferred to be non-R5, the patient is unlikely to respond to a CCR5-antagonist.

HIV tropism can be inferred from the V3 region of the viral envelope. V3 is PCR amplified in triplicate using nested RT-PCR, sequenced, and interpreted using bioinformatic software. Samples with with 1 or more sequence(s) with low g2P scores are classified as non-R5 virus.

הסקה Genotypic של כמיהות HIV-1 שימוש אוכלוסייה מבוססת רצף של V3

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her ...

Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

Graft-versus-host disease (GVHD) is the limiting barrier to the broad use of bone marrow transplant as a curative therapy for a variety of hematological deficiencies. GVHD is caused by mature alloreactive T cells present in the bone marrow graft that are infused into the recipient and cause damage to host organs. However, in mice, T cells must be added to the bone marrow inoculum to cause GVHD. Although extensive work has been done to characterize T cell responses post transplant, bioluminescent imaging technology is a non-invasive method to monitor T cell trafficking patterns in vivo. 
Following lethal irradiation, recipient mice are transplanted with bone marrow cells and splenocytes from donor mice. T cell subsets from L2G85.B6 (transgenic mice that constitutively express luciferase) are included in the transplant. By only transplanting certain T cell subsets, one is able to track specific T cell subsets in vivo, and based on their location, develop hypotheses regarding the role of specific T cell subsets in promoting GVHD at various time points. At predetermined intervals post transplant, recipient mice are imaged using a Xenogen IVIS CCD camera. Light intensity can be quantified using Living Image software to generate a pseudo-color image based on photon intensity (red = high intensity, violet = low intensity). 
Between 4-7 days post transplant, recipient mice begin to show clinical signs of GVHD. Cooke et al.1 developed a scoring system to quantitate disease progression based on the recipient mice fur texture, skin integrity, activity, weight loss, and posture. Mice are scored daily, and euthanized when they become moribund. Recipient mice generally become moribund 20-30 days post transplant. 
Murine models are valuable tools for studying the immunology of GVHD. Selectively transplanting particular T cell subsets allows for careful identification of the roles each subset plays. Non-invasively tracking T cell responses in vivo adds another layer of value to murine GVHD models.

Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

Murine bone marrow transplantation is a widely used technique to study immunological mechanisms governing graft-versus-host disease in humans. The ability to monitor T cell trafficking patterns in vivo allows for detailed analysis of the development and perpetuation of T cell responses during graft-versus-host disease.

אינדוקציה של מחלת שתל נגד מארח ו<em&gt; In Vivo</em&gt; ניטור תא T תוך שימוש במודל Murine MHC התאמה

Graft-versus-host disease (GVHD) is the limiting barrier to the broad use of bone marrow transplant as a curative therapy for a variety of hematological ...

Real-time Live Imaging of T-cell Signaling Complex Formation

Protection against infectious diseases is mediated by the immune system 1,2. T lymphocytes are the master coordinators of the immune system, regulating the activation and responses of multiple immune cells 3,4. T-cell activation is dependent on the recognition of specific antigens displayed by antigen presenting cells (APCs). The T-cell antigen receptor (TCR) is specific to each T-cell clone and determines antigen specificity 5. The binding of the TCR to the antigen induces the phosphorylation of components of the TCR complex. In order to promote T-cell activation, this signal must be transduced from the membrane to the cytoplasm and the nucleus, initiating various crucial responses such as recruitment of signaling proteins to the TCR;APC site (the immune synapse), their molecular activation, cytoskeletal rearrangement, elevation of intracellular calcium concentration, and changes in gene expression 6,7. The correct initiation and termination of activating signals is crucial for appropriate T-cell responses. The activity of signaling proteins is dependent on the formation and termination of protein-protein interactions, post translational modifications such as protein phosphorylation, formation of protein complexes, protein ubiquitylation and the recruitment of proteins to various cellular sites 8. Understanding the inner workings of the T-cell activation process is crucial for both immunological research and clinical applications.
Various assays have been developed in order to investigate protein-protein interactions; however, biochemical assays, such as the widely used co-immunoprecipitation method, do not allow protein location to be discerned, thus precluding the observation of valuable insights into the dynamics of cellular mechanisms. Additionally, these bulk assays usually combine proteins from many different cells that might be at different stages of the investigated cellular process. This can have a detrimental effect on temporal resolution. The use of real-time imaging of live cells allows both the spatial tracking of proteins and the ability to temporally distinguish between signaling events, thus shedding light on the dynamics of the process 9,10. We present a method of real-time imaging of signaling-complex formation during T-cell activation. Primary T-cells or T-cell lines, such as Jurkat, are transfected with plasmids encoding for proteins of interest fused to monomeric fluorescent proteins, preventing non-physiological oligomerization 11. Live T cells are dropped over a coverslip pre-coated with T-cell activating antibody 8,9, which binds to the CD3/TCR complex, inducing T-cell activation while overcoming the need for specific activating antigens. Activated cells are constantly imaged with the use of confocal microscopy. Imaging data are analyzed to yield quantitative results, such as the colocalization coefficient of the signaling proteins.

We describe a live-cell imaging method that provides insight into protein dynamics during the T-cell activation process. We demonstrate the combined usage of the T-cell spreading assay, confocal microscopy and imaging analysis to yield quantitative results to follow signaling complex formation throughout T-cell activation.

הדמית חיה בזמן אמת של T-תא איתות גיבוש קומפלקס

Protection against infectious diseases is mediated by the immune system 1,2. T lymphocytes are the master coordinators of the immune system, regulating ...

Culturing Microglia from the Neonatal and Adult Central Nervous System

Microglia are the resident macrophage-like cells of the central nervous system (CNS) and, as such, have critically important roles in physiological and pathological processes such as CNS maturation in development, multiple sclerosis, and spinal cord injury. Microglia can be activated and recruited to action by neuronal injury or stimulation, such as axonal damage seen in MS or ischemic brain trauma resulting from stroke. These immunocompetent members of the CNS are also thought to have roles in synaptic plasticity under non-pathological conditions. We employ protocols for culturing microglia from the neonatal and adult tissues that are aimed to maximize the viable cell numbers while minimizing confounding variables, such as the presence of other CNS cell types and cell culture debris. We utilize large and easily discernable CNS components (e.g. cortex, spinal cord segments), which makes the entire process feasible and reproducible. The use of adult cells is a suitable alternative to the use of neonatal brain microglia, as many pathologies studied mainly affect the postnatal spinal cord. These culture systems are also useful for directly testing the effect of compounds that may either inhibit or promote microglial activation. Since microglial activation can shape the outcomes of disease in the adult CNS, there is a need for in vitro systems in which neonatal and adult microglia can be cultured and studied.

We outline methods for the efficient and quick isolation/culture of viable microglia from the neonatal cerebral cortex and adult spinal cord. The dissection and plating of cortical microglia can be accomplished within 90 minutes, with the subsequent microglial harvest taking place ~ 10 days following the initial dissection.

Microglia culturing ממערכת העצבים המרכזי וילודים למבוגרים

Microglia are the resident macrophage-like cells of the central nervous system (CNS) and, as such, have critically important roles in physiological and ...

The Use of Fluorescent Target Arrays for Assessment of T Cell Responses In vivo

The ability to monitor T cell responses in vivo is important for the development of our understanding of the immune response and the design of immunotherapies. Here we describe the use of fluorescent target array (FTA) technology, which utilizes vital dyes such as carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE), violet laser excitable dyes (CellTrace Violet: CTV) and red laser excitable dyes (Cell Proliferation Dye eFluor 670: CPD) to combinatorially label mouse lymphocytes into &#62;250 discernable fluorescent cell clusters. Cell clusters within these FTAs can be pulsed with major histocompatibility (MHC) class-I and MHC class-II binding peptides and thereby act as target cells for CD8+ and CD4+ T cells, respectively. These FTA cells remain viable and fully functional, and can therefore be administered into mice to allow assessment of CD8+ T cell-mediated killing of FTA target cells and CD4+ T cell-meditated help of FTA B cell target cells in real time in vivo by flow cytometry. Since &#62;250 target cells can be assessed at once, the technique allows the monitoring of T cell responses against several antigen epitopes at several concentrations and in multiple replicates. As such, the technique can measure T cell responses at both a quantitative (e.g.&#160;the cumulative magnitude of the response) and a qualitative (e.g.&#160;functional avidity and epitope-cross reactivity of the response) level. Herein, we describe how these FTAs are constructed and give an example of how they can be applied to assess T cell responses induced by a recombinant pox virus vaccine.

The Use of Fluorescent Target Arrays for Assessment of T Cell Responses In vivo

The ability to monitor T cell responses in detail in vivo is important for the development of our understanding of the immune response. Here we describe the use of fluorescent target arrays (FTAs) in an in vivo T cell assay that assesses &#62;250 parameters simultaneously by flow cytometry.

השימוש במערכי יעד פלורסנט להערכה של תגובות תא T<em&gt; בvivo</em

The ability to monitor T cell responses in vivo is important for the development of our understanding of the immune response and the design of ...

An Ex vivo Model of an Oligodendrocyte-directed T-Cell Attack in Acute Brain Slices

Death of oligodendrocytes accompanied by destruction of neurons and axons are typical histopathological findings in cortical and subcortical grey matter lesions in inflammatory demyelinating disorders like multiple sclerosis (MS). In these disorders, mainly CD8+ T-cells of putative specificity for myelin- and oligodendrocyte-related antigens are found, so that neuronal apoptosis in grey matter lesions may be a collateral effect of these cells. Different types of animal models are established to study the underlying mechanisms of the mentioned pathophysiological processes. However, although they mimic some aspects of MS, it is impossible to dissect the exact mechanism and time course of &#8216;&#8216;collateral&#8217;&#8217; neuronal cell death. To address this course, here we show a protocol to study the mechanisms and time response of neuronal damage following an oligodendrocyte-directed CD8+ T cell attack. To target only the myelin sheath and the oligodendrocytes, in vitro activated oligodendrocyte-specific CD8+ T-cells are transferred into acutely isolated brain slices. After a defined incubation period, myelin and neuronal damage can be analysed in different regions of interest. Potential applications and limitations of this model will be discussed.

An Ex vivo Model of an Oligodendrocyte-directed T-Cell Attack in Acute Brain Slices

To address mechanisms of demyelination and neuronal apoptosis in cortical lesions of inflammatory demyelinating disorders, different animal models are used. We here describe an ex vivo approach by using oligodendrocyte-specific CD8+ T-cells on brain slices, resulting in oligodendroglial and neuronal death. Potential applications and limitations of the model are discussed.

<em&gt; Ex vivo</em&gt; דגם של התקפת T-Cell-מכוון oligodendrocyte בפרוסות המוח חריף

Death of oligodendrocytes accompanied by destruction of neurons and axons are typical histopathological findings in cortical and subcortical grey matter ...

Mouse Na&#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Antigen inexperienced (na&#239;ve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition of cognate antigen presented on MHC class II. The cytokine signals present in the environment at the time of TCR activation are a major factor in determining the effector fate of a na&#239;ve CD4+ T cell. Although the cytokine environment during na&#239;ve T cell activation may be complex and involve both redundant and opposing signals in vivo, the addition of various cytokine combinations during naive CD4+ T cell activation in vitro can readily promote the establishment of effector T helper lineages with hallmark cytokine and transcription factor expression. Such differentiation experiments are commonly used as a first step for the evaluation of targets believed to promote or inhibit the development of certain CD4+ T helper subsets. The addition of mediators, such as signaling agonists, antagonists, or other cytokines, during the differentiation process can also be used to study the influence of a particular target on T cell differentiation. Here, we describe a basic protocol for the isolation of na&#239;ve T cells from mouse and the subsequent steps necessary for polarizing na&#239;ve cells to various T helper effector lineages in vitro.

Mouse Na&#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Na&#239;ve CD4+ T cells polarize to various subsets depending on the environment at the time of activation. The differentiation of na&#239;ve CD4+ T cells to various effector subsets can be achieved in vitro through the addition of T cell receptor stimuli and specific cytokine signals.

העכבר נאיבי CD4<sup&gt; +</supו&gt; בידוד תא T<em&gt; במבחנה</em&gt; בידול לתוך תת תא T

Antigen inexperienced (na&#239;ve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition ...

Imaging CD4 T Cell Interstitial Migration in the Inflamed Dermis

The ability of CD4 T cells to carry out effector functions is dependent upon the rapid and efficient migration of these cells in inflamed peripheral tissues through an as-yet undefined mechanism. The application of multiphoton microscopy to the study of the immune system provides a tool to measure the dynamics of immune responses within intact tissues. Here we present a protocol for non-invasive intravital multiphoton imaging of CD4 T cells in the inflamed mouse ear dermis. Use of a custom imaging platform and a venous catheter allows for the visualization of CD4 T cell dynamics in the dermal interstitium, with the ability to interrogate these cells in real-time via the addition of blocking antibodies to key molecular components involved in motility. This system provides advantages over both in vitro models and surgically invasive imaging procedures. Understanding the pathways used by CD4 T cells for motility may ultimately provide insight into the basic function of CD4 T cells as well as the pathogenesis of both autoimmune diseases and pathology from chronic infections.

The mechanisms that govern the interstitial motility of CD4 effector T cells at sites of inflammation are relatively unknown. We present a non-invasive approach to visualize and manipulate in vitro-primed CD4 T cells in the inflamed ear dermis, allowing for study of the dynamic behavior of these cells in situ.

הדמית תא CD4 T גירת ביניים בדרמיס המוסת

The ability of CD4 T cells to carry out effector functions is dependent upon the rapid and efficient migration of these cells in inflamed peripheral ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of inflammation. They are key players in the innate immune system and play major roles in cancer biology. Neutrophils have been proposed as key mediators of malignant transformation, tumor progression, angiogenesis and in the modulation of the antitumor immunity; through their release of soluble factors or their interaction with tumor cells. To characterize the specific functions of neutrophils, a fast and reliable method is coveted for in vitro isolation of neutrophils from human blood. Here, a density gradient separation method is demonstrated to isolate neutrophils as well as mononuclear cells from the blood. The procedure consists of layering the density gradient solution such as Ficoll carefully above the diluted blood obtained from patients diagnosed with chronic lymphocytic leukemia (CLL), followed by centrifugation, isolation of mononuclear layer, separation of neutrophils from RBCsby dextran then lysis of residual erythrocytes. This method has been shown to isolate neutrophils &#8805; 90 % pure. To mimic the tumor microenvironment, 3-dimensional (3D) experiments were performed using basement membrane matrix such as Matrigel. Given the short half-life of neutrophils in vitro, 3D experiments with fresh human neutrophils cannot be performed. For this reason promyelocytic HL60 cells are differentiated along the granulocytic pathway using the differentiation inducers dimethyl sulfoxide (DMSO) and retinoic acid (RA). The aim of our experiments is to study the role of neutrophils on the sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents. However these methods can be generalized to study the interactions of neutrophils or neutrophil-like cells with a large range of cell types in different situations.

Neutrophils are the most abundant type of white blood cells. The isolation of neutrophils from human blood by density gradient separation method and the differentiation of human promyelocytic (HL60) cells along the granulocytic pathway are described here; to test their role on sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents.